CN109294979A

CN109294979A - 一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用

Info

Publication number: CN109294979A
Application number: CN201811293316.9A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Microtek Biotech Ltd By Share Ltd
Current assignee: Microtek Biotech Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明涉及干细胞领域。本发明初步建立一种脐带、胎盘干细胞分离培养培养体系及应用。所述方法包括：（1）新生胎儿脐带、胎盘的处理与运输；（2）脐带、胎盘冲洗、切割、消化处理；（3）原代细胞及组织快细致处理；（4）全新添加物、传代换液处理。本发明可以在节约成本的基础上更高效率分离培养脐带、胎盘间充质干细胞。

Description

一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其是分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞的方法，在培养中我们添加了胎盘组织液，最大程度上模拟了细胞原本生长环境，使得细胞起步更平稳、增殖更快。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育阶段分为两类:胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（MSC），是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。最初MSC提取大多数来自骨髓，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓 MSC 移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性大，直接影响了骨髓MSC的临床应用，替代骨髓MSC的间充质干细胞来源迫在眉睫。

脐带、胎盘是产妇生产后的“废弃物”。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’s Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由羊膜层、蜕膜层等组成。脐带的Wharton’s Jelly、胎盘的羊膜层和蜕膜层中有着丰富的间充质干细胞，而且相对骨髓间充质干细胞具有更高的增殖能力，更低的免疫原性以及更高的分化潜能，而且采集过程简单，无任何危害损伤及伦理学困扰。以上原因使脐带、胎盘间充质干细胞更适合临床的应用。但是，脐带、胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，传统的方法不仅对脐带、胎盘来源细胞伤害大，回收效率低，杂细胞多，细胞增殖速率慢，而且污染风险大，本发明恰恰从来源上保证安全无污染，而且提供了一个简单和高效的脐带、胎盘组织分离、培养、冻存间充质干细胞的方法，足以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容

本发明的目的是解决现有获取脐带、胎盘间充质干细胞方法的缺陷，提供一种实用简单的从脐带、胎盘中大量分离间充质干细胞的方法。本发明采用方法回收率和纯度，增殖能力比传统方法都有显著提高，而且无污染确保在临床中的安全应用。

1.来源上，我们选取经过严格身体筛查的产妇及胎儿的脐带、胎盘，确保健康，确保没有遗传病、确保没有感染性疾病及病原体携带，确保无污染，并且会留有产妇及胎儿信息留档以便查证；

2.脐带、胎盘取出后经由专业有资质的人员处理，用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，避免红细胞裂解，造成细胞内物质污染脐带、胎盘组织，将脐带、胎盘放入保存液中，低温冷链2-8℃全程监控快速运输到实验室，即到即处理（72h内）；

3.脐带、胎盘组织进入实验室必须遵守严格制度，登记相应表格，交由专业人员快速用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，选取质量较好部分，用经过121℃，103.4kPa灭菌的手术器械，剥离组织块；

4.将组织块进一步切割成1-3mm³大小浸润在PBS溶液中，组织消化液37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h；

5.根据方法4，组织消化液包含胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶中的一种或多种酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的EDTA、 0.1-1%胶原酶Ⅱ、Ⅳ、0.1mg/mL分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相对单一酶消化效率显著提高；

6.根据方法4，37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h，方法多元，更加适合大量样本处理；

7.消化结束后，经200目筛网过滤，细胞滤液1200-1600rpm离心10分钟，再用PBS冲洗一次，然后经羟乙基淀粉或Ficoll分离液2000rpm无升降离心20min，纯化所需单细胞，滤网内的组织块经消化后比较松散，研磨会造成细胞损伤，所以采用PBS冲洗一次，1000rpm离心10min；

8.将细胞和组织块分别接种到T75细胞培养瓶，细胞密度在0.5-1*10⁶/ml,每瓶10mlMSC培养基，37℃，5%CO₂，培养3-4天后，如果出现大克隆，胰酶消化，添加新鲜培养基及20-50%经过2000rpm离心原液重贴，掉落的组织块重新再贴，采用这样的换液方法对细胞环境影响较小，对数期会延长；

