CN110079496A - 一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法。该子宫内膜干细胞来源于成年女性经血，培养条件为1‑10％的氧气浓度(优选5％)，该方法具有制备简便，易规模化生产，稳定性好等特点。与常氧培养条件下培养的子宫内膜干细胞相比，缺氧环境下低氧培养的子宫内膜干细胞具有更强的存活能力。

Description

一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种经血来源子宫内膜干细胞的低氧培养的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一种多能干细胞，来源于发育早期的中胚层，因能分化为间质组织而得名，具有自我更新能力和多向分化能力，可用于造血支持和促进干细胞植入及免疫调控等多种功能。

子宫内膜干细胞具有高度的分化潜能、增殖能力以及较低的免疫原性，作为免疫调节剂可减轻炎症，在动物试验中显示其在保护结肠免受大肠炎侵害方面有独特的作用，在组织重构和组织工程中促进血管再生和血管形成，表现出优于脐带MSC的作用，在心脏病动物模型中，子宫内膜干细胞的治疗已经具有显著性的效果。子宫内膜干细胞与与骨髓间充质干细胞(BMSC)比较更能抑制混合淋巴细胞反应中细胞的增殖。在动物模型中移植子宫内膜干细胞之后还没有畸胎瘤、异常组织形成、免疫排斥等反应发生。

子宫是一个具有高度再生及分化能力的组织，每个月经周期，女性的子宫内膜从0.5mm左右增厚到5-7mm左右。子宫内膜中含有具有高度增殖能力的干细胞。子宫内膜干细胞的直接获得途径比如子宫切除术、早起妊娠脱膜、刮除术均对供者具有严重侵入性；经血随月经周期每月排出，通过搜集经血，分离增殖出子宫内膜干细胞这种无创伤的方式是获得子宫内膜干细胞的最佳方式。从经血中分离出的子宫内膜干细胞我们称为经血来源子宫内膜干细胞(Menstrual blood-derived endomentrium Stem Cells，MenESCs)。

体内细胞所处的微环境是低氧或者缺氧的，在骨髓、脂肪等组织中，氧气浓度极低，一般为1-8％。而目前一般子宫内膜干细胞体外扩增培养的条件是O₂浓度为21％，氧浓度含量高，体外培养过程中子宫内膜干细胞所处的微环境与其来源的组织微环境存在较大差异。由于子宫内膜干细胞在再生医学领域具有巨大的应用潜能，为了在体外培养的过程中模拟体内的环境以避免子宫内膜干细胞体内应用时细胞性质、功能发生改变，本发明采用了低氧条件进行经血来源子宫内膜干细胞的培养。

本发明采用在体外低氧培养经血子宫内膜干细胞，制备简便，易规模化生产，并且经过冻存、复苏处理后能维持较高的稳定性，与普通培养(常氧)条件下培养的子宫内膜干细胞相比，低氧培养子宫内膜干细胞在缺氧环境下具有更强的生存能力。

发明内容

基于以上背景，本发明提供一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法。本发明提供的子宫内膜干细胞来源于人月经血，培养条件为低氧(1-10％)。

所述经血来源子宫内膜干细胞制备方式：

(1)标本保存液的配制：PBS缓冲液，分别加入终浓度200U/ml的庆大霉素，0.2mg/ml的两性霉素，1.0mg/ml的EDTA-NA₂。充分混匀。

(2)经血采集：收集健康女性(20-50岁)捐赠的经期第2-3天经血样本约10ml。经血样本收集后立即转移至装有10ml标本保存液的50ml离心管中，轻轻混匀。

(3)经密度梯度离心法分离子宫内膜干细胞。

(4)培养基配制：低糖DMEM与F12按比例混合后加入终浓度为10％的替代血浆，加入庆大霉素(终浓度为100U/ml)、两性霉素(终浓度为0.1mg/ml)。

(5)将细胞接种于T25培养瓶中，加入配制好的完全培养基，吹打混匀，并进行细胞计数。

(6)待细胞的融合率达到80％以上时，用胰蛋白酶消化，并离心收集细胞；

(7)按照适当细胞密度将细胞传代至多个T75培养瓶中继续培养；

(8)低氧培养的经血来源子宫内膜干细胞置于低氧二氧化碳培养箱中，CO₂浓度控制为5％，O₂浓度控制为1-10％，O₂浓度浓度降低通过N₂平衡，其它空气中应有物质的含量与常规常氧培养箱中空气含量一致。

