CN105238748A - 一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，本发明制备方法在胎盘采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者，最终选择男婴作为采集目标，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的中间品进行一系列质量检测包括母源检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低，细胞生物学功能完整。本发明获得的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞成分单一，又拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现间充质干细胞的临床标准产品，再者壁蜕膜从起源上来自于母亲，更加适合母亲自体使用。
Description
技术领域
本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法。
背景技术
干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
蜕膜间充质干细胞(Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具有间充质干细胞一般表型及分化潜能外,还具有低免疫原性等独特性质,是一种多能基质细胞。蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境,而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用,如T细胞、NK细胞及DC等,发挥其在胚胎植入、免疫耐受建立及正常妊娠维持中的重要作用。目前蜕膜间充质干细胞已经应用于再生治疗,具有较高的临床应用价值。
蜕膜间充质干细胞(DMSC)与人脐带间质干细胞UCMSC相比，都来源于废弃组织，取材方便、不对人体造成伤害、不涉及伦理道德问题，且免疫原性低、具有免疫抑制性，可以抑制其他细胞引起的免疫反应，减缓移植物抗宿主病，分泌多种细胞因子，抑制炎症反应、细胞凋亡，具有造血支持作用，表达间充干细胞标记。但DMSC具有更强的跨系分化能力，能分化成外、中、内胚层细胞，表达部分胚胎干细胞标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、COT4、REX-1、TRA-1-61)，有人称DMSC为亚全能干细胞，其发育阶段上与胚胎干细胞接近。相对于骨髓间充质干细胞(BMMSC)，DMSC增殖迅速、更强的长期增殖能力、多系分化能力更佳。并且，DMSC可以和UCMSC一样进行深低温保存，可用于建立细胞库，而骨髓来源MSC却很难实现。
胎盘壁脱膜中含有丰富的间充质干细胞，易于体外分离培养，细胞数量更多，体外可大量扩增，缩短细胞培养的时间，取材方便，且具有多向分化潜能，因而具有更大的临床应用价值，是细胞移植治疗和组织工程学的良好来源。
壁蜕膜作为母胎组成部分之一，跟其他间充质干细胞一样，符合2006年国际干细胞协会发表的间充质干细胞的特性。贴壁生长，流式指标合格，具有成骨、成脂、成软骨的能力。此外壁脱膜细胞还能产生某些免疫抑制因子而使其具有免疫抑制效应，不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境，而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用，从而对胎儿成长发育免疫受排斥起着至关重要的作用。
目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。
但目前公开的各类胎盘间充质干细胞制备方法虽均能获得间充质干细胞，但都不一定为母源性，也不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的临床标准产品。
发明内容
针对现有技术缺陷，本发明提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，本发明制备方法在胎盘采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，且采集男婴胎盘，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。
本发明提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，所述制备方法为：
A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁蜕膜剪成小块置于离心管中；
B、使用胶原酶对离心管中的壁蜕膜进行消化；
C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞，将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；
E、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：液氮取出冷冻细胞，复苏，复苏后洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
优选地，步骤A中，所述胎盘为经过筛选、采集的健康足月男婴胎盘，分离获得的胎盘需置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行处理。
优选地，所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等。
所述壁蜕膜组织来自母体。
优选地，所述步骤A中，将撕下的壁蜕膜剪成1～4mm3的小块。
优选地，所述步骤B中，使用浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶对壁蜕膜进行消化，消化温度37℃，消化1小时，恒温振荡。本发明采用浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶对壁蜕膜进行消化，操作过程比较简单方便，且其消耗组织块用时少，缩短了细胞培养时间及培养周期，且从获取细胞数量上讲也有大量研究数据表明其数量较多。
优选地，所述步骤C中，采用输血器滤网进行过滤，所述在完全培养基中培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度环境；所述胰蛋白酶的浓度为0.125％，由0.25％成品胰酶稀释1倍制成。本发明中用的是浓度为0.125％的胰蛋白酶，研究表明在其他条件相同的情况下，浓度为0.125％的胰蛋白酶在细胞贴壁生长的环境下的其消化能力达到最强，细胞也不会受到相应的影响。
