CN110872574A - 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物医药技术领域，提供一种hESC‑MSC的制备方法。第一步改变支持/包被材料，第二步改变培养液体系；胚胎干细胞hESCs采用基于机械划块铺板的方法开始分化过程。不仅让hESC逐渐进入到分化模式，而且在分化过程中保持较高的成活率，以达到更好的分化效率。同时通过对传代方式的调整，先划块法后消化法，利用hESC和MSC的生长特性进行筛选，操作简便、效果明显。所获得的hESC‑MSC可抑制CD4+T‑cell增殖和促进CD4+Foxp3+（Treg）的增加。与脐带MSCs相当或者更强的免疫调节能力。有强大的增殖能力。在短时间内便可达到简便、高效的分化效果，衍生细胞具有典型的MSC细胞学特性。

Description

一种高效可靠的hESC-MSC制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高效可靠的hESC-MSC制备方法，尤其涉及一种高纯度、高分化潜能的胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）可从成体分离，广泛存在于成体动物的多种器官组织中，在特定条件下可以按特定程序分化形成多种功能细胞，如成骨细胞、成软骨细胞以及脂肪细胞，从而使相应的组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。它最早于1968年由Friedenstein在骨髓中发现，为一种成纤维状的贴壁细胞，并且在体内和体外都具有分化为成骨、成软骨和脂肪细胞的能力。1991年Caplan将这一类具有共同特征但不同组织来源的细胞统一命名为间充质干细胞。目前已知几乎所有成人和新生儿组织，包括骨髓、脂肪组织、牙髓、胎盘、羊水和脐带等中均可分离出这种形态特征相似且分化能力不尽相同的细胞。2006年国际细胞治疗学会（ISCT）提出的人类间充质干细胞（hMSC）最低鉴定标准一直沿用至今：MSC在体外培养条件下必须贴壁，超过95%的MSC必须表达表面抗原CD105、CD73和CD90，并且缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19和HLA-DR，同时该细胞可体外诱导分化为成骨、成脂和成软骨细胞。
MSC及其分泌因子在多项临床试验或研究中已表现出了一定的疗效，其中包括心肌梗塞、肌萎缩侧索硬化、中风、难治性创伤、糖尿病、克罗恩氏病和多发性硬化症等等。以“mesenchymal stem cell”作为关键词在Clinical trials.Gov网站进行检索，可得到近千项相关临床研究，但其中进行到III期临床试验的只有55项。尽管通过这些临床试验已经证实，MSC的体内注射是安全的，但众多临床试验也表明了组织来源的MSC在治疗中的不稳定性。Galipeau J通过对一项失败的三期临床试验进行分析指出，细胞异质性和有限的体外扩增是导致骨髓间充质干细胞体内疗效丧失的关键原因。
人胚胎干细胞（Human embryonic stem cell, hESC）具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一类亚全能干细胞；无论在体外还是体内环境中，该细胞都能被诱导分化为内、中、外三个胚层几乎所有的细胞类型。但是，hESC不可以直接应用于细胞治疗，因为这种亚全能性干细胞经过快速生长和不受控制的自发分化会导致畸胎瘤的产生，因此该类细胞需进行谱系定型分化成下游功能细胞方可用于移植。国内外许多研究小组已证实从hESC获得MSC或类MSC细胞是可行的，从有饲养层诱导分化到无饲养层诱导，再到小分子化合物诱导，方法是多种多样的，并且在不断的发展和更新, 迄今所报道的方法可概括如下。
一、滋养层（Feeder）分化方案是最早提出的hESC-MSC诱导方案。2005年，由Barberi, et al等首次发现hESC与小鼠骨髓基质细胞的OP9细胞共培养，所得细胞通过流式分选出CD73+的细胞群，再将该群细胞在含有胎牛血清的α-MEM培养基中连续培养1-2周，即可获得具有成纤维形态和免疫表型的细胞。2007年由Trivedi et al等重复证实该方案是可行的。但是这种方案分化效率低，CD73+细胞群仅有5%左右；分化后的细胞不能保证100%去除未分化的hESC，从而带来致瘤性的风险；同时，以含有外源遗传物质的小鼠细胞作为滋养层，会增加异种病原体感染的风险，且无法满足临床实验的要求。
