CN107937338A - 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents
一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107937338A CN107937338A CN201711241989.5A CN201711241989A CN107937338A CN 107937338 A CN107937338 A CN 107937338A CN 201711241989 A CN201711241989 A CN 201711241989A CN 107937338 A CN107937338 A CN 107937338A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- cell
- nutrient solution
- mesodermal
- mescenchymal stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 126
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 claims description 11
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N CHIR-98014 Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(N)=NC(NCCNC=2N=C(C(=CN=2)N2C=NC=C2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=C1 MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SCQDMKUZHIGAIB-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1h-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl]amino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile;hydrochloride Chemical compound Cl.N1C(C)=CN=C1C(C(=N1)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=CN=C1NCCNC1=CC=C(C#N)C=N1 SCQDMKUZHIGAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HRJWTAWVFDCTGO-UHFFFAOYSA-N LY-2090314 Chemical compound C1CN(C=23)C=C(C=4C(NC(=O)C=4C=4N5C=CC=CC5=NC=4)=O)C3=CC(F)=CC=2CN1C(=O)N1CCCCC1 HRJWTAWVFDCTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 4
- JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-3-indolyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BLTVBQXJFVRPFK-UHFFFAOYSA-N AZD1080 Chemical compound OC=1NC2=CC=C(C#N)C=C2C=1C(N=C1)=CC=C1CN1CCOCC1 BLTVBQXJFVRPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N [(E)-[2-(6-bromo-2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino] acetate Chemical compound CC(=O)O\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2cc(Br)ccc12 HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 claims description 2
- DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N n-benzyl-2-(pyrimidin-4-ylamino)-1,3-thiazole-4-carboxamide Chemical compound C=1SC(NC=2N=CN=CC=2)=NC=1C(=O)NCC1=CC=CC=C1 DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 abstract description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 7
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 6
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 6
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 6
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 6
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 6
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 6
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 6
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 5
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- TZSMWSKOPZEMAJ-UHFFFAOYSA-N bis[(2-methoxyphenyl)methyl] carbonate Chemical compound COC1=CC=CC=C1COC(=O)OCC1=CC=CC=C1OC TZSMWSKOPZEMAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 2
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000712663 Homo sapiens Transforming growth factor beta-3 proprotein Proteins 0.000 description 1