9.根据方法8，在MSC培养基中添加胎盘组织液、EGF因子、胰岛素等因子，更好的模拟胎盘环境，让细胞快速增殖；

10.8-10天左右，细胞融合会达到90%, 0.01%胰酶消化传代，每T75瓶接种1*10⁶/ml,每瓶10ml,2-3天融合率会达到90%，传代不超过7代；

11.细胞冻存1*10⁶/支，每支1ml，冻存液采用10%DMSO、10%人白、30%羟乙基淀粉、50%MSC培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取；

12.根据方法10、11，每一次的传代和冻存都做留样处理，并做安全监测；

细胞培养前后、冻存、复苏；细胞数目、活率及表型检测；安全性检测包括以下一项或多项：细菌、真菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、人白残留、抗生素残留等；生物学效力包括其免疫抑制力检测，客户资料、培养时间、各项数据统一归档

附图说明：

图1是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞光镜观察图（200×）。

图2是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞成脂、成骨分化能力图（200×）。（成脂分化：箭头所指为脂滴；成骨份化：箭头所指为钙化结节）

图3是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞流式检测表面标志图。

具体实施方式

实施例1、

一、试剂

胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶，胎盘组织液、EGF因子，胰岛素，羟乙基淀粉，DMSO购自sigma公司。无血清的MSC培养基为公司自制。保护液配制：为公司自制

消化液配制：胰蛋白酶浓度：0.25%，胶原酶Ⅱ：0.5mg/ml, 胶原酶Ⅳ：1mg/ml分散酶浓度：0.1mg/ml。

二、取材、运输、分离，扩增和冻存

材料取自健康孕妇分娩或剖腹产后废弃的脐带、胎盘，要求孕妇有完整的健康体检报告，不能有遗传疾病，感染性疾病及携带，在取材过程中严格按照无菌操作。所用的脐带、胎盘是必须在分娩或剖腹产后2小时之内。然后由专业人员用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水清洗血污，放入无菌包装袋内。

无菌包装袋放入冷链运输箱中保持2-8℃，72小时之内运到实验室分离。

再次用含有青/链霉素（100U/ml/100μg/ml）和酮康唑（0.1mg/L）的生理盐水冲洗，选取活性好的部位，剥离组织块，并用无菌剪刀剪成1-3mm³的小块，每个50ml离心管内加入10ml小组织块和20ml消化液。先置于37℃恒温摇床中按照60-240rpm，摇动15-50分钟。

消化结束后，经100-200目筛网过滤，细胞滤液收集到新的50ml离心管，离心1200-1600转/分，离心10分钟，弃上清，PBS重悬，离心1200-1600转/分，离心10分钟弃上清，加10ml PBS重悬。进一步提纯采用羟乙基淀粉离心法，6%的羟乙基淀粉溶液与重悬细胞按1:5混合，2000rpm，10℃，20min离心，离心完毕后吸取上层到新的离心管中。按1：3比例加入PBS, 1200 rpm 5min，离心清洗两次，弃上清，用含有胎盘组织液的MSC培养基重悬，接种于T75细胞培养瓶内。过滤时剩余的组织块也接种到T75细胞培养瓶中。培养瓶放置在5% CO2，37℃的培养箱内进行培养。

待细胞形成克隆后，胰酶消化，稀释后重新接种，组织块在消化后也重新接种到瓶中。

冻存：细胞冻存1×106/支，每支1ml，冻存液采用10%DMSO、10%人血清白蛋白、30%羟乙基淀粉、50%MSC培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取。

