CN106244532A - 人源脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，包括脐带预处理和干细胞培养步骤，该方法简单、过程易于操作，在干细胞的培养过程，采用低氧的培养环境，干细胞培养基使用加有血清替代物和细胞因子IFN‑γ的无血清且不加入任何抗生素的培养基，可以有效促进干细胞增殖，从而有效的缩短培养时间，并能维持其表型特征，本发明的方法不仅提高了分离效率，缩短了培养周期，同时还获得了高纯度、安全性高、表征优良的脐带间充质干细胞。本发明适用于制备人源脐带间充质干细胞。

Description

人源脐带间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明属于干细胞制备技术领域领域，涉及一种人源脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞是具有自我复制和向各种细胞分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各组织器官的起源细胞。人类个体的发育过程实质上就是干细胞的自我更新和增殖分化的过程。在特定条件下，可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官。正是因为干细胞具有自我更新能力，能够修复、改善或取代损伤、缺失、病变、衰老的组织或器官，所以干细胞在疾病治疗上有着巨大的临床意义，其治疗的范围涉及肝硬化、脑瘫、糖尿病（足）、股骨头坏死、老年痴呆症、帕金森氏症、脊髓损伤、进行性肌营养不良、闭塞性脉管炎、心肌梗死、肾衰、免疫系统疾病等，在改善亚健康状态以及女性美颜抗衰老的领域中也蕴藏着巨大的商机。

脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含一条脐动脉、两条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ，从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人源脐带间充质干细胞。倒置显微镜下观察人源脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，低密度时较扁平，密度增加趋于融合时细胞变细长。

根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定的最低标准，脐带间充质干细胞如要应用于疾病的治疗领域，需满足以下条件：

1）在标准培养条件下呈贴壁生长；

2）高表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、 CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA2-DR；

3）在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。

比照上述条件，表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记，如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ等。另外，HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞的增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。

目前，现有的人源脐带间充质干细胞的制备通常是从脐带中获得华尔通氏胶，通过对干细胞组织的体外扩增培养，收获其干细胞，收获的P3-P5代的干细胞经一系列检验合格后方可作为外源输入人体内治疗某种疾病。目前，大多数人源脐带间充质干细胞的制备存在细胞的生长周期长、分离效率低、干细胞的活率低等缺点，在干细胞的传代培养过程中，培养条件是至关重要的，培养条件直接影响到了细胞的生长周期、分离效率、细胞的纯度和安全性。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种脐带间充质干细胞的制备方法，该方法简单、过程易于操作，在干细胞的培养过程，采用低氧的培养环境，改良的培养体系不仅提高了分离效率，缩短了培养周期，同时还获得了高纯度、安全性高、表征优良的脐带间充质干细胞。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，按照如下的步骤顺序进行：

（1）脐带预处理

将人源脐带预处理，剥离华尔通氏胶，将其处理为1-3mm³的组织块，用0.

9%氯化钠洗涤组织块并离心，弃上清；

（2）干细胞培养

①用移液管吸取上述离心后的组织块至培养瓶中，并使培养瓶中的组织块间隔1cm平铺于瓶壁；

②将步骤①的培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养30min后取出，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶中按照每毫升组织块加入10-15mL完全培养基，将培养瓶移至37℃、含有5%CO2和1%O₂的培养箱，培养3-4d换液一次；

③当细胞生长融合度超过80%时，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液，均匀浸湿细胞壁表面，室温条件下作用3-5min,待细胞从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入完全培养基终止消化；

④用移液管轻轻吹打剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶加入0.9%氯化钠吹洗2次，汇入离心管内，离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠合并沉淀至1管，取样计数，再次离心，弃上清；

⑤向步骤④再次离心得到的细胞中加入完全培养基，形成重悬细胞，接种于培养瓶中，使细胞浓度为3×10⁴-5×10⁴个/mL，将培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养2-3d;