- 240000000233 Melia azedarach Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009171 T-cell vaccination Methods 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 102000053431 human TGFB3 Human genes 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical class [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其诱导分化方法，其是体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；将细胞制备成单细胞或细胞团块悬液，接种于包被基质胶的培养皿上，使用多能干细胞培养液进行培养；细胞贴壁后在培养液中添加GSK‑3通路抑制剂组合；生长2～10天后，得到中胚层祖细胞群体；使用间充质干细胞培养液持续传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得。本发明解决成人来源间充质干细胞及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的间充质干细胞异质性与混杂的缺点，获得的中胚层谱系间充质干细胞具有更强的增殖与免疫调节能力；标准化诱导分化程序可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。
Description
技术领域
本发明属于生物与医学领域，更具体地，本发明涉及一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法，包括使用特殊的培养条件和选择技术。本发明还涉及利用这群中胚层谱系间充质干细胞的治疗方法或其临床应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)属于成体干细胞的一种，是在成人体内许多组织如骨髓、脐带血、脂肪和外周血等中都存在的一大类多能细胞，在正常时处于静止状态，当所在的组织或器官受到损伤时，他们可以迅速进入增殖状态并保持极大的增殖潜力，并分化为不同的细胞类型以修复受损组织。最先发现的一类MSCs是骨髓间充质干细胞(Friedenstein A J,J Embryol Exp Morphol,1966)，其能在不同的诱导条件下向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、造血支持细胞等方向分化，具有典型的干细胞特点。
由于MSCs具有易于分离扩增及具有多向分化潜能等优点，最早被认为是组织工程理想的种子细胞而成为研究热点。随后发现MSCs具有强大的免疫调节能力，更进一步推动了MSCs相关的研究，使其成为最有希望实现临床化的明星细胞之一。但MSCs难以规模化扩增及异质性是目前限制MSCs临床化应用的两大障碍(Banfi et al.,2000)。
鉴于MSCs广泛的来源及异质性，为了规范MSCs相关的实验与临床治疗研究，国际间充质干细胞治疗委员会ISCT于2006年提出鉴定MSCs的三个标准：(1)细胞可以粘附于塑料培养器皿；(2)细胞表达特定的表面抗原，其中CD44，CD73，CD90，STRO-1和CD105/SH2阳性率>95％，CD11,CD14,CD34和CD45阳性率<2％；(3)细胞的多向分化潜能，即可以分化为软骨细胞、骨细胞及脂肪细胞等(Dominici et al.,2006)。
但即使培养中的细胞完全符合ISCT所提出的三个标准，MSCs功能上的差异也相当明显，直接导致MSCs表现出增殖能力、分化能力等各方面的差异(Razzouk&Schoor,2012)。在ClinicalTrials上登记的MSC临床研究中很大比例都因结果不稳定而不得不中止研究宣告失败，导致这种差异性结果及临床效果不佳的主要原因是MSCs为异质性细胞群体，不同个体、不同组织来源、甚至同一组织提取到的MSCs都为包含多种亚型的异质性群体，不同亚型的MSCs亚型功能各异。Anokhina通过将MSCs体外扩增50代，比较MSCs的异质性，发现随着传代次数的增加，MSCs的异质性有所下降，不同个体MSCs表达相同的表面标志，说明体外扩增可以选择性地筛选MSCs亚群，但是MSCs的分化功能则产生了较大的差异(Anokhina&Buravkova,2007)。这些研究结果表明长期或大量体外扩增加于MSCs群体上的选择压力将极大地影响MSCs种群的构成、分化性能及治疗功效，导致不同甚至相反的结果(Phinney,2012)。即使MSCs的表面表型没有可检测到的变化，MSCs在持续传代过程中也会丢失其多能性，或特异性地筛选出性能不佳的亚型(Banfi et al.,2000)。因此，区分不同亚群MSCs，进而筛选出在相关应用中起关键作用的MSCs亚群，消除其异质性的影响是目前将MSCs临床应用的关键技术之一。
为解决MSCs的来源与扩增的问题，不少研究致力于将ES及iPS诱导分化为MSCs。据文献报道，2004年Chunhui Xu最早通过转染human telomerase reverse transcriptase(hTERT)基因至分化中的hESCs诱导ESC向HEF方向分化，得到的细胞有成骨分化的能力。但其未进行MSC的详细鉴定。随后Tiziano Barberi通过与mouse OP9cell line共培养40d，在添加了20％FBS的alpha MEM培养液中诱导ESC向MSC分化，流式分选CD73+细胞，被视为是第一个诱导多能干细胞向MSC分化的报道(Barberi,Willis,Socci,&Studer,2005)。
05年通过OP9细胞共培养得到MSC的课题组，08年报道了非共培养的诱导：人ESCs(H1、H7、及H9细胞株)培养于包被了Matrigel的孔板中，为了诱导其向MSC分化，增加换液周期为3-5d。9-10d后，40％-50％的细胞表现出成纤维样形态，机械去除ESC细胞，胶原酶消化分化的细胞并接入Matrigel包被的新皿中。成纤维细胞进一步增加，第二次刮去未分化细胞，胰酶消化并接入明胶包被的皿中，在加了10％FBS的aMEM中培养，约4-6周的时间可以完成诱导(Trivedi&Hematti,2008)。
Lian 2007年报道了一种临床级的ES来源MSC，其通过胰酶消化ESC，以含bFGF及PDGF的KSR培养基在明胶包被的培养皿中培养，长满后胰酶消化传代，一周后以CD105+与CD24-分选得到MSC细胞(Lian et al.,2007)。
已有专利也记载了从iPS分化为间质细胞的方法，如美国杰龙公司(专利申请公布号CN101696397A)、国内付清玲(专利申请公布号CN105754936A)等都描述了一种从多能干细胞分化为间质细胞的方法。
但是，这些文献或专利报道的方法得到的细胞未控制分化路径，只着重于解决MSCs的来源问题，未针对细胞的异质性提供相应的解决方案，因此诱导所得的细胞可能比骨髓来源的间充质更为异质；同时，这些方案未将细胞的功能作为重点考察对象，而治疗效果不佳的产品必定会极大地限制其应用。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其诱导方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导方法，包括以下步骤：
(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；
(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成单细胞或多细胞团块；