二、无滋养层（Feeder-free）分化方案：为避免滋养层细胞对所分化细胞可能的污染，同时也为了进一步的临床研究，后续发展出的无滋养层诱导成为了主要的诱导分化策略。
1、单细胞分化与流式分选纯化法：Barberi T等将消化为单细胞悬液的hESC在明胶包被后的培养皿中，用无血清DMEM/F12培养基进行培养扩增，20天后改为α-MEM+10%FBS培养液再培养2周，所得细胞经流式细胞仪分选出CD73+细胞群后，即完成分化程序。该分化细胞移植在免疫缺陷鼠的胫骨前肌后没有形成畸胎瘤且仍具有活性，表明通过流式分选较完全地去除了未分化细胞。但是该群中CD105+细胞群仅占58%，表明分化效率仍然较低。Olivier等则从已有分化迹象的hESC集落中人工挑选出自发分化的细胞，进行体外传代培养，形成表皮样细胞后，经多次传代培养后可获得MSC，该细胞表达CD44、CD73、CD105、CD166，且具有成脂和成骨的分化能力。但是这种方法存在手工挑选缺乏客观标准等问题，以及分化时间长，效率低、不经济、纯度低的缺点。
2、拟胚体（Embryoid body, EB）分化法：拟胚体是由hESC细胞悬浮自发分化形成包含内，中，外三胚层的细胞聚合球体。该分化方案模拟了胚胎发育的过程，有许多研究组都采用拟胚体进行定向诱导以得到不同类型的细胞。
Brown, et al等将hESC悬浮培养7天后形成EB，将其附着在明胶包被的培养皿中贴壁培养2周，经多次传代后可获得CD105+和CD73+细胞。Kimbrel等利用血管母细胞（hemangioblast）这种多功能前体细胞作为从hESC到MSC的过度。具体策略为：将EB先分化为血管母细胞，再进一步分化成hESC-MSC，实验证明该方案分化的hESC-MSC能有效治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，对多发性硬化的治疗效果优于人骨髓间充质干细胞。Hwang, N.S等将EB在明胶包被的培养皿中贴壁培养10天，待细胞达到融合后进行传代，直至P7代检测MSC的表面标志，CD73、CD29、CD44和CD105表达均超过90%。该方案分化的MSC可向软骨细胞分化，能够在裸鼠软骨关节损伤模型中进行体内修复和重建软骨关节的能力，成骨和成脂未显示。
综合以上的分化方案，拟胚体分化法的主要策略为：hESC经过7-10天的悬浮培养形成EB，而后利用MSC贴壁生长的特点，使EB贴壁后经多次传代培养，最终获得形态较为均一的成纤维样的细胞。但由于拟胚体内部分化不均一，导致MSC的纯化过程较长且耗时，整个分化过程需要30-45天，非大规模、高效生产hESC-MSC的理想方案。
3、小分子抑制剂/生长因子诱导分化方案：小分子抑制剂和生长因子可通过对分化相关信号通路的调控作用实现细胞的定向分化。Chen YS等在基础培养基中加入小分子抑制剂SB-431542，浓度为10μM，该物质可阻断转化生长因子β（TGF-β）信号通路促进hESC向MSC分化。骨形态发生蛋白4 (bone morphogenetic protein4，BMP4)、A83-01（ALK5/ALK4/ALK7 inhibitor）也可通过抑制TGF-β信号通路促进hESC向MSC分化。hESC在添加10 ng/mlBMP4和1uM A83-01的mTeSR1培养基中培养5天后再改用MSC培养基（α-MEM+ 20% FBS）达到进一步诱导分化。该方案分化所得细胞具有MSC基本表面标志，以及三系（成骨、软骨、脂肪）分化的能力。Liu等将hESC用Accutase酶消化打散成单细胞后，并添加ROCK信号通路抑制剂Y-27632，然后在胶原蛋白包被的培养皿中贴壁培养24小时后更换MSC培养基（α-MEM+10%FBS），培养至P4进行分化实验。Ou Li等将hESC用重组酶消化成单个细胞，在含有10ng/ml成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的DMEM-HG培养基中连续培养，3代后得到MSC；但是，相比于BM-MSC，所得分化细胞不具有抑制淋巴细胞增值的免疫调节能力。
相比前两种分化策略，此方案有较高的分化效率，但过程复杂且费用昂贵，不适于批量生产。同时，这些方案中使用的不同小分子化合物可能对所得细胞的特性产生影响，例如上文提到Ou Li等人与大多数相关报导不同，分化得到的是没有免疫调节作用的MSC。严格来说，该分化方案所得的细胞并不能称其为MSC。
