CN110551684A

CN110551684A - 一种人脐带间充质干细胞制备方法

Info

Publication number: CN110551684A
Application number: CN201910872249.4A
Authority: CN
Inventors: 沈少敏; 聂雅婷; 吕小婷; 何锎钋
Original assignee: Fujian Haixi Cell Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Fujian Haixi Cell Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110551684B

Abstract

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞制备方法，属于干细胞制备领域。本发明的制备方法包括采集、分离、换液、传代、冻存、检测、程序降温及储存全过程。以人脐带为材料提取脐带间充质干细胞，采用两种酶两步消化法进行制备，利用消化下来的细胞和消化结束剩余的组织分开培养后传代混合一起培养，提取培养过程中无需加入动物血清，制备过程无需加抗生素，原代分离无需过滤，两种培养方式同期进行，不仅提高了成功率且能在较短的时间得到大量稳定的细胞。本方法原代提取消化时间短，避免了I型胶原酶和分散酶长时间消化对细胞的影响，同时避免原代消化后细胞过滤后细胞数的损失。整个培养周期短，能高效、稳定的获得脐带间充质干细胞。

Description

一种人脐带间充质干细胞制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞，可以在体内培养、扩增、定向诱导分化成多种细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可以分成胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞存在于脐带、骨髓、脂肪、血液、牙髓等组织中，对于成体干细胞及可塑性研究及再生医学是近年来生物医学领域的热点之一，被广泛应用于骨相关疾病治疗、神经细胞修复、血管生成、免疫调节、细胞代替疗法、抗衰老及组织工程领域。

间充质干细胞来源胚胎早期发育中胚层，是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在体外可以分化诱导成骨、脂肪、软骨、神经等多种组织细胞。具有向受损组织归巢并修复、重建受损或者病变的组织器官的特点，可以降低免疫排斥反应，提高移植成活率，使其成为当前成体干细胞研究的热点。人脐带结缔组织是间充质干细胞的丰富来源，相对于骨髓来源的间充质干细胞破坏侵入性分离过程而言，脐带间充质干细胞更加易获得，并对母亲和孩子均无损伤，使其成为细胞治疗中理想细胞而逐渐代替骨髓来源间充质干细胞。

目前，在从脐带上分离间充质干细胞过程中，酶处理在分离脐带间充质干细胞中起重要作用。目前使用的主要有组织块贴壁法和酶消化法。采用组织块贴壁法分离时，约7-10 天后可见贴壁生长的单个长条梭形细胞从组织块中分离出，细胞融合达80%~90%时，胰酶消化传代，但是组织贴壁法培养周期长不利于大规模生产制备。对于酶消化法，即对剪碎后的脐带组织块加入胶原酶、胰酶或各种酶的混合液进行消化，直接获取贴壁生长的单个细胞。虽然酶消化法可以快速分离出脐带间充质干细胞，但酶体系中可能会降解细胞外膜蛋白，甚至会导致细胞无法贴壁。因此，消化酶的选择、用量及消化的时间是分离脐带间充质干细胞的关键。

本发明采用酶消化和组织贴壁法相结合，利用I型胶原酶消化后再用分散酶二次消化后的得到细胞悬液进行培养，同时将粘附大量消化下来细胞的消化结束剩余的组织块进行培养，两者原代培养的细胞消化后合并一起培养，从而获得更多的原代细胞，更利于后期的大规模培养。本发明原代分离选择I型胶原酶、分散酶均为较温和的消化酶，消化时间短，避免了对细胞损伤，能高效，稳定的从脐带提取间充质干细胞。同时经过酶消化后脐带华通胶组织粘附了大量细胞且经过胶原酶消化脐带组织的外基质所剩下的组织更容易贴壁并通过干细胞迁移能力生长出脐带间充质干细胞。

发明内容

本发明的目的在于针对现有从脐带上分离间充质干细胞过程中存在的问题，提供一种人脐带间充质干细胞的制备方法。该方法采用酶消化和组织贴壁法相结合，利用I型胶原酶消化后再用分散酶二次消化后的得到细胞悬液进行培养，同时将粘附大量消化下来细胞的消化结束剩余的组织块进行培养，两者原代培养的细胞消化后合并一起培养，从而获得更多的原代细胞，更利于后期的大规模培养。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）采集：选取来自于医院正常足月的分娩的脐带，经与产妇及其家属签署知情同意书，胎儿娩出后，常规断脐，用碘伏纱布自脐带断端向胎盘断端快速擦拭，消毒2遍并清除血液羊水胎粪，并用含有生理盐水的纱布擦拭1遍去除碘伏，从断口处将脐血放尽并用无菌纱布擦拭除尽脐血；用止血钳夹住脐带的头端和尾端，然后在靠近止血钳处用无菌丝线结扎；把结扎好的脐带放入装有100ml采集液的采样瓶中，4-16℃，24小时内送达实验室操作；并采集母亲外周血5ml进行艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、巨细胞病毒检测；

（2）消毒、清洗：将脐带从采样瓶中取出，放至含有75%酒精的培养皿中，漂洗浸泡1min；将脐带从酒精中取出，放至新的培养皿，加入生理盐水漂洗去除残留的酒精；用剪刀去除两端结扎线，将脐带剪成3-4cm长的小段，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，再将脐带转移到新的含有生理盐水的培养皿中，重复该过程直至清除淤血；

（3）分离：在新的含有生理盐水的培养皿中，将脐带内端剪个切口，沿切口撕开，平铺脐带，将静脉血管和动脉血管剖离，用镊子撕取华通胶，放至装有生理盐水的离心管中备用；

（4）漂洗、剪碎：准备2个6寸方盒，把离心管的华通胶移至6寸方盒用生理盐水漂洗后移至另一个6寸方盒，反复漂洗7遍，将清洗好的脐带华通胶捋干后转移到50ml离心管中用无菌剪刀剪至1.5-2.5mm³颗粒；

（5）第一次消化：根据华通胶的体积往离心管中加入等体积的0.2w/v% I型胶原酶并转至500ml方瓶中，混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化2.5h；

（6）第二次消化：第一次消化完成后加入0.2 w/v%的分散酶并用生理盐水补足到200ml使得分散酶的最终为0.05w/v%，混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化30min；

（7）稀释：消化结束后补生理盐水使终体积为500ml，充分混匀后，消化结束剩余的组织块沉淀底部，将500ml的消化悬液平均分于10个50ml离心管中，消化结束剩余的组织块倒于另一个离心管并补生理盐水至50ml；2500rpm，20min离心弃去上清，用生理盐水洗涤1次，1500rpm，10min离心弃去上清；

（8）计数、种瓶：步骤（7）所得消化细胞悬液用无血清完全培养基重悬细胞，用血球计数板法计数；将获得的脐带间充质干细胞按7×10³/cm²—9×10³/cm²的密度接种于相应T175培养瓶中，使得每个T175培养瓶中有30ml无血清完全培养基；另外步骤（7）所得消化结束剩余组织块，按照每4-5ml组织接种于一个T175瓶中并补15ml无血清完全培养基摇匀平铺；放置到37℃、5%CO₂培养箱中培养；

（9）换液：步骤（8）的培养瓶培养至第7天进行无血清完全培养基全量换液，之后每隔3天进行全量换液；

（10）传代：待细胞生长至融合度80%，用10ml生理盐水洗涤细胞2次，加入10mL 0.05w/v%胰酶在37℃二氧化碳培养箱消化1min，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞，将消化得到悬液培养的细胞和消化结束剩余的组织块培养的细胞合并；1000rpm，5min离心弃去上清，用无血清完全培养基重悬细胞按1:4进行传代种瓶；

（11）收获、冻存：待细胞生长至融合度90%时，用10ml生理盐水洗涤细胞2次，加入10mL0.05w/v%胰酶在37℃二氧化碳培养箱消化1min，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞进行计数；再用生理盐水洗涤1遍，1000rpm，5min离心弃去上清；用细胞冻存保护剂悬浮细胞，混匀后按每根冻存管细胞数为4×10⁶-5×10⁶个将细胞分装到做好标记（代数、体积、细胞数、编号、冻存时间等）的冻存管中，每管体积为1mL。

（12）程序降温及正式储存：将冻存管放入4℃预冷的程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱24h后，转入液氮正式储存。

（13）检测：细胞计数和活性检测，流式检测，微生物检测、支原体检测、内毒素检测，诱导分化能力检测，测定细胞生长曲线。

上述步骤（1）中所述采集液为，95v/v%α-MEM，5v/v%人血白蛋白注射液，内含有两性霉素B 1ug/ml，庆大霉素50ug/ml，链霉素100ug/ml。

上述步骤（11）所述细胞冻存保护剂包含DMSO 10v/v％，无血清完全培养基 65v/v％，人血白蛋白10v/v％，右旋糖酐5v/v％，羟乙基淀粉5v/v％，海藻糖5v/v％；用前要放冰箱平衡至4℃。

<1>细胞计数和活性检测：利用台盼蓝拒染法对细胞进行染色后在血球计数板计出总的细胞和活细胞数，根据公式细胞活率=活细胞数/细胞总数×100%得出细胞活率。

<2>流式检测：收集细胞，PBS洗涤2次，调整细胞浓度制成细胞悬液，标记1~6个管各自加入细胞悬液，使每管的细胞为5×10⁵个，管1加5 μL鼠抗人CD90-FITC、管2加5 μL鼠抗人CD105-PerCP-Cy™5.5、管3加5 μL鼠抗人CD73-APC、管4不加抗体、管5加10 μL hMSC阳性同型对照混合物和10 μLPE hMSC阴性同型对照混合物、管6加10 μL hMSC阳性混合物和10 μLPE hMSC阴性混合物室温避光孵育30 min，用PBS反复洗两三次，减少非特异性结合；加入300 μLPBS混匀细胞，上流式细胞仪检测CD90⁺、CD73⁺、CD105⁺和hMSC阴性混合物CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺、HLA-DR⁺等主要表面标记物的表达水平。

<3>微生物检测、支原体检测、内毒素检测。

<4>诱导分化能力检测：成脂诱导分化操作、成骨诱导分化操作。

<5>测定细胞生长曲线：取第3代的脐带间充质干细胞，胰酶消化后接种(细胞浓度为1.0×10⁴/ml)于24孔板中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养；每天随机抽取3个孔用胰酶消化，采用血球计数板法计数，每孔计数3次取平均值，持续7 d；绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞数。

附图说明

图1为P0代消化得到细胞悬液培养的脐带间充质干细胞形态图；

图2为P0代消化结束剩下组织块培养的脐带间充质干细胞形态图；

图3为P1代脐带间充质干细胞形态图；

图4为P2代脐带间充质干细胞形态图；

图5为P3代脐带间充质干细胞形态图；

图6为脐带间充质干细胞P3代流式检测结果；

图7为脐带间充质干细胞的成脂诱导分化图；

图8为脐带间充质干细胞的成骨诱导分化图；

图9为 P3代脐带间充质干细胞生长曲线图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1

一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）采集：选取来自于中国人民解放军联勤保障部队第900医院正常足月的分娩的脐带，经与产妇及其家属签署知情同意书，胎儿娩出后，常规断脐，用碘伏纱布自脐带断端向胎盘断端快速擦拭，消毒2遍并清除血液羊水胎粪，并用含有生理盐水的纱布擦拭1遍去除碘伏，从断口处将脐血放尽并用无菌纱布擦拭除尽脐血。用止血钳夹住脐带的头端和尾端，然后在靠近止血钳处用无菌丝线结扎。把结扎好的脐带放入采样瓶，其中采集液为100ml ，95v/v%α-MEM，5v/v%人血白蛋白注射液，内含有两性霉素B 1ug/ml，庆大霉素50ug/ml，链霉素100ug/ml。4-16℃，24小时内送达实验室操作。并采集母亲外周血5ml进行艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、巨细胞病毒检测。

（2）消毒、清洗：将脐带从采集瓶中取出，放至含有75%酒精的培养皿中，漂洗浸泡1min。将脐带从酒精中取出，放至新的培养皿，加入的生理盐水漂洗去除残留的酒精。用剪刀去除两端结扎线，将脐带剪成3-4cm长的小段，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，再将脐带转移到新的含有生理盐水的培养皿中，重复该过程直至清除淤血。

（3）分离：在新的含有生理盐水的培养皿中，将脐带内端剪个切口，沿切口撕开，平铺脐带，将静脉血管和动脉血管剖离，用镊子撕取华通胶，放至装有生理盐水的离心管中备用。

（4）漂洗、剪碎：准备2个6寸方盒，把离心管的华通胶移至6寸方盒用生理盐水漂洗后移至另一个6寸方盒，反复漂洗7遍。将清洗好的脐带华通胶捋干后转移到50ml离心管中用无菌剪刀剪至1.5-2.5mm³颗粒。

（5）第一次消化：根据华通胶的体积往离心管中加入等体积的0.2w/v% I型胶原酶并转至500ml方瓶中。将酶与华通胶组织块混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化2.5h。

（6）第二次消化：第一次消化完成后加入适量的0.2 w/v%的分散酶并用生理盐水补足到200ml使得分散酶的最终为0.05w/v%，混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化30min。

（7）稀释：消化结束后补生理盐水使得终体积为500ml，充分混匀后，让消化结束剩余的组织块沉淀底部，将500ml的消化悬液平均倒于10个50ml离心管中，消化结束剩余的组织块倒于另一个离心管并加生理盐水至50ml。2500rpm，20min离心弃去上清。用生理盐水洗涤1次，1500rpm，10min离心弃去上清。

（8）计数、种瓶：其中消化细胞悬液用无血清完全培养基重悬细胞，用血球计数板法计数。将获得的脐带间充质干细胞按7×10³/cm²—9×10³/cm²的密度接种于相应T175培养瓶中，使得每个T175培养瓶中有30ml无血清完全培养基。另外消化结束剩余的组织块，按照每4-5ml组织种于一个T175瓶中并补15ml无血清完全培养基摇匀平铺，放置到37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（9）换液：步骤（8）的培养瓶培养至第7天进行全量更换无血清完全培养基，之后每隔3天进行全量换液。

（10）传代：待细胞生长至融合度80%，用10ml生理盐水洗涤细胞2次，加入10mL0.05w/v%胰酶在37℃二氧化碳培养箱消化1min，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞，将消化得到细胞悬液培养的细胞和消化结束剩余的组织块培养的细胞合并。1000rpm，5min离心弃去上清，用无血清完全培养基重悬细胞按1:4进行传代种瓶，传代到P3代，每代细胞进行细胞形态学观察及拍照并取样进行计数和测活。

（11）收获、冻存：待细胞生长至融合度90%时，用10ml生理盐水洗涤细胞2次，加入10mL 0.05w/v%胰酶37℃二氧化碳培养箱消化1min，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞进行计数。再用生理盐水洗涤1遍，1000rpm，5min离心弃去上清。从冰箱中取出提前配制细胞冻存保护剂（用前要放冰箱平衡至4℃），其中细胞冻存保护剂含DMSO10v/v％，无血清完全培养基 65v/v％，人血白蛋白10v/v％，右旋糖酐5v/v％，羟乙基淀粉5v/v％，海藻糖5v/v％。根据细胞计数，按每根冻存管细胞数为4×10⁶-5×10⁶个细胞数，计算出细胞冻存的管数和体积。先在冻存管上做好标记（代数、体积、细胞数、编号、冻存时间等），再用细胞冻存保护剂定容到相应体积，吹打混匀，混匀后将细胞分装到冻存管中，每管体积为1mL。

检测及结果：

（1）细胞形态学观察

图1-图5为P0-P3代脐带间充质干细胞形态图，由图可以看出脐带间充质干细胞贴壁生长，细胞呈均一的长梭形，漩涡式生长。

（2）计数及测活

从P0-P3代的细胞消化后收获的细胞，通过血球计数板进行计数台盼蓝拒染法测活，细胞活率=活细胞数/细胞总数×100%得出细胞活率。结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，所获得的细胞数多且稳定，细胞活性高。

（3）流式检测

收集P0-P3代细胞，PBS洗涤2次，调整细胞浓度制成细胞悬液，标记1~6个管各自加入细胞悬液，使每管的细胞为5×10⁵个，管1加5 μL鼠抗人CD90-FITC、管2加5 μL鼠抗人CD105-PerCP-Cy™5.5、管3加5 μL鼠抗人CD73-APC、管4不加抗体、管5加10 μL hMSC 阳性同型对照混合物和10 μLPE hMSC阴性同型对照混合物、管6加10 μL hMSC阳性混合物和10 μLPEhMSC阴性混合物室温避光孵育30 min，用PBS反复洗两三次，减少非特异性结合；加入300 μLPBS混匀细胞，上流式细胞仪检测CD90⁺、CD73⁺、CD105⁺和hMSC阴性混合物CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺、HLA-DR⁺等主要表面标记物的表达水平。结果见表2：

表2

从表2中可知所获得P0-P3代细胞流式表型均一。细胞表达间充质细胞标记CD90、CD73、 CD105 ，不表达造血细胞标记CD45、 CD34、 CD11b、 CD19，且不表达人白细胞抗原HLA-DR ，符合国际细胞治疗协会(ISCT)对于间充质干细胞表面标记物规定的标准。其中P3代流式上机检测结果见图6。

（4）诱导分化能力检测

利用下表诱导分化试剂盒进行成脂诱导分化、成骨诱导分化能力检测：

成脂诱导分化操作根据试剂盒说明书进行。结果见图7，从图7可以看出脐带间充质干细胞经诱导后出现很明显的脂滴，说明细胞具有较强的向脂肪细胞分化的能力。

成骨诱导分化操作根据试剂盒说明书进行。结果见图8，从图 8可以看出诱导分化的细胞已经形成骨细胞钙化结节，说明脐带间充质干细胞具有向成骨细胞分化能力。

（5）测定细胞生长曲线

取第3代的脐带间充质干细胞，胰酶消化后接种(细胞浓度为1.0×10⁴个/ml)于24孔板中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养；每天随机抽取3个孔用胰酶消化，采用血球计数板法计数，每孔计数3次取平均值，持续7 d；绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞数。

结果见图9，从图9可以看出脐带间充质干细胞基本符合细胞生长曲线规律，分为潜伏期、对数期和平台期，接种1-2天细胞生长处于潜伏期，3-6天达到对数期，然后为平台期。显示脐带间充质干细胞在体外增殖相对稳定，生长状态无异常，细胞增殖较快。

实施例2

一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）采集：选取来自于中国人民解放军联勤保障部队第900医院正常足月的分娩的脐带3例（标记为：脐带01、脐带02、脐带03），经与产妇及其家属签署知情同意书，胎儿娩出后，常规断脐，用碘伏纱布自脐带断端向胎盘断端快速擦拭，消毒2遍并清除血液羊水胎粪，并用含有生理盐水的纱布擦拭1遍去除碘伏，从断口处将脐血放尽并用无菌纱布擦拭除尽脐血。用止血钳夹住脐带的头端和尾端，然后在靠近止血钳处用无菌丝线结扎。把结扎好的脐带放入采样瓶，其中采集液为100ml ，95v/v%α-MEM，5v/v%人血白蛋白注射液，内含有两性霉素B 1ug/ml，庆大霉素50ug/ml，链霉素100ug/ml。4-16℃，24小时内送达实验室操作。并采集母亲外周血5ml进行艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、巨细胞病毒检测。

（4）漂洗、剪碎：准备2个6寸方盒，把离心管的华通胶移至6寸方盒用生理盐水漂洗后移至另一个6寸方盒，反复漂洗7遍。将清洗好的脐带华通胶捋干后转移到50ml离心管中用无菌剪刀剪至1.5-2.5mm³颗粒。每例样本把华通胶按照体积平均分成2份，分为A组和B组两组。

（5）第一次消化：根据华通胶的体积往A组和B组离心管中加入等体积的0.2w/v% I型胶原酶并转至两个500ml方瓶中。将酶与华通胶组织块混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化2.5h。

（6）第二次消化：第一次消化完成后往A组和B组加入适量的0.2 w/v%的分散酶并用生理盐水补足到100ml使得分散酶的最终为0.05w/v%，混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化30min。