(3)将单细胞或多细胞团块接种于包被基质胶的培养皿上，使用多能干细胞培养液进行培养；
(4)生长0.5～5天后，在培养液中添加GSK-3通路抑制剂组合；
(5)生长2～10天后，得到中胚层祖细胞群体；将培养液更换为间充质干细胞培养液，持续培养至细胞汇合；
(6)解离收集细胞并将收集的细胞接种入新的培养皿中，使用间充质干细胞培养液持续传代培养2～6次后检测间充质干细胞的细胞表型，即得来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞群。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的单细胞或多细胞团块的接种数目为2×102至2×106/cm2。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述基质胶为Matrigel或层粘连蛋白。
在其中一些实施例中，步骤(3)中还添加有ROCK通路抑制剂，以促进细胞存活率；所述ROCK通路抑制剂为Y27632或Thiazovivin。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述GSK-3通路抑制剂组合包括CHIR-99021、CHIR-99021HCl、CHIR-98014、LY2090314、BIO-acetoxime、SB216763、和AZD1080中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述GSK-3通路抑制剂组合包括CHIR-99021、CHIR-99021HCl、CHIR-98014、和LY2090314中的一种或几种。
在其中一些实施例中，步骤(5)中所述中胚层祖细胞群体的Brachyury阳性细胞比例高于80％。
在其中一些实施例中，步骤(5)中所述中胚层祖细胞群体的Brachyury阳性细胞比例高于90％。
在其中一些实施例中，步骤(5)所述间充质干细胞培养液为添加了5％至20％血清的DMEM完全培养液或商业化的无血清完全培养液。
本发明还提供了上述诱导分化方法诱导分化而得的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞。
本发明针对现有技术诱导得到的间充质干细胞的缺陷，提供了一种优化的间充质干细胞亚群，用以增强细胞的细胞学或治疗功能。本发明同时提供间充质干细胞亚群细胞的获取方法。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过先将多能干细胞诱导为中胚层祖细胞，再进一步诱导为间充质干细胞，可解决成人来源间充质干细胞及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的间充质干细胞异质性与混杂的缺点，可解决间充质干细胞来源受限的问题，获得的中胚层谱系间充质干细胞具有更强的增殖与免疫调节能力；
(2)本发明通过标准化诱导分化程序，可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。
附图说明
图1为实施例1培养的iPS细胞的多能性标记免疫荧光照片；
图2为实施例1中iPS细胞在GSK-3通路抑制剂中处理3d后的细胞形态图(A)及中胚层标志Brachyury免疫荧光图片(B、C、D)；
图3为实施例1中中胚层祖细胞在间充质培养液中传代4次后的细胞形态图(A)及细胞表面标记流式分析图(B、C、D、E、F)；
图4为实施例1诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞(iM-MSC)与骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖能力的比较，连续传代培养60天，每次传代计数细胞增殖的总量并作图；
图5是本发明试验例1获得的中胚层间谱系间充质干细胞成骨茜素红、成脂油红O、成软骨阿利新蓝染色图；
图6是实施例2诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞形态图；
图7是本发明试验例2中胚层谱系间充质干细胞对T细胞炎症因子IFN-γ分泌的抑制作用流式分析图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的细胞生物学、生物化学、分子生物学等各个领域的常规技术。
实施例1iPS(诱导多能干细胞)向中胚层间充质干细胞的诱导
包括以下步骤：
一、iPS细胞的培养
iPS细胞可以方便地通过商业化或实验室构建获得。本发明着重阐述在稳定建立的多能干细胞系基础上的进一步培养与分化操作。iPS细胞可在无饲养层的条件下大规模扩增且保持未分化状态。培养液可选用STEMCELL公司的mTeSR系列产品、E8等，与上述几种培养液相适应的，需要在培养基质上包被胞外基质，如Matrigel或层粘连蛋白。保证高质量的iPS细胞是进行下一步诱导的关键。
基于mTeSR1与Matrigel培养体系，具体的培养操作如下：
1培养皿的包被：冰上融解Matrigel，DMEM/F12稀释Matrigel至1:20至1:200，加入孔板中室温包被1h以上备用。
2从液氮中取出冻存管，于37℃水浴中快速解冻iPS细胞，转移入已加有5mlmTeSR1完全培养液的15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
3吸去包被的Matrigel，以2ml mTeSR1重悬细胞，均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
4每天更换培养液，彻底吸去旧的培养液，加入新鲜的预热好的培养液，继续培养，直至细胞克隆长至适合传代的大小。
5细胞传代前，使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37℃孵育1至10min，镜下观察，使细胞解离成小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻软打细胞，保证细胞维持小团块状；
6转移细胞团块入15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
7以mTeSR1重悬细胞，以1：6或其他合适的比例均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
8持续传代以获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
图1为本实施例中培养的iPS细胞的多能性标记免疫荧光照片；可见细胞表达多能性干细胞标志性的转录因子Nanog、OCT4及Sox2和表面分子TRA-1-60、SSEA4及TRA-1-81。
二、中胚层祖细胞的诱导
1使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37℃孵育1至10min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻软打细胞，使细胞分散均匀。
2转移细胞入15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