⑥当细胞生长融合度超过80%后，得到人源脐带间充质干细胞，收集第一代细胞；

⑦重复上述①-⑥步骤两次，分别收集第二代细胞和第三代细胞，将每代细胞冻存备用。

作为本发明的一种限定，所述冻存步骤按照如下的步骤顺序进行：

1）在生物安全柜中，用移液管取人充质干细胞血清替代物溶液，缓慢加入到人源脐带间充质干细胞条件培养基中，混匀，得A；

2）在生物安全柜内取DMSO置于离心管内,用移液管取A, 加入离心管内，吹打混匀，得冻存液B;

3）检测冻存液B，当培养结果是阴性，冻存液合格；

4）取需要冻存的细胞，75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，放入生物安全柜内，取培养瓶内的细胞培养上清进行检测，检测细胞无杂菌污染后，该细胞可冻存使用；

5）用移液管去除培养瓶中的上清，向培养瓶中加入0.9%氯化钠，摇晃、洗涤细胞生长面，弃去洗涤液，重复操作2次；向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液，室温条件下作用3-5min，待细胞从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入完全培养基，终止消化；

6）用移液管轻轻吹打培养瓶中剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到离心管中，培养瓶加入0.9%氯化钠，吹洗2次，导入同一离心管内；离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠合并沉淀至1管，再次离心，弃上清；

7）向最终离心后的细胞内加入冻存液B，形成浓度为0.8×10⁷-1×10⁷个/mL的细胞冻存液，将该液分装于冻存管内，放入程序降温盒内，于－80℃过夜，第二天移入液氮中保存。

作为本发明的进一步限定，

所述完全培养基为含有血清替代物和细胞因子IFN-γ的无血清培养基；

所述步骤2）中，DMSO与A的体积比为1:9。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

①干细胞培养基使用加有血清替代物和细胞因子IFN-γ的无血清培养基，该培养基不加入任何抗生素，可以有效促进干细胞增殖，从而有效的缩短培养时间，并能维持其表型特征；

②在干细胞传代培养的过程中，收获的P1-P3代干细胞细胞数量高（1×10⁶-1.5×10⁶个/mL），活率在97%以上；

③干细胞的传代培养均在低氧环境中培养，培养的条件更利于干细胞的增殖。

本发明适用于制备人源脐带间充质干细胞。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1为实施例1的干细胞组织块于低氧环境中7天时铺瓶的细胞状态图；

图2为实施例1收获的P1代细胞于低氧的环境中在培养瓶中的状态图；

图3为实施例1收获的P3代细胞于低氧的环境中在培养瓶中的状态图；

图4为实施例3中脐带间充质干细胞的细胞计数的形态、大小、细胞活性和细胞数量的结果图；

图5为实施例3中脐带间充质干细胞干细胞革兰氏染色的结果图；

图6为实施例3中脐带间充质干细胞干细胞支原体检测凝胶成像的结果图（其中，从左到右的条带依次是：P1代细胞、P2代细胞、P3代细胞、P4代细胞、阳性模板、Marker）；

图7为实施例3中脐带间充质干细胞干细胞成脂、成骨的检测结果图（其中，7a-成骨未分化染色图，7b-成骨分化染色图,7c-成脂染色前状态图，7d-成脂染色后状态图）；

图8为实施例3中Oct4、SOX2、Nanog、Nestin四个基因在脐带间充质干细胞和正常肝细胞中的表达结果图（其中，8a-Oct4基因在间充质干细胞中高表达，8b-SOX2基因在间充质干细胞中高表达,8c-Nanog基因在间充质干细胞中高表达,8d-Nestin基因在间充质干细胞中高表达）；

图9为实施例3中脐带间充质干细胞流式检测结果图(其中，9a-抗原表面标记物CD73,表达百分比为99.53%;9b-抗原表面标记物CD90,表达百分比为99.4%；9c-抗原表面标记物CD105,表达百分比为99.13%；9d-抗原表面标记物CD34,表达百分比为0.15%；9 e-抗原表面标记物HLA-DR,表达百分比为0.07%；9f-抗原表面标记物CD45，表达百分比为0.05%)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、组分等，如无特殊说明，均可从商业渠道购买。