（7）稀释：消化结束后补生理盐水使得终体积为250ml，充分混匀后，其中A组让消化结束剩余的组织块沉淀底部，将250ml的消化悬液平均倒于5个50ml离心管中，消化结束剩余组织块倒于另一个离心管并加生理盐水至50ml。2500rpm，20min离心弃去上清。用生理盐水洗涤1次，1500rpm，10min离心弃去上清。其中B组将250ml的消化悬液倒入200目滤网过滤，并用生理盐水冲洗收集过滤液，2500rpm，20min离心弃去上清。用生理盐水洗涤1次，1500rpm，10min离心弃去上清。

（8）计数、种瓶：A组中的消化得到细胞悬液用无血清完全培养基重悬细胞，用血球计数板法计数。将获得的脐带间充质干细胞按7×10³/cm²—9×10³/cm²的密度接种于相应瓶数T75培养瓶中，使得每个T75培养瓶中有20ml无血清完全培养基。另外消化结束剩余的组织，按照每2-3ml组织种于一个T75瓶中并补10ml无血清完全培养基摇匀平铺，放置到37℃、5%CO₂培养箱中培养。B组中消化得到细胞悬液用无血清完全培养基重悬细胞，用血球计数板法计数。将获得的脐带间充质干细胞按7×10³/cm²—9×10³/cm²的密度接种于相应瓶数T75培养瓶中，使得每个T75培养瓶中有20ml无血清完全培养基摇匀后，放置到37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（10）原代细胞收获：待细胞生长至融合度90%左右，用5ml生理盐水洗涤细胞2次，加入5mL 0.05w/v%胰酶在 37℃二氧化碳培养箱消化1min，用5ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞，其中A组将消化得到细胞悬液培养的细胞和消化结束剩余组织块培养的细胞合并并过细胞筛去除组织块。B组正常收集消化液体。两组均1000rpm，5min离心弃去上清，用生理盐水重悬细胞，并用血球计数板法进行A、B组细胞计数。

结果及分析：从表3可以看出A组原代培养后得到的细胞均比B组多，说明A组方案原代分离的细胞多于B组，更有利于后期的传代培养。由于A组将消化得到细胞悬液培养的同时消化结束剩余的组织块也进行培养，由于华通胶经过酶消化后得到消化液较为粘稠，很多消化下来的细胞粘附在组织块上，通过收集消化剩余的组织块再培养，能让组织块上粘附的细胞贴壁培养生长，而如果采用B组的方案用200目滤网过滤后，会损失一大半部分细胞，其中一大部分细胞还粘附组织块上。

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第二次消化：第一次消化完成后加入0.2 w/v%的分散酶并用生理盐水补足到200ml使得分散酶的最终为0.05w/v%，混匀，放入37℃转速为100rpm的摇床中消化30min；

稀释：消化结束后补生理盐水使终体积为500ml，充分混匀后，消化完剩余的组织块沉淀底部，将500ml的消化悬液平均分于10个50ml离心管中，消化结束剩余的组织块倒于另一个离心管并补生理盐水至50ml；2500rpm，20min离心弃去上清，用生理盐水洗涤1次，1500rpm，10min离心弃去上清；

（11）收获、冻存：待细胞生长至融合度90%时，用10ml生理盐水洗涤细胞2次，加入10mL0.05w/v%胰酶在37℃二氧化碳培养箱消化1min，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，收集消化细胞进行计数；再用生理盐水洗涤1遍，1000rpm，5min离心弃去上清；用细胞冻存保护剂悬浮细胞，混匀后按每根冻存管细胞数为4×10⁶-5×10⁶个将细胞分装到做好标记的冻存管中，每管体积为1mL；

（12）程序降温及正式储存：将冻存管放入4℃预冷的程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱24h后，转入液氮正式储存；

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：上述步骤（1）中所述采集液为，95v/v%α-MEM，5v/v%人血白蛋白注射液，内含有两性霉素B 1ug/ml，庆大霉素50ug/ml，链霉素100ug/ml。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：上述步骤（11）所述细胞冻存保护剂包含DMSO 10v/v％，无血清完全培养基 65v/v％，人血白蛋白10v/v％，右旋糖酐5v/v％，羟乙基淀粉5v/v％，海藻糖5v/v％；用前要放冰箱平衡至4℃。