CN102002475A - 人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法，包括：采集脂肪；获取和分离人脂肪成体干细胞；培养人脂肪成体干细胞；检测、冻存人脂肪成体干细胞；建库。利用本发明的获取人脂肪成体干细胞的方法，可有效的分离、纯化、扩增脂肪成体干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立长期存储人脂肪干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量干细胞资源。根据获取的人脂肪成体干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，该库为健康成人储存脂肪干细胞，为其本人在罹患需要采用干细胞移植时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于干细胞制剂的生产。
Description
[技术领域]
本发明涉及干细胞获取方法及其干细胞库构建的方法，尤其涉及一种人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法。
[背景技术]
干细胞研究是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。近几年研究表明，成体干细胞的分化能力远超过传统观点所局限的范围。因此目前干细胞的应用已经不再局限于利用胚胎干细胞的全能性去研究组织细胞再生，也不再局限只用组织本身的起始干细胞做细胞治疗研究，而是趋于寻找更多的干细胞来源，通过研究他们的分化潜能，扩增能力，分化后的细胞功能以及取材是否安全方便等问题，选择最合适的干细胞源来进行组织细胞再生修复。
最近研究证明，在来源于成体脂肪组织中的有核细胞中，像骨髓一样也含有一种多能干细胞，国际上把这种细胞命名为脂肪来源干细胞(英文全称：Adipose Derived Stem Cells，简称ADSCs)。这种细胞群易分离，并像骨髓中的间充质干细胞那样在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等。许多研究表明，已有从人或其他物种上分离出来ADSCs，并且ADSCs的表面抗原与骨髓间充质干细胞基本类似。直接比较人的ADSCs和间充质干细胞的表面抗原，约多于90％都是一致的。实验表明，ADSCs像骨髓源性的间充质干细胞一样，经体外扩增后，其具有较低的免疫原性和免疫调节功能。这就表明ADSCs不会在体内引起T细胞(即胸腺依赖淋巴细胞)的细胞毒性反应。移植同种异基因ADSCs将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成为目前研究的新热点，不论在再生医学还是基因治疗方面都具有重大的应用潜力。
为了便于人们有效储存和使用干细胞资源，目前在世界范围内，已经建立了多个干细胞库。所谓干细胞库是在约为-196℃液氮中(深低温)储存干细胞及搜集存储干细胞资源相关资料的场所。按所储存的干细胞来源和采集方式，干细胞库主要可分为胚胎干细胞库、成体干细胞库以及病理细胞库，成体库中包括脐血干细胞库、骨髓和外周血干细胞库、以及脐带间充质干细胞库。一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力。目前尚无脂肪成体干细胞库，因此，构建脂肪成体干细胞库，将人健康时的脂肪干细胞通过本发明建立的系统工程技术储存建库，是将现有资源充分利用的有效方法，为存储本人、家属和他人在需要采用脂肪成体干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型脂肪成体干细胞，其应用前景十分广阔。
[发明内容]
本发明的目的在于克服以上技术的不足，而提供一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。
本发明的另一目的在于克服以上技术的不足，而提供一种人脂肪成体干细胞库的构建方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。
本发明提供的一种人脂肪成体干细胞的获取方法，包括：
(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；
(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；
(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1-2×104/cm2接种于培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；
(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用10mL的D-Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入1mL胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存，将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。
优选的，所述步骤(2)中用镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。所述步骤(2)中用无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。所述步骤(2)中胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下消化时间为60分钟。所述步骤(2)中离心的最佳转速为1800转/分钟，离心5分钟。所述液氮冷冻温度为-196℃。
本发明提供的一种人脂肪成体干细胞库的构建方法，包括：
(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；
(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；
(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1-2×104/cm2接种于培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；
(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用10mL的D-Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入1mL胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存。将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理；
(5)建库：将获得的每一份人脂肪成体干细胞细胞按供者姓名、身份证号码及存储日期分别保存，建立每一份干细胞的详细档案的电脑数据库，建立人脂肪成体干细胞库。
优选的，所述步骤(2)中用镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。所述步骤(2)中用无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。所述步骤(2)中胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下消化时间为60分钟；所述离心的最佳转速为1800转/分钟，离心5分钟；所述液氮冷冻温度为-196℃。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