实施例1 人源脐带间充质干细胞的制备方法

本实施例为一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：

（1）脐带预处理

①在无菌环境中，将脐带置于加有0.9%氯化钠注射液的无菌储存瓶中，送往实验室进行分离制备，如有运输需要，运输温度控制在4-20℃，运输时间不超过6h；

②脐带储存瓶用75%酒精擦拭，并放入生物安全柜中,取10mL保存液接种BD需氧培养瓶,经检测脐带无杂菌后可进行下述步骤;

③在细胞培养皿中用0.9%氯化钠注射液充分洗涤脐带3-6次，将脐带两端各剪去1cm长度，废弃，再洗涤脐带组织2-4次，其中，洗涤液为不加入任何抗生素的0.9%的氯化钠注射液；

④将洗涤的脐带剪成4-5cm长度的小段，洗涤3次，转移脐带组织至新的培养皿中，培养皿中加0.9%氯化钠注射液至淹没脐带组织的1/2，组织剪顺着脐静脉剪开，用弯头止血钳一点点去除静脉膜，撕去脐带的两根动脉和外膜，取华尔通氏胶置于离心管内；

⑤剪碎离心管内的华尔通氏胶至1-3mm³，向其中加入0.9%氯化钠注射液45mL，洗涤组织块，离心，取500μL上清接种细菌真菌培养皿，检测其是否有其它杂菌，若无杂菌，则进行后续的步骤，弃上清；

（2）干细胞培养

①用移液管吸取组织块0.3-0.5mL，打入T75CM2培养瓶（T75CM²为培养瓶的规格，生产厂家为美国的Corning公司）中，用5mL移液管平铺T75CM²培养瓶中的组织块，每个组织块的间距控制在1cm左右；

②将步骤①的培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养30min后取出，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶中按照每毫升组织块加入10-15mL完全培养基；

将培养瓶移至37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中培养， 3-4d培养瓶换液一次，每次换液时取500μL培养上清接种细菌真菌培养皿，检测是否有杂菌污染，如无污染则继续下述步骤；

③当细胞生长融合度超过80%时，将培养瓶外壁用75%酒精消毒后置于生物安全柜内，去除培养瓶内的组织块，向培养瓶内加入0.9%氯化钠注射液10mL，摇晃、洗涤细胞生长面，弃去洗涤液，重复操作2次；

向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液6mL，均匀浸湿细胞壁表面，室温条件下作用3-5min, 显微镜下观察细胞待细胞变圆后从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入等体积完全培养基终止消化；

④用移液管轻轻吹打剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶加入0.9%氯化钠注射液10mL,吹洗2次，汇入离心管内;

离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠注射液45mL合并沉淀至1管，取样计数，再次离心，弃上清；

⑤向步骤④再次离心得到的细胞中加入完全培养基40mL，形成重悬细胞，接种于G-REX100L培养瓶（其中，G-REX100L为培养瓶的规格型号，该培养瓶的生产厂家为美国的wilfon wolf公司）中，使细胞浓度为3×10⁴-5×10⁴个/mL，取500μL重悬细胞接种进行细菌、真菌检测，若重悬细胞中无杂菌，则进行后续步骤；

将培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养2-3d;

⑥观察细胞，当细胞生长融合度超过80%后，得到人源脐带间充质干细胞，收集第一代细胞；

⑦重复上述①-⑥步骤两次，分别收集第二代细胞和第三代细胞，其中每次传代都要进行细菌、真菌、内毒素、支原体、PCR检测，检测合格后该代的细胞才可使用，将每代细胞冻存备用；