3以E8完全培养液重悬细胞团，以1×104/cm2的密度均匀地将细胞接种入包被好Matrigel的孔板或培养皿中。放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
4培养第二天，在培养液中添加终浓度为10μM的GSK-3通路抑制剂CHIR99021。
5静置培养2至5d，期间每天换液一次。得到的贴壁中的细胞可进行下一步的诱导或中胚层标记物的检测。
图2为本实施例中iPS细胞在GSK-3通路抑制剂中处理3d后的细胞形态图(A)及中胚层标志Brachyury免疫荧光图片(B、C、D)。GSK-3通路抑制剂中处理3d后，细胞开始向纤维样转变，多触角；表达中胚导标志性转录因子Brachyury的阳性细胞比例接近100％，说明多能干细胞经过诱导已经转变为中胚层祖细胞。
三、中胚层祖细胞向间充质干细胞的诱导分化
1中胚层祖细胞于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
2第二天，更换中胚层细胞培养液为间充质干细胞培养液(LDMEM+10％胎牛血清)，于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，每2～3d换液。
3细胞生长至80～90％融合后，以胰酶消化传代，接种入普通的组织培养处理过的细胞培养皿；同时取一部分细胞检测CD44、CD73、CD90、CD34、CD45等细胞表面分子表达情况。
4重复步骤3，直至表达CD44、CD73、CD90的细胞达到95％以上；表达CD34、CD45的细胞少于5％，即得中胚层谱系间充质干细胞。
图3为本实施例中中胚层谱系细胞在间充质培养液中传代4次后的细胞形态图(A)及细胞表面标记流式分析图(B、C、D、E、F)；诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞表现出典型的纤维样；表达间充质干细胞的表面标志CD44、CD73、CD90，不表达造血干细胞的标志CD34、CD45。
图4为本实施例诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞(iM-MSC)连续传代培养60天，每次传代计数细胞增殖的总量并作图，对比同样操作的骨髓间充质干细胞(BMSC)，数据显示诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞具有更强的增殖能力。
实施例2H1ES胚胎干细胞向中胚层间充质干细胞的诱导
包括以下步骤：
一、H1ES细胞的培养
H1ES细胞可以方便地通过商业化购买获得。本发明着重阐述在稳定培养H1ES细胞系基础上的进一步培养与分化操作。
H1ES细胞可在无饲养层的条件下大规模扩增且保持未分化状态。培养液可选用STEMCELL公司的mTeSR系列产品、E8等，与上述几种培养液相适应的，需要在培养基质上包被胞外基质，如Matrigel或层粘连蛋白。保证高质量的多能干细胞是进行下一步诱导的关键。
基于mTeSR1与Matrigel培养体系，具体的培养操作如下：
1培养皿的包被：冰上融解Matrigel，DMEM/F12稀释Matrigel至1:20至1:200，加入孔板中室温包被1h以上备用。
2从液氮中取出冻存管，于37℃水浴中快速解冻H1ES细胞，转移入已加有5mlmTeSR1完全培养液的15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
3吸去包被的Matrigel，以2ml mTeSR1重悬细胞，均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
4每天更换培养液，彻底吸去旧的培养液，加入新鲜的预热好的培养液，继续培养，直至细胞克隆长至适合传代的大小。
5细胞传代前，使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37℃孵育1至10min，镜下观察，使细胞解离成小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻软打细胞，保证细胞维持小团块状；
6转移细胞团块入15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
7以mTeSR1重悬细胞，以1比6或其他合适的比例均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
8持续传代以获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
二、中胚层祖细胞的诱导
1使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37℃孵育1至10min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻软打细胞，使细胞分散均匀。
2转移细胞入15ml离心管中，250g离心5min收集细胞。
3以E8完全培养液重悬细胞团，以5×104/cm2的密度均匀地将细胞接种入包被好Matrigel的孔板或培养皿中。放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
4培养第二天，在培养液中添加终浓度为10μM的GSK-3通路抑制剂CHIR-98014。
5静置培养2至5d，期间每天换液一次。
三、中胚层祖细胞向间充质干细胞的诱导分化
1中胚层祖细胞于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
2第二天，更换中胚层细胞培养液为间充质干细胞培养液(STEMCELL公司无血清间充质干细胞完全培养液)，于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，每2～3d换液。
3细胞生长至80～90％融合后，以胰酶消化传代，接种入普通的组织培养处理过的细胞培养皿；同时取一部分细胞检测CD44、CD73、CD90、CD34、CD45等细胞表面分子表达情况。
4重复步骤3，直至表达CD44、CD73、CD90的细胞达到95％以上；表达CD34、CD45的细胞少于5％，即得中胚层谱系间充质干细胞。
图6是本实施例诱导得到的中胚层谱系间充质干细胞形态图。分别是4倍、10倍及20倍物镜下的细胞形态图，显示细胞呈现典型的纤维样。
试验例1中胚层谱系间充质干细胞的成骨成脂成软骨诱导分化
1成骨分化：中胚层谱系间充质干细胞生长至80～90％融合后，将培养液换为成骨诱导分化培养液(L-DMEM+10％FBS+10mMβ-glycerophosphate+50μg/ml维生素C及100nM的地塞米松)。每3d换液一次，诱导培养14d后进行茜素红染色分析。
2成脂分化：中胚层谱系间充质干细胞生长至80～90％融合后，将培养液换为成脂诱导分化培养液(H-DMEM+10％FBS+100nM Indo+0.5mM IBMX及1mM的地塞米松)。每3d换液一次，诱导培养21d后进行油红O染色分析。
3成软骨分化：消化收集中胚层谱系间充质干细胞，以2.5×105/15ml离心管的细胞量分接入15ml离心管中，200×g离心5min，弃上清，加入1ml软骨分化诱导培养液(H-DMEM+10ng/ml重组人转化生长因子(recombinant human transforming growth factor-β3,TGF-β3)，100nM地塞米松，50μg/ml维生素C，1mM丙酮酸钠，40μg/ml脯氨酸及ITS+premix)。每3d换液一次，诱导培养21d后进行阿利新蓝染色分析。