总而言之，无论是早期的滋养层法还是后来发展出的无滋养层小分子抑制剂/生长因子诱导法，现已报道的各类分化方案的共同特点是一步分化，即无论使用何种方案进行诱导分化，均不在分化过程中更换培养体系即一贯体系。由于hESC在体外培养时对培养体系的改变是非常敏感的，这种方案有一个根本的缺点，即一次性改变hESC的所有培养体系（包括包被材料和培养液）会大幅降低细胞的活力，从而影响其分化效率。
发明内容
本发明基于对亚全能干细胞和间充质干细胞体外培养特点的分析，提供了一种高效可靠的hESC-MSC制备方法，尤其涉及一种高纯度、高分化潜能的胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞的方法及其应用。以影响胚胎干细胞体外扩增培养的两个重要因素即培养液体系与支持/包被材料为依据，分两步分别更换支持/包被材料与培养液体系，在短时间内便可达到简便、高效的分化效果，衍生细胞具有典型的MSC细胞学特性。
本发明由如下技术方案实现的：第一步改变支持/包被材料，第二步改变培养液体系；胚胎干细胞hESCs采用基于机械划块贴壁铺板的方法开始分化过程。
具体步骤如下：
（1）hESC在mTeSR培养液和纤连蛋白Vitronectin包被后的培养皿中培养到80%融合，用手工拉制的毛细玻璃管将其划至0.24-0.28cm2的小块，吹打使其脱离培养皿后直接传代于分别用除了纤连蛋白Vitronectin和基质胶Matrigel以外的其它细胞外基质成分（包括明胶/胶原蛋白/透明质酸/纤粘蛋白等）包被的培养皿中；
（2）待hESC细胞团块完全贴壁，3天后更换mTeSR培养液，待细胞达到70-80%融合后，用重组胰酶将贴壁细胞消化为单个细胞后传代；
（3）传代后的细胞在与步骤2相同包被材料的平皿中，经mTeSR培养至P1代后, 于P2代更换为MSC培养液，持续培养至P5代即可分化得到MSC。
所述MSC培养液为DMEM/F12+10% FBS。
本发明还提供了一种胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞，由上述hESC-MSC的制备方法产生。
本发明还提供了所述的胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞在制备抑制CD4+T-cell增殖和促进Treg分化的免疫调节药物中的应用。
所述的胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞在产生成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞中的用途。
本发明有益效果为：
1、划块法贴壁铺板传代：hESC在体外培养中只有形成小的细胞团才能保持良好的状态和干性，本方案在分化开始时采用划块法，用毛细玻璃管将生长至80%融合的hESC划至0.24-0.28cm2的团块再贴壁分化，更好的保持了hESC的活性。相比许多分化方案开始时都将hESC消化为单个细胞后进行分化传代，这样剧烈的改变会大幅降低hESC本身的活力，不利于进一步的分化过程。我们也通过实验证实了这一假设。虽然拟胚体（EB）同样为细胞团，但EB本身是已分化的细胞，从增殖、分化能力相对hESC均有所减弱。本发明划块分离的hESC集落仍为胚胎干细胞，相比EB具有贴壁快、耗时短、增殖分化能力强的优势。
2、不添加小分子抑制剂/生长因子：本发明所使用的培养液体系无需额外添加小分子抑制剂或生长因子。多数实验组将hESC消化为单细胞进行分化时，使用ROCK抑制剂Y-27632用以促进干细胞的自我更新、集落形成和提高存活率。但是，Y-27632会影响hESC的分化命运；已有文献证明Y-27632可抑制hESC来源的上皮细胞向间质细胞转化。该抑制剂可通过抑制TGF-β关键配体和Wnt信号通路，降低胶原蛋白表达水平，该蛋白为间质细胞标志物，这一实验结果表明，该抑制剂可能影响hESC向MSC的转化。
3、分步改变包被条件：本发明所使用的hESC是在mTeSR培养液和纤连蛋白（Vitronectin）包被后的培养皿中维持扩增的。分步分化方案首先改变原有的包被材料，即基质蛋白，用明胶（gelatin）/胶原蛋白（collagen）/透明质酸（Hyaluronic acid，HA）/纤粘蛋白（fibronectin）等不同于纤连蛋白的基质蛋白作为包被材料，用以激活胚胎干细胞分化；但在该过程中，仍保留原有的培养液，使细胞逐渐适应分化，维持较高的细胞活性与增殖能力。
4、利用hESC的生长特性进行筛选：贴壁后的hESC在mTeSR培养基和相应的包被材料所组成的分化体系中形成梭形细胞，表明hESC已经开始分化。10天左右待细胞达到80%融合后，将贴壁细胞消化为单细胞进行传代。这样的传代方法利用了hESC与MSC不同的体外扩增特性，即单细胞hESC传代无法存活而MSC可以，选择性地保留已有分化迹象的细胞继续培养，简便且高效。传代后，以同样培养体系再培养一代（P1），使单个细胞逐渐适应分化条件，维持其存活率。