当然，也可根据实际需要重复上述①-⑥步骤三或四，收集P4和P5代细胞。

冻存前先对冻存所需的试剂进行细菌、真菌检测，合格后方可使用。

下面为细胞的冻存过程：

Ⅰ.在冻存过程中，每一批次采购的试剂都需要取5mL接种需氧培养瓶，检测是否有细菌污染。

每瓶培养基需要提前48小时配置取5mL,接种需氧检测瓶，结果合格后才可以正常使用。

Ⅱ.所需试剂如下：

人间充质干细胞条件培养基，500mL/瓶，4℃保存；

人间充质干细胞血清替代物，50mL/支，-20℃保存；

DMSO（二甲基亚砜），500mL/瓶，常温下保存；

Ⅲ.冻存步骤按照如下的步骤顺序依次进行：

1）取人间充质干细胞血清替代物一支，常温融化，在生物安全柜中，用移液管取人充质干细胞血清替代物，缓慢加入到人源脐带间充质干细胞条件培养基中，混匀，得A；

2）以50mL冻存液为例，在生物安全柜内取5mL DMSO置于离心管内,用移液管取45mL A,加入离心管内，吹打混匀，得冻存液B，-20℃保存备用；

3)取500μL冻存液B接种细菌真菌检测，当培养结果是阴性，冻存液合格，可以使用；

4）取需要冻存的细胞，75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，放入生物安全柜内，取培养瓶内的细胞培养上清300μL，接种于细菌真菌培养皿内,检测细胞无杂菌污染后，该细胞可冻存使用；

5）用移液管去除培养瓶中的上清，向培养瓶中加入0.9%氯化钠25mL，摇晃、洗涤细胞生长面，弃去洗涤液，重复操作2次；

向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液15mL，室温条件下作用3-5min，显微镜下观察细胞待细胞变圆后从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入等体积的完全培养基，终止消化；

6）用移液管轻轻吹打培养瓶中剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到离心管中，培养瓶加入0.9%氯化钠20mL，吹洗2次，导入同一离心管内；

离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠注射液45mL合并沉淀至1管，再次离心，弃上清；

7）向最终离心后的细胞内加入冻存液B，形成浓度为0.8×10⁷-1×10⁷个/mL的细胞冻存液，将该液分装于冻存管内，放入程序降温盒内，于－80℃过夜，第二天移入液氮中保存。

本实施例中的完全培养基为含有血清替代物和细胞因子IFN-γ的无血清培养基，其中，细胞因子IFN-γ按照每毫升完全培养基添加10ng；

条件培养基为现有技术中的条件培养基。

本实施例中所使用的溶液含量均为质量浓度，气体含量均为体积百分数。

本实施例中各步骤的细菌真菌检测实验步骤如下：

把待检的加有上清的培养皿放入27℃和37℃生化培养箱中，培养48h，分别在24 h和48h点处计菌落数，一般以48h菌落为准；

在细胞每次传代检测时分别取3个5mL细胞上清，一个接种需氧检测瓶，一个送支原体检测和内毒素检测。

本实施例中的制备方法简单、过程易于操作，细胞培养的时间大大缩短，P3代细胞可在2-3d内即可收获，收获的P1-P3代干细胞细胞数量高（1×106-1.5×106个/mL），活率均在97%以上。

实施例2 不同生长天数下的干细胞生长状态检测

本实施例对实施例1人源脐带间充质干细胞的制备方法中不同生长天数下的干细胞进行了状态检测，具体的检测结果如图1-图3所示，由图1可知组织块铺瓶在低氧环境中7天可铺满整个瓶子，从图2可以看出，P1代细胞于低氧环境在G-REX100L培养瓶中培养两天即可长满，从图3可以看出，P3代细胞于低氧环境中在G-REX100L培养瓶中培养，状态良好。

实施例3 人源脐带间充质干细胞的结果表征

本实施例对实施例1制备的各代的人源脐带间充质干细胞进行了结果表征，具体如下：

1.细胞计数及活率检测

取10μL干细胞的细胞悬液与10μL台盼蓝按照体积比为1:1混合均匀，将10μL混合液加入计数玻片，插入全自动细胞计数仪（life，countess II），调焦至最清晰，记录活细胞数，死细胞数和细胞活率，同时配合显微镜计数进行对比。

细胞计数和活率结果如图4所示，结果表明，细胞的形态正常，细胞数达到1×10⁶-1.5×10⁶个/mL,细胞的活率在97%以上，由此证明，本发明的制备方法培养效率较高，培养的细胞形态、活率和细胞数都到达了较高的培养水平。

细菌真菌检测

提前两天配置TSA培养基：40gTSA培养基，加热溶于1000mL去离子水中，分装于3个500mL锥形瓶中，121℃、15min灭菌，取30个新康一次性培养基，外包装用75%酒精消毒放入超净台备用，培养基稍微冷却以后分装平板，用封口膜封住，装入灭菌袋，放入4℃冰箱备用。

对脐带间充质干细胞进行细菌、真菌的检测时，将每次收获的脐带间充质干细胞分别接种到两个培养平板中，分别放置37℃培养箱和27℃培养箱，观察48h，查看有无细菌和真菌污染。经检测，未见有细菌和真菌污染。

血培养仪鉴定

为了保证细胞生产不受真菌细菌的感染，对培养的细胞进行BD细菌培养鉴定，经鉴定，未见有细菌污染培养细胞。

支原体检测

收集1.5mL的脐带间充质干细胞进行支原体鉴定，将1.5mL细胞用400g离心5min，将上清取出移至无菌离心管以17000g速度离心10min，以沉淀支原体；

小心地移除上清液，保留沉淀，重新用50μl缓冲液混合彻底；

将上述混合液加热到95℃，持续3min，向其中加入35μL的DEPC水和10μL的反应混合物MIX和5μL的制备待检测样本。通过PCR扩增仪完成35个循环的扩增，通过凝胶成像系统来观察是否产生一个230bp左右的片段。假如产生荧光片段则证明培养细胞遭到支原体污染。

支原体检测结果如图6所示，结果表明，细胞培养过程中未存在支原体污染，细胞的生长状态良好。

内毒素检查

取出1.5mL细胞培养混合液做内毒素检测，将内毒素检测试剂盒取出，取一支内毒素标准品用内毒素检测用水配置成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为内毒素检测的灵敏度）的内毒素标准品。

在8支鲎试剂内加入1mL的内毒素检测用水配置成工作品备用(配置完成10min内使用)。分别作阳性，阴性，检测品阳性，检测品。每组做平行样本。阳性品2λ内毒素工作标准品，阴性为内毒素检测用水，检测品阳性为2λ工作标准品和检测品混合液，检测品为细胞培养混合液。

37℃水浴60±2min，观察是否有凝集现象，即将检测管180°倒转凝集快不滑落为阳性，其余现象为阴性。

经检测，细胞培养过程中未存在内毒素污染，细胞的培养环境良好。

免疫表型分析

收集脐带间充质干细胞, 进行免疫表型检测。取1mL 脐带间充质干细胞于1000r/min离心5min;

用PBS洗涤细胞后, 用FITC标记的 CD90，PE标记的CD105，APC标记的CD73, 用FITC标记的 HLA-DR，PE标记的CD34，APC标记的CD45, 孵育细胞15 min, 加入PBS 200μL, 用流式细胞仪（以上流式细胞仪和所用的抗体均购买来自美国的BD Biosciences公司）进行检测。

流式细胞检测结果如图9所示，结果表明，高表达：CD90、CD105、CD73 ，低表达：HLA-DR、CD34、CD45，通过对这一表达结果的分析，这与脐带间充质干细胞相关表面标志一致，而通过改进培养方法后的CD90、CD105、CD73全部的表达到达99%以上，而HLA-DR、CD34、CD45表达极低不超过1%。