优选地，所述输血器滤网孔径≤17μm，总有效过滤面积为24-34厘米可以滤除血液和血液成分制品中可能存在的聚集的血小板、白细胞和纤维蛋白；所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10％，谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。
优选地，所述步骤D中，对收集的细胞统计细胞数和细胞活率，并对细胞上清进行无菌检测、支原体检测；以及对间充质干细胞进行表面标志、分化检测。
优选地，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
优选地，所述对间充质干细胞进行表面标志、分化检测具体为：按照间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代间充质干细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定。
优选地，所述阳性指标如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等；所述阴性指标如CD19、CD14、CD34、CD45、HLA-DR。
优选地，所述步骤E中，复苏条件为40℃，2min；复苏后用生理盐水300g,洗涤两次每次10min。
优选地，步骤D中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10％。
本发明制备的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞通过PCR扩增Y染色体上的一段保守序列SRY来鉴定性别，确定为壁蜕膜来源。
本发明所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法的优点在于从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的临床标准产品。胎盘源壁蜕膜间充质干细胞冷冻也使得自体胎盘源壁蜕膜间充质干细胞能够较长时间在体外保存，从而选择最佳时间进行胚胎植入和正常妊娠的维持，也为细胞库的建立提供丰富资源资源。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、全过程全面质量监控，从胎盘采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；
2、无血清培养基，不使用抗生素，为在含有细胞所需营养和贴壁因子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞良好生长和提高细胞培养质量的同时，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险；
3、规模化培养，保证细胞均一性和有效性；
4、低浓度胰酶消化，保持细胞的活性及干细胞的干性；
5、干细胞表面标志检测的阳性指标表达率99％以上，阴性指标2％以下。
6、本发明方法获得间充质干细胞为母源，采集为男婴胎盘，通过PCR扩增Y染色体上的一段保守序列SRY来鉴定性别，确定为壁蜕膜来源。尤其适合母亲自己使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为人胎盘源壁蜕膜间充质干细胞形态图；
图2为人胎盘源壁蜕膜间充质干细胞确定母源PCR图；
其中，图2-a中，泳道1为marker；泳道2为阳性对照HDF，男性上皮细胞；泳道3为阴性对照MenSC，女性宫内膜干细胞；泳道4为包蜕膜细胞；泳道5为壁蜕膜细胞；泳道6为平滑绒毛膜细胞；泳道7为绒毛膜细胞；泳道8为羊膜细胞；泳道9为脐带细胞；
图2-b中，泳道1为marker；泳道2为壁蜕膜细胞；泳道3包蜕膜细胞；泳道4为平滑绒毛膜细胞；泳道5为羊膜细胞；泳道6为阳性对照HDF，男性上皮细胞；泳道7为为阴性对照MenSC，女性宫内膜干细胞；
图2-c中，泳道1为marker；泳道2为阳性对照HDF，男性上皮细胞；泳道3为阴性对照MenSC，女性宫内膜干细胞；泳道4为壁蜕膜细胞；泳道5为包蜕膜细胞；泳道6为平滑绒毛膜细胞；泳道7为绒毛膜细胞；泳道8为羊膜细胞；
图3为冷冻前的壁蜕膜间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞显微镜下效果图；
图4为冷冻后壁蜕膜间充质干细胞分化为成脂、成骨、成软骨细胞在显微镜下镜片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、胎盘筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者男婴胎盘1号，置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、胎盘分离：将胎盘转移到培养皿中，生理盐水清洗；剥离壁蜕膜；将撕下
的壁蜕膜置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；
步骤三、使用Ⅱ型胶原酶，消化温度37℃，1小时，恒温振荡。
步骤四、间充质细胞原代培养：使用输血器滤网进行过滤，洗涤后将细胞装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
步骤五、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤六、间充质干细胞表面标志、分化检测：取1×107细胞做细胞表面标志检测，按照间充质干细胞标准检测CD29、CD73、CD90、CD105五个阳性指标以及CD19、CD14、CD34、CD45、HLA-DR五个阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；
步骤七、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：液氮取出冷冻细胞，40℃，2min复苏，复苏后用生理盐水300g，洗涤两次，每次10min，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
实施例1制备的人胎盘源壁蜕膜间充质干细胞形态图如图1-实施例1所示，其确定母源PCR图如图2-a所示。从图2的组织鉴定结果说明胎盘壁蜕膜组织来源于母体，其他组织来源于子体或混有子体组织。图3所示冷冻前的壁蜕膜间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞显微镜下效果图表明：1)从成脂图可知，有脂肪细胞的特性。在显微镜下观察，在漩涡状排列的细胞集落中央，可观察到散在的充满脂滴的脂肪细胞形成，细胞形态呈短梭形或圆形，油红O染色显色显示脂滴为红色。2)从成骨图可知，在显微镜下观察，较诱导前细胞从长梭形变成为不规则的多角形，多角形的细胞聚集成团，可以观察到较大的细胞结，显现出典型的成骨细胞的特性。3)从成软骨图可知，阿新蓝染色呈阳性，说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能，在显微镜下表现细胞体积较大，呈鳞片状，胞浆丰富，以及有明显的软骨组织细胞陷窝及胶原基质成分。图4为冷冻后壁蜕膜间充质干细胞分化为成脂、成骨、成软骨细胞在显微镜下镜片图，跟冷冻前对比细胞结构没有发现明显变化。
实施例2
本实施例提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、胎盘筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者男婴胎盘2号，置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、胎盘分离：将胎盘转移到培养皿中，生理盐水清洗；剥离壁蜕膜；将撕下的壁蜕膜置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；
步骤三、使用Ⅱ型胶原酶，消化温度37℃，1小时，恒温振荡。
步骤四、间充质细胞原代培养：使用输血器滤网进行过滤，洗涤后将细胞装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
步骤五、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤六、间充质干细胞表面标志、分化检测：取1×107细胞做细胞表面标志检测，按照间充质干细胞标准检测CD29、CD44、CD73、CD90、CD105五个阳性指标以及CD19、CD14、CD34、CD45、HLA-DR五个阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；
步骤七、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：液氮取出冷冻细胞，40℃，2min复苏，复苏后用生理盐水300g，洗涤两次，每次10min，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
实施例1制备的人胎盘源壁蜕膜间充质干细胞形态图如图1-实施例2所示，其确定母源PCR图如图2-b所示。从图2的组织鉴定结果说明胎盘壁蜕膜组织来源于母体，其他组织来源于子体或混有子体组织。
实施例3
本实施例提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、胎盘筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者男婴胎盘3号，置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、胎盘分离：将胎盘转移到培养皿中，生理盐水清洗；剥离壁蜕膜；将撕下的壁蜕膜置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；
步骤三、使用Ⅱ型胶原酶，消化温度37℃，1小时，恒温振荡。
步骤四、间充质细胞原代培养：使用输血器滤网进行过滤，洗涤后将细胞装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
步骤五、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
步骤六、间充质干细胞表面标志、分化检测：取1×107细胞做细胞表面标志检测，按照间充质干细胞标准检测CD29、CD44、CD73、CD90、CD105五个阳性指标以及CD19、CD14、CD34、CD45、HLA-DR五个阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；
步骤七、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：液氮取出冷冻细胞，40℃，2min复苏，复苏后用生理盐水300g，洗涤两次，每次10min，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
实施例1制备的人胎盘源壁蜕膜间充质干细胞形态图如图1-实施例3所示，其确定母源PCR图如图2-c所示。从图2的组织鉴定结果说明胎盘壁蜕膜组织来源于母体，其他组织来源于子体或混有子体组织。
性能测试
对实施例1～3制备的间充质干细胞进行临床标准检测，检测结果如表1和表2所述：
表1冷冻前检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 人类免疫缺陷病毒 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| HIV-RNA荧光定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| HTLV-Ⅰ/Ⅱ型抗体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙肝表面抗原定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙肝表面抗体定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙肝e抗原定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙肝e抗体定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 乙肝核心抗体定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 丙肝病毒抗体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 丙肝病毒RNA定性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| CMV-IgM抗体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 梅毒螺旋体特异抗体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 细菌、真菌血培养 | 无菌生长 | 无菌生长 | 无菌生长 |
| 支原体培养 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 内毒素检测 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| CD29 | 99.82％ | 99.94％ | 99.92％ |
| CD73 | 99.08％ | 99.10％ | 99.34％ |
| CD90 | 99.69％ | 99.95％ | 99.83％ |
| CD105 | 99.63％ | 99.86％ | 99.84％ |
| CD14 | 0.92％ | 0.97％ | 0.99％ |
| CD79a | 1.18％ | 1.26％ | 0.68％ |
| CD34 | 0.92％ | 0.88％ | 0.83％ |
| CD45 | 1.05％ | 1.22％ | 0.72％ |
| HLA-DR | 0.78％ | 0.80％ | 0.75％ |
| 细胞数 | 2.34×107 | 2.54×107 | 2.35×107 |
| 细胞活率 | 98％ | 96％ | 97％ |
| 细胞成脂分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
| 细胞成软骨分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
| 细胞成骨分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
表2冷冻复苏后的检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 细菌、真菌血培养 | 无菌生长 | 无菌生长 | 无菌生长 |
| 支原体培养 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 内毒素检测 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| CD29 | 98.65％ | 98.61％ | 98.68％ |
| CD73 | 98.01％ | 98.61％ | 98.11％ |
| CD90 | 98.81％ | 98.66％ | 98.86％ |
| CD105 | 98.04％ | 98.56％ | 99.04％ |
| CD14 | 0.86％ | 0.89％ | 0.82％ |
| CD79a | 0.99％ | 1.04％ | 0.56％ |
| CD34 | 0.74％ | 0.70％ | 0.65％ |
| CD45 | 0.95％ | 1.03％ | 0.63％ |
| HLA-DR | 0.68％ | 0.74％ | 0.71％ |
| 细胞数 | 2.28×107 | 2.47×107 | 2.29×107 |
| 细胞活率 | 97.5％ | 95.4％ | 96.7％ |
| 细胞成脂分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
| 细胞成软骨分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
| 细胞成骨分化鉴定 | 正常 | 正常 | 正常 |
用于鉴定间充质干细胞的表面标志有：CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD79a、CD34、CD45、HLA-DR等。本实验测定实验组细胞含CD29、CD34、CD45、CD105表面标志，说明壁蜕膜间充质干细胞符合ISCT间充质干细胞标准。
检测结果显示，本发明制备方法制备所得的间充质干细胞的各项标准均符合临床应用要求。且冷冻后的细胞数和细胞活率较冷冻前无明显下降。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁蜕膜剪成小块；
B、使用胶原酶对壁蜕膜进行消化；
C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞，将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm2，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，进行冷冻保存；
E、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：取出冷冻细胞，复苏，复苏后洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
2.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述胎盘为经过筛选、采集的健康足月男婴胎盘，分离获得的胎盘需置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行处理。
3.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，将撕下的壁蜕膜剪成1～4mm3的小块。
4.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，使用浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶对壁蜕膜进行消化，消化温度37℃，消化1小时，恒温振荡。
5.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，采用输血器滤网进行过滤，所述在完全培养基中培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度环境，所述胰蛋白酶的浓度为0.125％，由0.25％成品胰酶稀释1倍制成。
6.根据权利要求5所述的临床级胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述输血器滤网孔径≤170nm；所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10％，谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。
7.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤D中，对收集的细胞统计细胞数和细胞活率，并对细胞上清进行无菌检测、支原体检测；以及对间充质干细胞进行表面标志、分化检测。
8.如权利要求7所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述对间充质干细胞进行表面标志、分化检测具体为：按照间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代间充质干细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定。
9.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤E中，复苏条件为40℃，2min；复苏后用生理盐水300g，洗涤两次每次10min。
10.根据权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10％。
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