(9)常氧培养经血来源子宫内膜干细胞置于常氧二氧化碳培养箱培养箱中，CO₂浓度控制为5％，O₂浓度控制为21％。

(10)传至P3-10代后，用胰蛋白酶消化细胞，300g离心5min进行收集，最后计数并冻存细胞。

在本发明的实施例3-6中，低氧培养的MenESCs均采用5％氧浓度培养。

在本发明的实施例3-6中，常氧MenESCs和低氧MenESCs均采用P3代细胞。

本发明相对于现有技术具有以下优点：

(1)本发明的低氧子宫内膜干细胞采用经血来源，取材不具有侵入性，易于规模工业化制备，且稳定性好。

(2)本发明的低氧子宫内膜干细胞具有较强的增殖分化能力，与普通培养的子宫内膜干细胞一样能分化为脂肪、骨、软骨。

(3)本发明的低氧子宫内膜干细胞生存能力比较常氧培养的子宫内膜干细胞，生存能力更强，在缺氧环境下不易凋亡。

(4)本发明的分离提取方法中，优选采用含10％替代血清的低糖DMEM/F12培养基作为低氧子宫内膜干细胞的培养基。替代血浆优于以前常用的动物血清，低糖的DMEM/F12让干细胞不易分化，更易保持其干细胞的特性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为常氧培养和低氧培养的MenESCs生长曲线。

图2为低氧培养的MenESCs成骨诱导结果。

图3为低氧培养的MenESCs成脂诱导结果。

图4为低氧培养的MenESCs成软骨诱导结果。

图5为常氧MenESCs和低氧MenESCs在低氧培养下生存能力分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 成年女性月经血标本采集

(1)标本保存液的配制：PBS缓冲液，分别加入终浓度200U/ml的庆大霉素，0.2mg/ml的两性霉素，1.0mg/ml的EDTA-NA2。充分混匀。

(2)招募处于月经周期前3天的健康成年女性志愿者8例，分别搜集其经血样本10ml左右，然后将经血样本转移至装有10ml标本保存液的50ml离心管中，轻轻混匀。经血样本保存液4℃保存，并在24小时以内完成子宫内膜干细胞的分离提取。

实施例2 低氧子宫内膜干细胞的制备

取实施例1的经血样品保存液4份，分别300g离心5min。搜集部分上清留样做微生物检测，其余弃掉，留下沉淀进一步在在生物安全柜中操作。

进一步的沉淀加入20ml生理盐水混匀，缓慢加入到10ml的Ficoll淋巴细胞分离液的上层，小心加液，保持血液沉淀物与Ficoll淋巴细胞分离液之间有清晰的界面。400g离心20min，小心吸去最上层液体，保留白膜层细胞及子宫内膜碎片。用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入5ml完全培养基(低糖DMEM与F12按比例混匀后加入终浓度为10％的替代血浆，庆大霉素100U/ml，两性霉素0.1mg/ml)。8份标本同样操作，4份样本放入常氧二氧化碳培养箱培养，CO₂浓度控制为5％，O₂浓度控制为21％，温度为37℃。另外4份样本放入低氧二氧化碳培养箱内培养，CO₂浓度控制为5％，O₂浓度控制为1-10％，优选控制为5％，温度为37℃。待细胞的融合率达到80％以上时，用胰蛋白酶消化收集细胞，按照适当密度将细胞传代至多个T75培养瓶中继续培养，培养条件同上述一致。

进一步的用胰蛋白酶消化收集细胞，300g离心5min，计数并冻存细胞；其中低氧培养箱内的细胞为低氧经血来源子宫内膜干细胞(低氧MenESCs)，而常氧CO₂培养箱内的细胞为常氧经血来源子宫内膜干细胞(常氧MenESCs)。

实施例3 经血来源子宫内膜干细胞生长曲线

经血子宫内膜干细胞生长曲线检测：分别在低氧二氧化碳培养箱内和常氧二氧化碳培养箱内将宫内膜干细胞培养至第3代，用0.25％胰酶消化细胞，用适当体积培养基重悬细胞，取100μl单细胞悬液(1×10³)接种于96孔板。又分别在低氧培养箱内和常氧培养箱内细胞8天，每天作为一个时间点并分别设置3个复孔；在测定前4小时将CCK-8溶液10μl加入96孔板中；用酶标仪在波长490nm处检测各孔的OD值，记录结果。绘制生长曲线，结果见图1。

从图1中可以看出，常氧培养和低氧培养的MenESCs均显示出良好增殖状态。两组细胞生长状态没有明显差异。

实施例4 经血来源子宫内膜干细胞表型分析

MenESCs的表型分析(流式细胞仪测定)：分别取常氧和低氧培养的传至第3代的细胞，制成细胞悬液，细胞浓度为1×10⁷/ml；取50μl的细胞样本，加入抗体(CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD177、HLA-DR以及同型对照)，避光4℃孵育20min，300g离心5min，弃上清，加入1ml对应的缓冲液，充分混匀，300g离心5min，弃上清，加入0.5ml缓冲液，用流式细胞仪进行分析。结果见表1。

表1的结果表明，本发明所获得的经血来源的子宫内膜干细胞表面标志物的表达均符合国内外对成体干细胞表面标志物表达的要求。常氧培养和低氧培养下表面标志物的表达没有差异。