图5为本试验例获得的中胚层间谱系充质干细胞成骨茜素红、成脂油红O、成软骨阿利新蓝染色图。茜素红染色显示获得的中胚层间谱系充质干细胞成骨诱导分化后可产生明显的钙沉积；油红O染色显示细胞向脂肪分化诱导后产生了明显的脂滴；阿利新蓝着色说明细胞在软骨分化诱导后分泌产生大量软骨特异的糖胺聚糖。
试验例2中胚层谱系间充质干细胞对T细胞炎症因子IFN-γ分泌的抑制作用检测
1MSCs培养液重悬MSCs，以4×104/cm2的密度接种入孔板中。
2以1640+10％FBS培养液重悬CD3+T细胞。
3以1比5的比例将T细胞接种入培养了MSCs的孔中，于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养3d。
4 3d后，加入刺激剂处理6h。
5 6h后，转移悬浮的T细胞入15ml离心管，500g离心10min收集细胞。
6以100μl PBS重悬细胞，再加入100μl 4％的PFA室温固定细胞20min。
7PBS洗涤固定好的细胞后加入皂苷穿透，同时加入IFN-γ抗体室温孵育15min。
8PBS洗涤标记好的抗体，最后以PBS重悬细胞进行流式检测。
图7是本试验例中胚层谱系间充质干细胞对T细胞炎症因子IFN-γ分泌的抑制作用流式分析图，显示中胚层谱系间充质干细胞(iM-MSC)较骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)具有更强的炎症因子抑制作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；
(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成单细胞或多细胞团块；
(3)将单细胞或多细胞团块接种于包被基质胶的培养皿上，使用多能干细胞培养液进行培养；
(4)生长0.5～5天后，在培养液中添加GSK-3通路抑制剂组合；
(5)生长2～10天后，得到中胚层祖细胞群体；将培养液更换为间充质干细胞培养液，持续培养至细胞汇合；
(6)解离收集细胞并将收集的细胞接种入新的培养皿中，使用间充质干细胞培养液持续传代培养2～6次后检测间充质干细胞的细胞表型，即得来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞群。
2.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)所述的单细胞或多细胞团块的接种数目为2×102至2×106/cm2。
3.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)中所述基质胶为Matrigel或层粘连蛋白。
4.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)中还添加有ROCK通路抑制剂；所述ROCK通路抑制剂为Y27632或Thiazovivin。
5.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(4)中所述GSK-3通路抑制剂组合包括CHIR-99021、CHIR-99021HCl、CHIR-98014、LY2090314、BIO-acetoxime、SB216763、和AZD1080中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(4)中所述GSK-3通路抑制剂组合包括CHIR-99021、CHIR-99021HCl、CHIR-98014、和LY2090314中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(5)中所述中胚层祖细胞群体的Brachyury阳性细胞比例高于80％。
8.根据权利要求7所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(5)中所述中胚层祖细胞群体的Brachyury阳性细胞比例高于90％。
9.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(5)所述间充质干细胞培养液为添加了5％至20％血清的DMEM完全培养液或商业化的无血清完全培养液。
10.由权利要求1～9任一项所述的诱导分化方法诱导分化而得的来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711241989.5A CN107937338B (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711241989.5A CN107937338B (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107937338A true CN107937338A (zh) | 2018-04-20 |
| CN107937338B CN107937338B (zh) | 2021-08-03 |
Family
ID=61948106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711241989.5A Active CN107937338B (zh) | 2017-11-30 | 2017-11-30 | 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107937338B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592007A (zh) * | 2019-09-19 | 2019-12-20 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN110628712A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 南京市妇幼保健院 | 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 |
| CN110819587A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-21 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种间充质干细胞无支架三维凝胶干性鉴定方法 |
| CN110872574A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-03-10 | 山西大学 | 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 |
| CN111394302A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-07-10 | 中山大学 | 人睾丸间质干细胞的分离与培养方法 |
| CN114891737A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-12 | 中山大学 | 一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用 |