三、鉴定

1.细胞污染源检测在分离操作过程中留取样品，进行常见细菌，厌氧菌，支原体检测内毒素检测。

a．吸取1ml样品加入2×YT固体培养基，分别设阳性，阴性对照，放37℃培养箱培养。一周后长出克隆判定为阳性，未长出克隆判定为阴性。

b．吸取1ml样品加入硫乙醇酸盐液体培养基，分别设阳性，阴性对照，放37℃培养箱培养。一周后培养基浑浊判定为阳性

2.流式细胞仪检测脐带、胎盘间充质干细胞的表面标记物。细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD44、CD90、CD34、CD73和HLA-DR抗体（上述抗体均购自BD公司）标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan (Becton Dickinson)。

表型结果显示，来源于脐带、羊膜、底蜕膜的梭形细胞的CD44、CD73和CD90均为阳性， CD34、CD45和HLA-DR类分子均为阴性。

Claims

1.本发明建立一种高效分离培养脐带、胎盘干细胞的方法：A.取材安全；B.冷链运输，全程监控，安全运输；C.进一步处理组织，挑选好的部位；D.组织消化液分散细胞；E.筛网过滤细胞，密度梯度离心进一步提纯细胞，保留组织块；F.用添加胎盘组织液的MSC培养基，37℃，5% CO2培养箱培养；G.传代或冻存细胞；H.质量安全、生物学效力检测，保障培养安全、细胞纯度及增殖分化能力。

2.根据权利要求1的方法，其步骤A，所用脐带、胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘；产妇必须经过健康体检，无遗传病、感染性疾病或携带者，以及其他疾病，严格无菌操作；脐带、胎盘必须新鲜（0-2小时内）。

3.根据权利要求1的方法，其步骤B,将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，清洗液可以是含有青链霉素和咪康唑的生理盐水；脐带、胎盘全程冷链运输，全程监控，安全运输指将胎盘放入脐带、胎盘保存液中，低温冷链全程监控快速运输到实验室，即到即处理（0-72小时），提高安全等级，做到安全效率。

4.根据权利要求1的方法，其步骤C，用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗脐带、胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，最后一次用纯净的PBS冲洗，选取质量较好部分，剥离组织块，这样保证我们培养的细胞更加安全、活力高。

5.根据权利要求1的方法，其步骤D,将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在新的PBS溶液中，不含抗生素和胎牛血清，避免造成残留，组织消化液37℃摇床，b.室温静置；c.2-8℃静置冷消化，多元化消化处理，样本再多，一样可以保证效率。

6.根据权利要求5的方法，组织消化液指以下一种或几种成分：胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA，比单一酶消化效率高。

7.根据权利要求6的方法，各种酶的浓度可以是：胰蛋白酶0.05-0.25%，胶原酶Ⅱ0.05-0.3%，胶原酶Ⅳ0.05-0.3%，分散酶0.1-2.4u/ml，EDTA0.005-0.1%。

8.根据权利要求1的方法，其步骤E，消化液经筛网过滤，PBS冲洗，去除杂细胞，挑选单细胞，进一步提纯可以用羟乙基淀粉离心法也可以用Ficoll离心法；未完全消化的组织块不研磨，用PBS重悬，一起离心，避免研磨对细胞造成更大的损伤。

9. 根据权利要求1的方法，其步骤F，用添加胎盘组织液的无血清培养基；胎盘组织液含有多种因子，正是胎盘细胞原始的生长环境，将细胞和组织块分瓶，37℃，5% CO2培养箱培养，缩短培养时间。

10.根据权利要求9的方法，待细胞瓶组形成克隆后，胰酶消化，以一定密度重铺或作传代处理，组织块瓶组克隆消化处理，剩余组织块半量换液重贴，既不浪费培养基也利于细胞增殖。

11.根据权利要求1的方法，其步骤G，克隆增多，选择传代或冻存处理，每一次操作完成都对样本进行安全监测。

12.根据权利要求1的方法，其步骤H，对细胞进行生物安全、生物学效力及表型检测，并做数据归档，从源头到结束全部保证安全、有条理。