5、分步改变培养条件：两步分化法的第二步是从P2代开始将mTeSR更换为MSC培养液（DMEM/F12 +10%FBS），保持第一步中的基质蛋白包被材料不变。上一代保留下来的有分化迹象的细胞经过包被材料与培养液的持续刺激，培养至P5代即可获得高度纯化的MSC样细胞，该细胞具有MSC目前所知的一切基本特性。
该两步法分化是一种新颖可靠的hESC-MSC制备方案，从第一步改变包被蛋白到第二步改变培养系统，不仅让hESC逐渐进入到分化模式，而且在分化过程中保持较高的成活率，以达到更好的分化效率。同时通过对传代方式的调整，先划块法后消化法，利用hESC和MSC的生长特性进行筛选，操作简便、效果明显。
附图说明
图1为hESC-MSC分化流程图、细胞形态及流式鉴定图；图中：A为hESC-MSC分化流程图。B： hESC-MSC（P6）和UC-MSC（P6）成纤维样细胞形态；C：hESC-MSC和UC-MSC流式柱状图。
图2为hESC-MSC和UC-MSC向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化基因表达鉴定图；图中A：0.1%茜素红染色后，成骨细胞中钙化结节染为橙红色；油红O染色后，脂肪细胞中的脂肪粒为红色；阿利新蓝染色则将软骨细胞中蛋白聚糖染为蓝绿色，使分化后的细胞团块呈现深蓝色；B：Real-time PCR检测ESC-MSC和UC-MSC 成骨，成脂，成软骨分化基因表达：Runx2和OPN用于成骨细胞基因表达检测；FABP4和PPAR-γ用于脂肪细胞基因表达检测；ACAN和SOX9用于软骨细胞基因表达检测；ESC-MSC和UC-MSC分化基因表达倍数统计。基因表达归一化为β-actin， *P＜0.05 and **P＜0.01。
图3为hESC-MSC、UC-MSC第4、8、12代5天生长曲线图；图中：（A）：hESC-MSC、UC-MSC在P4代生长曲线；（B）：hESC-MSC、UC-MSC在P8代生长曲线；（C）：hESC-MSC、UC-MSC在P12代生长曲线（*P<0.05, **P<0.01）；
图4为CFSE染色检测hESC-MSC、UC-MSC共培养后对CD3/CD28 T淋巴细胞激活剂激活的CD4+T细胞的增殖抑制能力检测结果图；图中：hESC-MSC+T：hESC-MSC与CD4+T淋巴细胞共培养组；UC-MSC+T：UC-MSC与CD4+T淋巴细胞共培养组；在接触共培养条件下，相比于对照组hESC-MSC和UC-MSC均可显著抑制CD4+T淋巴细胞的增殖（**P <0.01），且hESC-MSC的作用显著强于UC-MSC（P<0.05），增殖率分别为；在非接触性共培养条件下，抑制作用相似（均显著低于对照组，*P <0.05），且hESC-MSC的作用显著强于UC-MSC（*P <0.05）；
图5为流式检测hESC-MSC，UC-MSC在不同共培养下对Treg分化的影响结果图；图中：hESC-MSC+T：hESC-MSC与CD4+T淋巴细胞共培养组；UC-MSC+T：UC-MSC与CD4+T淋巴细胞共培养组。与共培养前，与CD4+T淋巴细胞中CD4+/Foxp3+（即Treg）3.62%的比例相比，接触性共培养后hESC-MSC滋养层组显著高于UC-MSC的6.89%（P<0.05），两者均显著高于对照组（P<0.05）非接触性共培养（Transwell细胞隔筛）条件下，hESC-MSC组和UC-MSC组Treg比率分均显著高于对照组（*P <0.05）。
具体实施方式
一、细胞培养
1.胚胎干细胞培养：hESCs 细胞系：RC9(英国)，在玻连蛋白（vitronectin）包被的无饲养层培养体系中培养，4 -6 d 传代 1 次。传代时，用 0.5mM的EDTA 消化，室温放置 4min，待集落边缘透亮时弃去 EDTA，不含Ca2+、Mg2+ PBS洗 2 遍，加入 mTeSR培养基，呈“Z”字形将集落吹打成的小集落，接种至玻连蛋白包被的培养皿中培养，每天换液。
2.脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)培养：分离细胞所用的脐带组织取自山西医科大学第一医院剖腹产新生儿，由产妇捐献并签署同意书。将脐带-胎盘连接处的羊膜组织剪成约2mm左右的小块，用胶原蛋白酶II型消化3小时，待组织块变小变薄，加入中性蛋白酶II型消化30 min后加入细胞培养液（DMEM/F12+10%FBS）进行稀释。取消化液中的单细胞进行培养，所得贴壁细胞经3次传代后，用流式细胞仪以及分化实验进行鉴定。
3.CD4+T淋巴细胞:取自成人外周血，由健康成人捐献并签署同意书，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），PBMC经PBS洗涤并进行1500rpm离心5分钟后弃上清，按照107个细胞加入抗体50ul再与等量CD4+磁珠混合，室温避光孵育15分钟，将细胞悬液放置在分离架滞留6分钟，吸出溶液中的CD4+T细胞。置于-80℃冻存备用。
二、hESC-MSC分化步骤：hESC经两步法策略分化衍生得到MSC（hESC-MSC），该hESC-MSC通过逐步两次更换贴壁试剂和培养体系实现胚胎干细胞的间充质定向分化。
具体步骤如下：
（1）hESC在mTeSR培养液和纤连蛋白Vitronectin包被后的培养皿中培养到80%融合，用处理过的毛细玻璃管将其划至0.24-0.28cm2的小块，吹打使其脱离培养皿后直接传代于分别用明胶/胶原蛋白/透明质酸/纤粘蛋白包被的培养皿中；
（2）待hESC细胞团块完全贴壁，3天后更换mTeSR培养液，待细胞达到70-80%融合后，用重组胰酶将贴壁细胞消化为单个细胞后传代；
（3）传代后的细胞在与步骤2相同包被材料的平皿中，经mTeSR培养至P1代后, 于P2代更换为MSC培养液，持续培养至P5代即可分化得到MSC。
所述MSC培养液为DMEM/F12+10% FBS。
三、MSC成骨、成脂、成软骨诱导分化及染色分析：取第7代hESC-MSC、UC-MSC，接种于12孔板中，待细胞贴壁后，加入成脂分化培养液进行分化，14天后，用油红O对细胞分化所形成脂滴进行染色；以同样的接种方法，加入成骨分化培养液，14天后，用0.1%茜素红对分化所形成的钙化结节进行染色；吸取5μL浓度为1×107cell/mL的细胞悬液于96孔板的孔中央，置于细胞培养箱中孵育2小时后加入100μL的成软骨分化培养基，培养14天后，用阿利新兰染色对分化细胞团块中的二型胶原蛋白进行染色，对分化效果镜下观察。
四、MSC增殖检测：将不同代数（P4、P8、P12代）的hESC-MSC和UC-MSC按每孔2×103个细胞接种于96孔板培养5天，每24小时用CCK-8检测450nm吸光度值，绘制细胞增值曲线。
五、CD4+T淋巴细胞增殖抑制检测：hESC-MSC生长至80%融合，经20ug/mL丝裂霉素C处理20分钟后作为滋养层，与经过CFSE标记的CD4+T淋巴细胞进行共培养（直接接触式），或者经胰酶消化后收集hESC-MSC采用transwell细胞隔筛与经过CFSE标记的CD4+T淋巴细胞进行共培养（非直接接触式）。CD4-T淋巴细胞的CFSE染色标记：2uM CFSE染液37℃孵育CD4+T淋巴细胞20分钟，用含有血清的RPMI1640中和洗涤两次即可。共培养体系所用培养液为RPMI1640添加50IU/ml IL-2，共培养6天后，收集悬浮细胞以流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞增殖的变化。对照组为UC-MSC，并进行相同丝裂霉素C处理及与经过CFSE标记的CD4+T淋巴细胞进行共培养。
六、CD4+T淋巴细胞向Treg分化检测：hESC-MSC与CD4+T淋巴细胞共培养方式与上述五相同，培养体系同样为RPMI1640，添加50IU/ml IL-2，采用直接接触式和非直接接触式共培养6天后，收集悬浮细胞进行流式检测。检测细胞表面抗原CD4、Foxp3所占比例，Foxp3是控制免疫抑制分子Treg表达的关键因素，该蛋白表达的增高表明了免疫抑制性的增高。
七、流式细胞仪进行细胞表面抗原表达检测：对hESC-MSC、UC-MSC以及CD4+T淋巴细胞进行流式分析。取hESC-MSC、UC-MSC细胞悬液和悬浮的CD4+T细胞，离心后用染色缓冲液重悬，染色30 min后中和洗涤1-2次。hESC-MSC和UC-MSC标记的表面抗原为CD105-Percp、CD90-FITC、CD73-APC、（CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR）-PE；CD4+T淋巴细胞标记的表面抗原为CD4-BV421、Foxp3-APC。
八、细胞总RNA提取及反转录：Trizol法提取细胞总RNA后经反转录得到cDNA，利用qRT-PCR检测分化基因SOX9、ACAN、OPN、RUNX2、FABP4、PPAR-γ的mRNA相对表达。引物序列如表1：
表1 相关细胞因子的引物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
九、主要试剂及仪器：胶原蛋白酶II（Gibco）;中性蛋白酶II型（Sigma）；细胞培养液mTeSR（Stemcell）；细胞培养液DMEM/F12（博士德）；细胞培养液RPMI-1640（Gibco）；胎牛血清（Gibco）;茜素红1%、阿尔辛兰染色液、油红O染色液均购自索莱宝；“Trizol” RNA提取裂解液、Prime Script RT Master Mix均购自TAKARA；SYBR Green Supermix（聚合美）；CCK-8（博士德）；Typselect（Gibco）；StemPro® 成骨/成脂/成软骨分化试剂盒（Gibco）；流式抗体CD105-Percp、CD90-FITC、CD73-APC、（CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR）-PE（BDBiosciences）；丝裂霉素C（索莱宝）；ImmunoCult™ 人CD3/CD28 /CD2 T 淋巴细胞激活剂（Stemcell）；人CD4 T 淋巴细胞纯化试剂盒（BD Biosciences）；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester, CFSE)（Invitrogin）；细胞隔筛（transwell，0.4 um，24-孔板）(Corning)；流式细胞仪（BDLSFortessa X-20）；细胞培养箱（Eppendorf）；生物安全柜（海尔）；定量PCR仪器（罗氏）。
十、统计分析：OriginPro 8.5软件作图和SPSS数据统计分析，不同组数据间进行方差分析，以P<0.05，P<0.01为差异显著或极显著性。
结果：
1、hESC-MSC的分化方案与细胞表面抗原表达：两步法分化方案制备的P6代hESC-MSC形态均一，均为纺锤状、类成纤维细胞样贴壁生长（图1）。经流式细胞仪对该细胞相应表面抗原进行检测，同时使用脐带来源间充质干细胞（UC-MSC）作为对照组，结果表明该细胞CD90、CD105、CD73阳性比例分别为99.7%、94.1%、100.0%，CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达，与UC-MSC相似（表2，图1）。
表2： hESC-MSC、UC-MSC流式表面标记阳性率
Figure 291439DEST_PATH_IMAGE002
2 、hESC-MSC的成骨、成脂、成软骨分化：hESC-MSC与UC-MSC经相应分化培养基体外诱导，均可观察到成骨、成软骨、成脂细胞分化现象。两种细胞在成骨分化培养基中培养14天后，均可见明显的橘红色钙化结节（图2A），hESC-MSC中红色成骨钙化结节数量多于UC-MSC；并且，对相应成骨分化基因（Runx2，OPN）进行实时荧光定量PCR测定，hESC-MSC中成骨分化基因比未诱导分化的该种细胞显著性高出6.2倍和22.8倍（P<0.05）,而UC-MSC则显著性高出2.99倍和4.7倍（P<0.05；图2B，表3）。成脂诱导分化后的两种MSC均可见明显橙红色脂滴（图2A），同时染色显示hESC-MSC分化所得脂滴比UC-MSC分布更密集；对成脂分化基因（FABP4，PPAR-γ）的实时荧光定量PCR测定结果与染色观察一致，hESC-MSC诱导14天后相比未诱导组显著性高出381倍和216倍（P<0.01），而UC-MSC相比未诱导组显著性高出319倍和36倍（P<0.01；图2B，表3）。成软骨分化14天后，两种MSC均可见蓝色细胞团块（图2A），成软骨分化基因（SOX9，ACAN）的实时荧光定量PCR结果显示，诱导后的hESC-MSC其相比无诱导组显著性高出18倍和24倍（P<0.01），UC-MSC则为53倍和18.9倍（P<0.01；图2B，表3）。综合结果表明，hESC-MSC比UC-MSC具有更强的成骨、成脂分化能力，成软骨分化能力两者相当。
表3：hESC-MSC和UC-MSC向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化基因表达比率
Figure DEST_PATH_IMAGE003
3 hESC-MSC和UC-MSC的体外增殖
不同代数（P4、P6、P8）hESC-MSC和UC-MSC的生长曲线显示如图3：P4代hESC-MSC与UC-MSC生长速率基本一致，P8代和P12代 hESC-MSC生长速率则显著高于UC-MSC（P<0.05，P<0.01）。综合结果表明hESC-MSC通过长期培养增殖速率显著性高于UC-MSC。