| CN115011553A (zh) * | 2022-04-22 | 2022-09-06 | 中山大学 | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 |
| CN115029314A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-09-09 | 北京呈诺医学科技有限公司 | Cd34+细胞分化培养基、方法及应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101641436A (zh) * | 2007-01-30 | 2010-02-03 | 佐治亚大学研究基金会 | 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群 |
| WO2011025179A2 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method of inducing the differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal stem cells |
| CN104293730A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-01-21 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法 |
| WO2016168890A1 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Genea Ip Holdings Pty Ltd | Generation of muscle-lineage cells from stem cells |
| JP2017023019A (ja) * | 2015-07-17 | 2017-02-02 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 |
| WO2017044810A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Regeneration of a functional pulmonary vascular bed |
-
2017
- 2017-11-30 CN CN201711241989.5A patent/CN107937338B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101641436A (zh) * | 2007-01-30 | 2010-02-03 | 佐治亚大学研究基金会 | 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群 |
| CN103627671A (zh) * | 2007-01-30 | 2014-03-12 | 佐治亚大学研究基金会 | 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途 |
| WO2011025179A2 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method of inducing the differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal stem cells |
| CN104293730A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-01-21 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法 |
| WO2016168890A1 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Genea Ip Holdings Pty Ltd | Generation of muscle-lineage cells from stem cells |
| JP2017023019A (ja) * | 2015-07-17 | 2017-02-02 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 |
| WO2017044810A1 (en) * | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Regeneration of a functional pulmonary vascular bed |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MAKOTO FUKUTA等: "Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media", 《PLOS ONE》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592007A (zh) * | 2019-09-19 | 2019-12-20 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN110628712A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-31 | 南京市妇幼保健院 | 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 |
| CN110628712B (zh) * | 2019-09-27 | 2023-11-24 | 南京市妇幼保健院 | 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 |
| CN110872574A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-03-10 | 山西大学 | 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 |
| CN110872574B (zh) * | 2019-11-06 | 2023-03-07 | 山西大学 | 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 |
| CN110819587A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-21 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种间充质干细胞无支架三维凝胶干性鉴定方法 |
| CN111394302A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-07-10 | 中山大学 | 人睾丸间质干细胞的分离与培养方法 |
| CN115011553A (zh) * | 2022-04-22 | 2022-09-06 | 中山大学 | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 |