因此判断制备的脐带间充质干细胞是较高质量的间充质干细胞。

分化潜能鉴定

①向成骨细胞诱导分化：以每孔3×10⁴cells/cm²的密度接种到24孔板，每孔加入0.5mL MSC NutriStem® XF，接种6X10⁴细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。培养24h后，当细胞融合度达到80%时，将MSC NutriStem® XF培养基吸除，每孔加入0.5mL成骨分化培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养10-21d，每2-3d换液一次。

成骨评价：使用Von Kossa染色检测钙化基质沉淀。

成骨诱导分化结果：定向诱导干细胞成骨分化实验中可见细胞间充满黑色颗粒，大小不均一，提示有矿化基质沉淀，具有向成骨细胞分化的能力，说明本发明制备出的脐带间充质干细胞具有良好的成骨份化能力。

②向脂肪细胞诱导分化：以每孔3×10⁴cells/cm²的密度接种到24孔板，每孔加入0.5mL MSC NutriStem® XF，接种6×10⁴细胞，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。培养24h后，当细胞融合度达到80%时，将MSC NutriStem® XF培养基吸除，每孔加入0.5mL成脂分化培养基，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养10-21d，每2-3d换液一次。成骨评价：使用油红O染色检测细胞内的脂滴颗粒。

成脂诱导分化结果：定向诱导干细胞成脂分化实验中，在倒置显微镜下可见细胞浆中含有脂肪空泡，说明本发明制备出的脐带间充质干细胞具有良好的成脂份化能力。

上述结果具体见图7。

细胞革兰氏染色

为保证细胞质量，检测细胞培养过程中是否有细菌污染，在每次输注前进行革兰氏染色。

取干细胞悬液两滴，滴入载玻片，自然干燥后的标本面向上迅速通过火焰数次，滴加龙胆紫染液2滴于涂布细胞悬液处，覆盖悬液表面，10s后以细水漫过轻洗，流下的水无颜色为止，将积水甩干。

滴加碘溶液同上，10s后水洗，将标本片上的积水甩净。加脱色液数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，直至无紫色脱下为止，冲洗甩干。

用油镜观察，观察标本中是否有被染成紫色和/或红色的细菌，记录实验结果。

革兰氏检测结果见图5，结果表明，干细胞培养没有受到革兰氏阴性和阳性真菌细菌的污染。

干细胞表达-PCR

a）离心收集P₃代细胞加入TRpure试剂中，用移液枪反复吹打来的裂解细胞。每5×10⁶的间充质干细胞加入1mL的TRpure；

b）将吹打后的干细胞剧烈震荡，在室温条件下放置5min以使核蛋白完全解离;

c）1.5mL离心管中，每1mL TRpure加0.2mL氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下放置2-3min；

d）在4℃、12000rpm的离心力下冷冻离心10-15min，离心后分为三层，取中间层和上层无色的水样，将水样转移到一干净的离心管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温放置10min，在4℃ 12000rpm离心10分钟，弃上清；

e）加入1mL的75%乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心3min，弃上清，放置3min，加入100μLRNase free water，充分溶解RNA；

f）将提取的RNA反转录成DNA，进行荧光定量PCR。检测Oct4、Nonog、Sox2、Nestin四个基因在脐带间充质干细胞中的表达。

PCR检测见图8，其中LO2为正常肝细胞，MSCs为间充质干细胞。结果表明，脐带间充质干细胞的基因Oct4、Nonog、Sox2、Nestin四个基因在干细胞中的表达比正常体细胞的表达高，说明实施例1提供的脐带间充质干细胞具有良好的干细胞表达系统。

实施例4 人源脐带间充质干细胞复苏回输

本实施例为对实施例1提供的人源脐带间充质干细胞复苏回输步骤，它按照如下的步骤顺序进行：

1)将实施例1的液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅中轻轻晃动，直到冻存液完全溶解；

2)用75%乙醇擦拭冻存管，无尘纸擦干，在生物安全柜内将冻存管中细胞悬液移至50mL离心管中，加入4℃预冷0.9%氯化钠注射液，稀释、吹打、洗涤，合并细胞须为同一批号，50mL离心管中加入4℃预冷0.9%氯化钠注射液，稀释定溶；

3)洗涤离心，弃上清，合并2-3个离心管细胞至1个50mL离心管中，加入4℃预冷0.9%氯化钠注射液，定容45mL,轻轻吹打混匀，离心、洗涤，各重复2次；

4)从100mL袋装0.9%氯化钠注射液中抽出30mL重悬细胞，300目滤网过滤细胞悬液，用50mL无菌注射器抽取注入0.9%氯化钠注射液袋中，并用5mL无菌注射器取5mL人血白蛋白注入0.9%氯化钠注射液袋中保存活率；

5)取300μL步骤4)的细胞悬液，接种细菌真菌检测，取1mL细胞悬液留样,500μL计数，取1mL革兰氏染色，封口，贴标签，回输。

实施例1，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于按照如下的步骤顺序进行：

（1）脐带预处理

将人源脐带预处理，剥离华尔通氏胶，将其处理为1-3mm³的组织块，用0.9%氯化钠洗涤组织块并离心，弃0.9%氯化钠上清；

（2）干细胞培养

①用移液管吸取上述离心后的组织块至培养瓶中，并使培养瓶中的组织块间隔1cm平铺于瓶壁；

②将步骤①的培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养30min后取出，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶中按照每毫升组织块加入10-15mL完全培养基，将培养瓶移至37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱，培养3-4d换液一次；

③当细胞生长融合度超过80%时，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液，均匀浸湿细胞壁表面，室温条件下作用3-5min,待细胞从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入完全培养基终止消化；

④用移液管轻轻吹打剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶加入0.9%氯化钠吹洗2次，汇入离心管内，离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠合并沉淀至1管，取样计数，再次离心，弃上清；

⑤向步骤④再次离心得到的细胞中加入完全培养基，形成重悬细胞，接种于培养瓶中，使细胞浓度为3×10⁴-5×10⁴个/mL，将培养瓶置于37℃、含有5%CO₂和1%O₂的培养箱中，培养2-3d;

⑥当细胞生长融合度超过80%后，得到人源脐带间充质干细胞，收集第一代细胞；

⑦重复上述①-⑥步骤两次，分别收集第二代细胞和第三代细胞，将每代细胞冻存备用。

2.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述冻存步骤按照如下的步骤顺序进行：

1）在生物安全柜中，用移液管取人间充质干细胞血清替代物溶液，缓慢加入到人源脐带间充质干细胞条件培养基中，混匀，得A；

2）在生物安全柜内取DMSO置于离心管内,用移液管取A, 加入离心管内，吹打混匀，得冻存液B;

3)检测冻存液B，当培养结果是阴性，冻存液合格；

4）取需要冻存的细胞，75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，放入生物安全柜内，取培养瓶内的细胞培养上清进行检测，检测细胞无杂菌污染后，该细胞可冻存使用；

5）用移液管去除培养瓶中的上清，向培养瓶中加入0.9%氯化钠，摇晃、洗涤细胞生长面，弃去洗涤液，重复操作2次；向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液，室温条件下作用3-5min，待细胞从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入完全培养基，终止消化；

6）用移液管轻轻吹打培养瓶中剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液；将细胞悬液转移到离心管中，培养瓶加入0.9%氯化钠，吹洗2次，导入同一离心管内；离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠合并沉淀至1管，再次离心，弃上清；

7）向最终离心后的细胞内加入冻存液B，形成浓度为0.8×10⁷-1×10⁷个/mL的细胞冻存液，将该液分装于冻存管内，放入程序降温盒内，于－80℃过夜，第二天移入液氮中保存。

3.根据权利要求2所述的人源脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，DMSO与A的体积比为1:9。

4.根据权利要求1－3中任一项所述的人源脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述完全培养基为含有血清替代物和细胞因子IFN-γ的无血清培养基。