利用本发明获取脂肪成体干细胞的方法，可以更加有效的分离、纯化、扩增脂肪成体干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并且建立长期存储脂肪干细胞的干细胞库，该库可向临床及科研应用提供大量干细胞资源。
根据获取的脂肪成体干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，可得到大量富有活性的脂肪成体干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，富有应用前景。该库为健康成人储存脂肪干细胞，为存储者在罹患需要采用干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。
[附图说明]
图1为本发明实施例的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法的流程图，在该图中，人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法集合在一起；
图2为本发明实施例的人脂肪成体干细胞的生长曲线示意图；
图3为本发明实施例的人脂肪成体干细胞向脂肪细胞诱导分化实验结果示意图；
图4为本发明实施例的人脂肪成体干细胞向成骨细胞诱导分化实验结果示意图；
图5为本发明实施例的人脂肪成体干细胞对淋巴细胞增殖抑制实验结果示意图；
图6为本发明实施例的人脂肪成体干细胞的形态示意图。
[具体实施方式]
为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法，其具体实施方式、特征及其功效，说明如后。
本发明实施例提供的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法，如图1所示，在图1中，人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法集合在一个图中，以下进行统一说明；包括：
(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA(英文全称：HumanLeukocyte Antigen，中文全称：人类白细胞抗原)分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV(英文全称：Human Immunodeficiency Virus，中文全称：人类免疫缺陷病毒)、HBV(英文全称：Hepatitis B virus的简称，中文全称：乙型肝炎病毒)、HCV(英文全称：Hepatitis C virus，中文全称：丙型肝炎病毒)；然后在无菌场所采集供者的脂肪。
在脂肪采集之前，供者填写知情同意书、个人基本资料，然后对供者进行鉴定，确认供者身体健康后再进行采集其脂肪，采集过程应严格防止病原微生物的污染，要求在无菌的场所进行，然后将采集到的脂肪运输到指定地点，运输环境温度应在4-8℃范围内；脂肪接收时应填写接收单，标记脂肪瓶；脂肪接收后，对所用脂肪进行无菌检测，确保脂肪的安全性。
(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，本实施例是用镊子进行操作，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，本实施例是用无菌的粉碎装置进行绞碎，加入与所取脂肪组脂等体积即20mL的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70分钟，本实施例中，消化60分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速离心4-10分钟，本实施例中，为置于转速为1800转/分钟的离心机中，离心5分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；D-Hank’s平衡盐液的配制方法为：将含NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4·H2O 0.06g、KH2PO4 0.06g、NaHCO3 0.35g和酚红0.02g，加水溶解定量至1000mL；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟的转速离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞。
(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1-2×104/cm2接种于塑料培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM(英文全称：Dulbecco’sModified Eagle Media，中文全称：Dulbecco修改过的Eagle培养基，是由美国的INVITROGEN公司生产)的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含15％(体积比)胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含15％(体积比)胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化；0.25％胰酶-EDTA的制备过程为：胰蛋白酶0.5g溶于100mL的D-Hank’s中使之充分溶解后加入含0.02％EDTA的D-Hank’s溶液100mL混匀，用孔径为0.22μm的一次性滤器过滤除菌，在-20℃储存；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟；在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％(体积比)胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％(体积比)胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞。
细胞生长曲线的测定是将贴壁细胞用0.25％胰酶-EDTA消化后，按1×104细胞/孔接种在24孔板内，每隔24小时消化3个孔，收集细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，绘制生长曲线，如图2所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞个数，从图2中可见，本发明获得的人脂肪成体干细胞增殖较快，在对数生长期，细胞倍增时间均约为20h左右。
(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：用10mL的D-Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每个培养瓶中加入1mL胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存。将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；其中，病毒检测是通过实时荧光聚合酶链式反应检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒，判定标准为为各项指标均为阴性，视为合格细胞。