| CN114891737A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-12 | 中山大学 | 一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用 |
| CN114891737B (zh) * | 2022-04-25 | 2023-05-12 | 中山大学 | 一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用 |
| CN115029314A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-09-09 | 北京呈诺医学科技有限公司 | Cd34+细胞分化培养基、方法及应用 |
| CN115029314B (zh) * | 2022-06-06 | 2023-09-08 | 北京呈诺医学科技有限公司 | Cd34+细胞分化培养基、方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107937338B (zh) | 2021-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107937338A (zh) | 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法 | |
| Chong et al. | Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells | |
| Pisciotta et al. | Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations | |
| Sensebé et al. | Good manufacturing practices production of mesenchymal stem/stromal cells | |
| Salehinejad et al. | Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton’s jelly | |
| Zhu et al. | Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates | |
| Jung et al. | Identification of growth and attachment factors for the serum-free isolation and expansion of human mesenchymal stromal cells | |
| Trivedi et al. | Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells | |
| Huang et al. | Plasticity of stem cells derived from adult periodontal ligament | |
| CN107858328A (zh) | 一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法 | |
| Ma et al. | Bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into type II alveolar epithelial cells in vitro | |
| Hoffmann et al. | Comparison of in vitro‐cultivation of human mesenchymal stroma/stem cells derived from bone marrow and umbilical cord | |
| Gadkari et al. | Human embryonic stem cell derived-mesenchymal stem cells: an alternative mesenchymal stem cell source for regenerative medicine therapy | |
| Watson et al. | Comparison of markers and functional attributes of human adipose-derived stem cells and dedifferentiated adipocyte cells from subcutaneous fat of an obese diabetic donor | |
| Petrini et al. | Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow | |
| CN103966159B (zh) | 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法 | |
| Dergilev et al. | Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs | |
| Kanafi et al. | Phenotypic and functional comparison of optimum culture conditions for upscaling of dental pulp stem cells | |
| CN106520687A (zh) | 一种诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的方法 | |
| CN115011553B (zh) | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 | |
| Olivier et al. | Differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal stem cells by the “raclure” method | |
| Hanga et al. | Expansion of bone marrow‐derived human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) using a two‐phase liquid/liquid system | |
| CN108570448A (zh) | 一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法 | |
| Hosseini et al. | Differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into neurons in alginate scaffold | |
| Cui et al. | Biological Characterization and Pluripotent Identification of Sheep Dermis‐Derived Mesenchymal Stem/Progenitor Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |