CN113652397A - 一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗领域，针对现有间充质干细胞培养方法的不足，提供了一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法。本发明脐带间充质干细胞培养方法的构建包括：1、包被基质胶。2、脐带组织分离。3、换液。4、处理原代细胞，细胞传代。5、细胞冻存。

Description

一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，特别提供一种脐带间充质干细胞的培养方法。
背景技术
近年来随着生命科学与医学的快速发展，国内外创新性生物治疗技术进展迅速，细胞治疗已发展成为药物治疗和手术治疗后的第三次医疗革命，在恶性肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、抗衰老、再生医学等多个领域显示出巨大的应用潜力。细胞治疗包括免疫细胞治疗和干细胞治疗，干细胞治疗包括胚胎干细胞（ESC）、组织特异性前体干细胞（TSPSC）、间充质干细胞（MSC）、脐带干细胞（UCSC）、骨髓干细胞（BMSC）和诱导多潜能干细胞（iPSC）等。目前，干细胞在重大慢性疾病、严重创伤修复的再生医学领域，已经成为弥补传统治疗不可或缺的有效手段。
间充质干细胞（MSC）因在特定环境下可分化为软骨、骨、支付和肌肉等间质而得名。广泛存在于脐带、胎盘、脂肪、肺、心脏及骨髓等组织中。其特点包括贴壁生长，表达细胞表面标志CD105、CD73、CD90，低表达CD45、CD34、CD14、CD79、CD19及HLA-DR。既往传统的细胞生物学制备方法，制备出的干细胞因细胞表型不合格被器用，浪费了大量的人力物力，本发明一定程度上解决了该问题。
本发明公开用于临床研究所用的、安全可靠的脐带间充质干细胞制备及储存方法。
发明内容
为了提供一种高效新型的脐带间充质干细胞培养方法，本发明采用如下的技术方案：
一、基质胶包被T75培养瓶：
1）包被比例：
原代制备包被比例：1：50，每个T75培养瓶加100ul stemcell基质胶（#07130）；4.9 mlPBS；P1、P2传代包被比例：1：75，每个T75培养瓶加5.92 ml PBS，80 ul基质胶（#07130）；PBS为不含镁和钙离子溶液。
2）包被时间:
轻柔混匀后15-25℃包被时间大于2小时，使用前倒掉基质胶，用PBS或生理盐水轻柔冲次一次；
二、脐带的选择和处理：
1）新鲜健康脐带，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液浸洗两次去除肉眼可见的污物及残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液浸洗两次,用剪刀剪碎成1mm3大小组织块，应用5ml浓度为2mg/L索莱宝胶原酶消化组织后应用BD公司流式细胞仪检测，细胞表型CD105表达大于95%认定为合格脐带，进行下一步制备；
2）经检测合格的脐带，取5cm长短，同上述处理方法处理为碎成1mm3大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到T75培养瓶中；（T75培养瓶终体积12ml）；
6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养；
三、培养第5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
四、培养第10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
五、14天处理原代细胞。PO细胞传代P1：
1）包被基质胶：每个T75培养瓶加5 ml PBS，67 ulstemcell基质胶（#07130）；
2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水清洗2次T75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃孵育2-3分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液冲洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；
3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：T75cm2 1-1.5*105/瓶，终体积10-12ml；
六、干细胞的冻存：
干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞，台盼蓝染色计数活率，离心清洗后应用BD公司的流式细胞仪（FACSVia）测量表型，表型合格细胞用stemcell CS10冻存液(#07959)悬浮细胞，调整细胞浓度为5-10×106/ml，标记冻存管。使用Thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于Thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。
附图说明
图1 为脐带横截面示意图；
图2 为脐带筛选步骤流式细胞检测CD105；
图3 为流式细胞检测阴性对照;
图4 为流式细胞检测CD105;
图5 为流式细胞检测CD90;
图6 为流式细胞检测CD73;
图7 为流式细胞检测CD45;
图8 为流式细胞检测CD34;
图9 为流式细胞检测CD11;
图10 为流式细胞检测HLA-DR。
图11 为分离脐带血干细胞流程图
具体实施方式
实施例1
1、包被基质胶：原代制备包被比例：1：50。取4个T75培养瓶每个加100ul stemcell基质胶（#07130）和4.9 ml PBS。轻柔混匀后25℃包被时间3小时。
2、脐带的处理：在GMP实验室，上海力申科学仪器有限公司生物安全柜（HFsafe1200LC）中进行操作，新鲜健康脐带，总长度25cm，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液冲洗两次去除残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液冲洗两次,用剪刀剪碎成1mm3大小组织块，应用5ml浓度为2mg/L索莱宝胶原酶消化组织后应用BD公司流式细胞仪检测，CD105表达98%认定为合格脐带，进行下一步制备；
2）上述脐带取5cm长短，同上处理为碎成1mm3大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到4个T75培养瓶中；（T75培养瓶终体积12ml）；
6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中；
三、培养5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
四、培养10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
五、14天处理原代细胞。细胞传代：
1）包被基质胶：每个T75培养瓶加5 ml PBS，67 ulstemcell基质胶（#07130）；
2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水清洗2次T75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃孵育2分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液冲洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；
3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：T75cm2 1.5*105/瓶，终体积12ml；
六、干细胞的冻存：
干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞共4.47×107/L，台盼蓝染色计数活率99.8%，离心清洗后应用BD公司的流式细胞仪（FACSVia）测量表型:CD105 98.5%；CD90 99.9%；CD7398.3%；CD45 3.7%；CD34 2.4%；CD11 4.1%；HLA-DR 4.2%。
用stemcell CS10冻存液(#07959)6毫升悬浮细胞，调整细胞浓度为1.1×107/ml，标记冻存管。使用Thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于Thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。

Claims (6)

1.一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于所述工艺包括以下培养步骤：
一、包被基质胶：
1）包被比例：
原代制备包被比例：1：50，每个T75培养瓶加100ulstemcell基质胶（#07130）；4.9 mlPBS；
P1、P2传代包被比例：1：75；
2）包被时间:
轻柔混匀后15-25℃包被时间大于2小时，使用前倒掉基质胶，用PBS或生理盐水轻柔冲次一次；
二、脐带的选择和处理：
1）新鲜健康脐带，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液冲洗两次去除残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液浸洗两次,用剪刀剪碎成1mm3大小组织块，应用5ml浓度为2mg/L索莱宝胶原酶消化组织后应用BD公司流式细胞仪检测，CD105表达大于95%认定为合格脐带，进行下一步制备；
2）经检测合格的脐带，取5cm长短，同上处理为碎成1mm3大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到T75培养瓶中；（T75培养瓶终体积12ml） ；
6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中；
三、培养5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
四、培养10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；
五、14天处理原代细胞；
细胞传代：
1）包被基质胶：每个T75培养瓶加5 ml PBS，67 ulstemcell基质胶（#07130）；
2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水浸洗2次T75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃ 孵育2-3分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液浸洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；
3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：T75cm2 1-1.5*105/瓶，终体积10-12ml；
六、干细胞的冻存：
干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞，台盼蓝染色计数活率，离心清洗后应用BD公司的流式细胞仪（FACSVia）测量表型，表型合格细胞用stemcell CS10冻存液(#07959)悬浮细胞，调整细胞浓度为5-10×106/ml，标记冻存管；
使用Thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于Thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。
2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特点在于正式培养前对脐带进行选择，提高制备合格率，减少制备成本。
3.步骤二中冻存的脐带间充质干细胞建立供者健康信息资料数据库、干细胞资料库，配条形码。
4.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于无动物源性，收集的细胞包括P2及P3。
5.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于应用程序降温仪，提高细胞复苏率。
6.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于所有操作均处于GMP实验中中进行。
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