细胞计数及活力测定是指用台盼兰染色进行细胞计数，判定标准为细胞活率大于等于90％，视为合格细胞。免疫表型检测是用直接免疫荧光法检测，所用抗体为小鼠抗人的单克隆抗体CD29、CD44、CD73、CD90、CD14、CD31、CD45、CD49d、HLA-DR。细胞用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)洗后加入抗体，在4℃温度下孵育30分钟，再用PBS洗细胞两次，用500μL的PBS吹打、混匀细胞，之后用流式细胞仪检测。本发明人脂肪成体干细胞免疫表型流式细胞仪检测结果如表1所示，其中：“++”表示大于95％；“-”表示小于2％，检测结果表明，脂肪成体干细胞中的CD14、CD31、CD45、HLA-DR呈阴性，小于2％；CD44、CD73、CD90、CD105和CD49d呈阳性，大于95％，该脂肪成体干细胞视为合格细胞。
表1
细胞分化能力检测是指在诱导培养条件下，脂肪干细胞向脂肪、成骨分化能力的检测，判定标准为向脂肪和成骨细胞分化成功的视为合格细胞。细胞分化能力检测的具体过程为：将重悬于D-MEM/F-12(Dulbecco修改的Eagle培养基与营养混合物F-12以1∶1配比的培养基，是由美国的INVITROGEN公司生产)完全培养液的人脂肪成体干细胞以1×105/孔接种于6孔板，每孔体系为2mL；置于CO2含量为5％、饱和湿度、37℃的培养箱培养2天；当细胞80％融合，小心吸弃培养基，然后每孔添加1mL预热的脂肪完全诱导培养基(如美国的INVITROGEN公司生产的STEMPRO
Adipogenesis Differentiation Kit脂肪分化试剂盒)。将此培养基应用日记录为脂肪分化第一天；按表2所示的分化时刻表更换新鲜脂肪诱导或维持培养基，并随时镜检细胞状态。
表2
| 天数 | 培养基 |
| 1 | 脂肪诱导培养基 |
| 3 | 脂肪诱导培养基 |
| 5 | 脂肪诱导培养基 |
| 7 | 脂肪诱导培养基 |
| 9 | 脂肪诱导培养基 |
| 11 | 脂肪诱导培养基 |
| 13 | 脂肪诱导培养基 |
诱导分化14天后，小心吸弃培养基，用D-Hank’s洗涤1次，5-10分钟。用4％多聚甲醛固定细胞，室温孵育30-40分钟；小心吸弃固定液，用PBS洗涤三次，每次5-10分钟；用双蒸水洗涤两次；加入油红-O(Sigma公司生产的一种染料，也叫苏丹红5B，用来染色脂肪细胞)，覆盖细胞，室温孵育50分钟；吸弃油红-O，再用双蒸水洗涤三次，镜检。结果判定，诱导培养7天，倒置显微镜下即可见胞浆内脂滴形成，第14天油红-O染色呈强阳性；未加诱导培养基的对照组细胞无脂滴形成，油红-O染色阴性，如图3所示，其中A为培养于普通培养基中的人脂肪成体干细胞；B为培养于脂肪细胞诱导分化培养基中的人脂肪成体干细胞，由图3可以看出：经脂肪完全诱导培养基诱导后，油红-O染色呈阳性，说明脂肪干细胞可诱导分化为脂肪细胞。
细胞分化能力检测中检测向成骨细胞的转化能力方法：是将重悬于D-MEM/F-12完全培养基的人脂肪成体干细胞以1×105/孔接种于6孔板，每孔体系为2mL；置于CO2含量为5％、饱和湿度、37℃的培养箱培养2天；当细胞80％融合，小心吸弃培养基，然后每孔添加1mL预热的成骨完全诱导培养基(如美国的INVITROGEN公司生产的STEMPRO
OsteogenesisDifferentiation Kit成骨细胞分化试剂盒)。将此培养基应用日记录为脂肪分化第一天；按表3所示的分化时刻表更换新鲜成骨诱导或维持培养基，并随时镜检细胞状态。
表3
| 天数 | 培养基 |
| 1 | 成骨诱导培养基 |
| 3 | 成骨诱导培养基 |
| 5 | 成骨诱导培养基 |
| 7 | 成骨诱导培养基 |
| 9 | 成骨诱导培养基 |
| 11 | 成骨诱导培养基 |
| 13 | 成骨诱导培养基 |
诱导分化14天后，小心吸弃培养基，用D-Hank’S洗涤1次，5-10分钟。用4％多聚甲醛固定细胞，室温孵育30-40分钟；小心吸弃固定液，用PBS洗涤三次，每次5-10分钟。用双蒸水洗涤两次；移除去离子水，加入茜素红-S(美国的Amresco公司生产的染料，可使钙离子染成红色)溶液染色液，室温染色30分钟；移除茜素红-S溶液染色液，用去离子水洗细胞3次，并加入适量纯水，防止细胞干燥，显微镜下观察。结果判定，成骨诱导第14天试验组，茜素红-S染色可见细胞强阳性，沉积的钙盐被染成红色。图4中A为培养于普通培养基中的人脂肪成体干细胞，B为培养于成骨细胞诱导分化培养基中的人脂肪成体干细胞，从图4中可看出未加成骨诱导培养基的对照组细胞染色后无明显变化，而经成骨完全诱导培养基培养的细胞，茜素红-S染色可见细胞强阳性，沉积的钙盐被染成红色，说明脂肪干细胞可诱导分化为成骨细胞。
生物学效力检测是将脂肪干细胞与PBMC(外周血单个核细胞)共培养，加入PHA(英文全称：phytohaemagglutinin，中文全称：植物血凝素)对PBMC进行刺激，在培养结束前18小时，加入H3-TdR(英文全称：H3-thymidine，中文全称：氚胸腺嘧啶)，通过检测cpm(英文全称：counts per minute，中文全称：每分钟计数)值来判定各实验组中PBMC增殖情况，判定标准为人脂肪成体干细胞与PBMC共培养后，能显著抑制后者增殖，P＜0.01，在许多研究领域，0.05的p值通常被认为是可接受错误的边界水平，p＜0.05视为合格细胞。如图5所示，将PBMI1640培养液重悬的脂肪干细胞按每孔5×104接种于96孔板中，经过30Gy照射后吸弃上清，按分组分别加入1×105/100μL/孔外周血单个核细胞(PBMC)。图5中y轴为cpm值，x轴为组号，实验中设四个组，1是单纯T细胞组、2是T细胞+PHA组、3是人脂肪成体干细胞+T细胞+PHA组、4是人脂肪成体干细胞+PHA组，将PHA以50微克/毫升的浓度加入相应孔内，共培养72小时。在培养结束前18小时，加入H3-TdR，1μCi(μCi为放射能单位)/孔，培养结束后，收集细胞，液闪计数，检测cpm值。结果计算：求各组的cpm均值，并将2、3组做统计学分析。判定标准为：人脂肪成体干细胞加入PBMC后能显著抑制后者增殖(P＜0.01)，视为合格细胞。
获得传代的人脂肪成体干细胞后，将取少量进行检测，其余部分进行冻存，冻存人脂肪成体干细胞的过程为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，即加0.9mL细胞悬液，加0.9mL冻存液，为了减少冻存液对细胞的伤害，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，所述液氮冷冻温度为-196℃。细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测。人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了。待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，如黄色印有“感染性废弃物”的垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。