4 hESC-MSC在不同共培养条件下对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制
hESC-MSC与UC-MSC经丝裂霉素C处理后作为滋养层与经过CFSE标记的CD4+T淋巴细胞进行共培养（未经丝裂霉素C处理的hESC-MSC和UC-MSC对CD4+淋巴细胞的抑制作用相似，数据未显示）。培养6天后，收集悬浮细胞进行流式检测，结果表明，在接触共培养条件下，相比于对照组（无任何细胞共培养），hESC-MSC和UC-MSC均可极显著抑制CD4+T淋巴细胞的增殖（P<0.01），且hESC-MSC的作用又显著强于UC-MSC（P<0.05），增殖率分别为（74.6%，6.33%，10.7%；图4）；在非接触性共培养条件下，抑制作用相似（均显著低于对照组，P<0.05），且hESC-MSC的作用又显著强于UC-MSC（P<0.05），增殖率分别为（77.2%，11.5%，24.1%；图4、表4）。
表4：hESC-MSC、UC-MSC与CD4+T细胞共培养条件下增值率
Figure 270897DEST_PATH_IMAGE004
5 hESC-MSC在不同共培养条件下促进CD4+T淋巴细胞向Treg淋巴细胞分化
hESC-MSC与UC-MSC经丝裂霉素C处理后作为滋养层与CD4+T淋巴细胞进行共培养（未经丝裂霉素C处理的hESC-MSC和UC-MSC对CD4+淋巴细胞的分化影响相似，数据未显示）。共培养6天后，与共培养前，CD4+T淋巴细胞中CD4+/Foxp3+（即Treg）3.62%的比例相比，接触性共培养后hESC-MSC滋养层组Treg比率为10.6%，显著高于UC-MSC的6.89%（P<0.05），两者均显著高于对照组（P<0.05）；非接触性共培养（Transwell细胞隔筛）条件下，hESC-MSC组和UC-MSC组Treg比率分别为6.02%、7.02%均显著高于对照组（P<0.05，见图5、表5）。
表5：hESC-MSC、UC-MSC与CD4+T细胞共培养条件下Treg比例
Figure DEST_PATH_IMAGE005

Claims (6)

1.一种hESC-MSC的制备方法，其特征在于：第一步改变支持/包被材料，第二步改变培养液体系；胚胎干细胞hESCs采用基于机械划块铺板的方法开始分化过程。
2.根据权利要求1所述的一种hESC-MSC的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）hESC在mTeSR培养液和纤连蛋白Vitronectin包被后的培养皿中培养到80%融合，用手工拉制的毛细玻璃管将其划至0.24-0.28cm2的小块，吹打使其脱离培养皿后直接传代于分别用除了纤连蛋白Vitronectin和基质胶Matrigel以外的其它细胞外基质成分包被的培养皿中；其中：其它细胞外基质成分包括明胶/胶原蛋白/透明质酸/纤粘蛋白；
（2）待hESC细胞团块完全贴壁，3天后更换mTeSR培养液，待细胞达到70-80%融合后，用重组胰酶将贴壁细胞消化为单个细胞后传代；
（3）传代后的细胞在与步骤2相同包被材料的平皿中，经mTeSR培养至P1代后, 于P2代更换为MSC培养液，持续培养至P5代即可分化得到MSC。
3.根据权利要求2所述的一种hESC-MSC的制备方法，其特征在于：所述MSC培养液为DMEM/F12+10% FBS。
4.一种胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞，其特征在于：所述胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞由权利要求1-3任意一项所述的hESC-MSC的制备方法产生。
5.权利要求4所述的一种胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞在制备抑制CD4+T-cell增殖和促进Treg分化的免疫调节药物中的应用。
6.权利要求4所述的一种胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞在产生成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞中的用途。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112159794A (zh) * 2020-09-17 2021-01-01 中国人民解放军空军军医大学 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用