表1MenESCs表面标志物检测结果

实施例5 低氧MenESCs分化功能测定

低氧MenESCs的成骨分化检测：取低氧培养的传至第3代的细胞，以3×10³cells/cm²铺于6孔板，普通培养24h后，换新鲜成骨诱导液，每隔3天全量换液，直到诱导培养21天结束诱导，弃去诱导液，加入4％多聚甲醛固定30分钟。固定完后，弃去固定液，加入PBS漂洗2次，加入茜素红染色液染色3-5min，然后PBS漂洗3次，显微镜下观察拍照。结果见图2。

从图2的结果可以看出，成骨诱导培养基培养后，MenESCs变化成致密生长的状态，染色后见到明显的橘红色的结节，表明低氧MenESCs细胞具有成骨分化能力。

低氧MenESCs的成脂分化检测：低氧培养的传至第3代的细胞，以2×10⁴cells/cm²铺于6孔板，正常培养基培养细胞直至90％汇合度，弃去培养基，加入成脂诱导培养基，每3天换液一次，约21天诱导结束。用4％多聚甲醛室温固定30min，PBS漂洗2次，然后在室温条件下用油红染色30min，PBS漂洗3次后，显微镜下观察拍照。结果见图3。

从图3的结果可以看出，成脂诱导后的细胞细胞质中有许多红色脂肪滴，表明MenESCs细胞已经成功分化为脂肪细胞。

低氧MenESCs的成软骨分化检测：取低氧培养的传至第4代的细胞，2.5×10⁵cells至于15ml试管中，加入软骨诱导培养基，每隔3天换液，诱导培养21天，去诱导液，细胞团成圆形固体状，加入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，加入阿尔辛蓝染色液染色30min，PBS漂洗3次，显微镜下观察拍照。结果见图4。

成软骨诱导培养基培养后，细胞变成细胞团块，不能吹散。从图4可以看出，细胞已长成致密状态，阿尔辛蓝染色成明显蓝色，表明低氧MenESCs细胞具有成骨分化能力。

从图2、3、4的结果可以看出，本发明中所培养的低氧的经血来源子宫内膜干细胞具有多向分化潜能，可在特定培养基的诱导下向成骨、成脂、成软骨方向分化，符合国内外对成体干细胞多向分化潜能的要求。

实施例6 MenESCs生存能力的检测

将P3代常氧型和低氧型低氧MenESCs，分别接种到24孔板中，接种密度为4000cells/cm²；然后均置于低氧二氧化碳培养箱中培养，氧气浓度调整为1％，以模拟体内缺氧的微环境。

培养48小时后，收集细胞，使用Annexin-V FITC Apoptosis Assay Kit检测在缺氧环境下常氧培养和低氧培养子宫内膜干细胞的死亡情况。结果如图5所示，常氧培养的子宫内膜在缺氧环境下细胞死亡数会多一些：PI单阳性细胞比例为12.2％，Annexin V单阳性细胞比例为0.7％，Annexin V和PI双阳性细胞比例为13.1％，而低氧培养的子宫内膜干细胞能较好适应缺氧的微环境，细胞死亡比例相对较小：PI单阳性细胞比例为2.5％，AnnexinV单阳性细胞比例为2.6％，Annexin V和PI双阳性细胞比例为2.9％。以上结果表明低氧培养的子宫内膜干细胞在缺氧的环境下具有更强的生存能力。

以上所述的仅是本发明的具体实施例。但本发明的保护范围不限于以上实施例，本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形或替换，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种低氧培养经血来源子宫内膜干细胞的方法，包括以下步骤(1)经血采集约10ml，立即转移至装有10ml标本保存液的50ml离心管中，混匀；(2)经密度梯度离心法分离子宫内膜干细胞；(3)将细胞接种于T25培养瓶中，加入配制好的完全培养基，混匀，并细胞计数；(4)待细胞的融合率达到80％以上时，胰蛋白酶消化，离心收集细胞；(5)按照适当密度将细胞传代至多个T75培养瓶中继续培养；(6)低氧培养条件：低氧培养的经血来源子宫内膜干细胞培养时CO₂浓度控制为5％，O₂浓度控制为1-10％(优选5％)，O₂浓度浓度降低通过N₂平衡，其它空气中应有物质的含量与常规常氧培养箱中空气含量一致；(7)常氧培养条件：常氧培养经血来源子宫内膜干细胞培养时CO₂浓度控制为5％，O₂浓度为21％。(8)传至P3-10代后，胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，计数并冻存。(9)P4代经血来源子宫内膜干细胞的分化功能和表面标志物检测。

2.根据权利要求1，低氧培养条件氧含量为1-10％，优选5％作为其最佳低氧培养条件。

3.一种子宫内膜干细胞培养基配制方法：低糖DMEM与F12按比例混匀后加入终浓度为10％的替代血浆，加入庆大霉素(终浓度为100U/ml)、两性霉素(终浓度为0.1mg/ml)。

4.一种经血标本保存液的配制方法：PBS缓冲液，分别加入终浓度200U/ml的庆大霉素，0.2mg/ml的两性霉素，1.0mg/ml的EDTA-NA₂。