脂肪组织的分离、培养、传代、冻存均在符合GMP(药品生产质量管理规范)标准洁净间进行操作，此洁净间洁净等级应达到万级标准，温度22摄氏度，相对湿度50％，超净台应达到百级洁净标准。
(5)建库：将获得的每一份人脂肪成体干细胞细胞按供者姓名、身份证号码及存储日期分别保存，建立每一份干细胞的详细档案的电脑数据库，建立人脂肪成体干细胞库。
细胞形态学观察发现采用步骤(2)分离的原代细胞多于24-48小时内贴壁，培养1-2周，倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形，增长速度较快；第一次传代后，形成形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，于5天后达到80％融合(见图6)；冻存后复苏，细胞形态无明显改变，如图6所示，图中A为采用本方法获得的ADSCs培养7天后的细胞形态示意图；B、C、D为ADSCs第一次传代后1、3、5天的细胞形态示意图；E、F为经冻存后复苏的第三代ADSCs培养1、3天的细胞形态示意图，由图6可见，在本方法所应用的培养条件及冻存条件下，脂肪干细胞生长稳定、形态正常，保持了其正常的生物学功能。
利用本发明的获取人脂肪成体干细胞的方法，可以更加有效的分离、纯化、扩增脂肪成体干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并且建立长期存储人脂肪干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量干细胞资源。根据获取的人脂肪成体干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，可得到大量富有活性的人脂肪成体干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，建库成本低廉，富有应用前景。该库为健康成人储存脂肪干细胞，为其本人在罹患需要采用干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (10)
1.一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，包括：
(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；
(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；
(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1-2×104/cm2接种于培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；
(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用10mL的D-Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入1mL胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存，将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理。
2.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中用镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。
3.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中用无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。
4.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下消化时间为60分钟。
5.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心的最佳转速为1800转/分钟，离心5分钟。
6.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述液氮冷冻温度为-196℃。
7.一种人脂肪成体干细胞库的构建方法，其特征在于，包括：
(1)采集脂肪：对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；
(2)获取和分离人脂肪成体干细胞：取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；
(3)培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按1-2×104/cm2接种于培养瓶，加入10mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入30mL含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，即按1∶3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；
(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用10mL的D-Hank’s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入1mL胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6×106个细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存。将两管细胞以900转/分钟离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2×106细胞/0.9mL胎牛血清，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1∶1比例加入到冻存管内混合，先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集中放置于指定位置，由专门人员运走处理；
(5)建库：将获得的每一份人脂肪成体干细胞细胞按供者姓名、身份证号码及存储日期分别保存，建立每一份干细胞的详细档案的电脑数据库，建立人脂肪成体干细胞库。
8.如权利要求7所述的人脂肪成体干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中用镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。
9.如权利要求7所述的人脂肪成体干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中用无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。
10.如权利要求7所述的人脂肪成体干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下消化时间为60分钟；所述离心的最佳转速为1800转/分钟，离心5分钟；所述液氮冷冻温度为-196℃。
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