CN113652397A (zh) * 2020-05-12 2021-11-16 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司 一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法
CN117721077A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 广东乾晖生物科技有限公司 诱导iPSC向MSC分化的组合物、成套培养基、方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294510B2 (en) * 2001-03-30 2007-11-13 Japan Science And Technology Corporation Process for producing nerve stem cells, motor neurons, and GABAergic neurons from embryonic stem cells
CN107937338A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 中山大学 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法
CN108753711A (zh) * 2018-06-29 2018-11-06 深圳丹伦基因科技有限公司 一种人多能干细胞诱导产生间充质干细胞的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294510B2 (en) * 2001-03-30 2007-11-13 Japan Science And Technology Corporation Process for producing nerve stem cells, motor neurons, and GABAergic neurons from embryonic stem cells
CN107937338A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 中山大学 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法
CN108753711A (zh) * 2018-06-29 2018-11-06 深圳丹伦基因科技有限公司 一种人多能干细胞诱导产生间充质干细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王乐: "hESC和hiPSC体外定向诱导分化的实验研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652397A (zh) * 2020-05-12 2021-11-16 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司 一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法
CN112159794A (zh) * 2020-09-17 2021-01-01 中国人民解放军空军军医大学 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用
CN112159794B (zh) * 2020-09-17 2022-07-15 中国人民解放军空军军医大学 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用
CN117721077A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 广东乾晖生物科技有限公司 诱导iPSC向MSC分化的组合物、成套培养基、方法和应用
CN117721077B (zh) * 2024-02-08 2024-05-31 广东乾晖生物科技有限公司 诱导iPSC向MSC分化的组合物、成套培养基、方法和应用

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