CN102296048A - 从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：1)将人流产物与采集液按照1∶0.9～1.1的体积比混合；得刮宫样品；2)宫内膜干细胞分离培养：将刮宫样品经摇床孵育后，过滤；得滤液；然后利用密度梯度离心法，收集血液中的碎片组织及单核细胞；接着进行细胞的培养以及细胞扩增和纯化；3)待上述步骤所得的P1代细胞铺满瓶底后，用胰蛋白酶消化收集细胞，用预冷的冻存液重悬细胞，得细胞悬液，将上述细胞悬液进行冻存，将所得的冻存样本放入液氮储存罐保存。采用本发明的方法能获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞。

Description

从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于干细胞分离培养及保存相关技术。

背景技术

干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生命科学的生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，还在发现新基因、基因功能分析、发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。近几年来，干细胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值，干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，同时又因为其低免疫原性而成为细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。

众所周知，子宫内膜细胞系具有很强的自我更新能力。自1978年Prianishnikov提出存在子宫内膜干细胞以来，人们一直没有停止过研究子宫内膜干细胞的脚步，1993-2002子宫内膜干细胞的存在有了临床实践的支持，进一步肯定了研究子宫内膜干细胞的重要性，直到2004年Chan等证实了子宫内膜干细胞的存在，极大的激发了研究者们的研究热情。前期子宫内膜干细胞的研究材料主要是取自体内的子宫内膜组织，既不方便又限制了研究进展。2006年日本研究人员从女性月经血中成功提取出干细胞，掀起了研究经血来源子宫内膜干细胞的热潮。经美日中等多国科学家的研究证实在随女性经血脱落的子宫内膜组织中，具有相当数量的间充质干细胞——宫内膜干细胞，数量为骨髓来源的30倍；这些干细胞活力更强，更强的自我更新和增殖能力(如心肌细胞的培育效率为传统利用骨髓细胞培育的100倍)，分化潜能更接近胚胎干细胞。有研究发现子宫内膜的再生细胞(ERC)不仅具有几乎每24小时复制一次的惊人速率，而且它们产生独特生长因子的速率，比来自于脐带血的干细胞要大上10万倍。

从人刮宫术获得的体液(包括血液)中就含有随之一起刮取得到的子宫内膜组织，上述理论研究使得从该体液中获取子宫内膜干细胞成为可能。人流是指用手术的方法终止妊娠，手术方法之一就是钳刮术，通过刮宫可以在取出少量胚胎组织的同时获得一定的子宫内膜组织，而随这些刮取获得的子宫内膜组织一起获得的体液便成了获取宫内膜干细胞的最好来源。相比而言，因为供体的年龄原因，该干细胞可能会拥有更强的增殖能力和更好的活力，除此之外，也可以使得原来被丢弃的体液变废为宝，无论是从研究角度还是供体角度都是有百利而无一害。如果把这些干细胞通过科学的方法储存起来，在女性未来的一生中，一旦发生肝硬化、糖尿病、心衰竭、肿瘤等重大疾病或意外严重伤害时，就可立即做自体干细胞的移植，恢复健康，减轻自己及家人的经济负担，减轻社会负担，还有可能实现女性梦寐以求的“青春常在”、“红颜永驻”的美好愿望，拥有高品质的人生。女性的宫内膜干细胞不但可用于本人，还可为她的子女、相关亲属(如堂表弟妹，甚至父母)等人的临床应用。

由于国内实行独生子女政策，一旦患血液系统恶性疾病和遗传性疾病，就只能采用异基因干细胞移植，宫内膜干细胞是异基因干细胞移植最丰富最好的资源。一旦储存了宫内膜干细胞，就相当于为其整个家族建立了一个预防和治疗肿瘤及其它相关需干细胞治疗疾病的生命银行。储存的宫内膜干细胞还可供全国和全世界患者选择作干细胞移植用，并逐步替代价格昂贵、难以找到配型相合的骨髓干细胞。全世界等待干细胞移植的患者数以亿计，仅白血病在我国的发病率就达十万分之三、四，即每年新增四万名左右的患者，而累计的白血病患者约有四百万，其中大部分是儿童，他们都急需通过干细胞移植来救治。

发明内容

本发明的目的在于针对现有干细胞来源困难或受伦理限制等问题，寻找一种更为高效的来源广泛且不受伦理限制的宫内膜干细胞分离和培养方法。在此基础上，扩增和纯化干细胞，并对所培养的干细胞进行形态和功能鉴定，从而建立具有干细胞特性的新型干细胞株，然后再将优质的干细胞资源储存。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1)、样品收集：

将人流产物与采集液按照1∶0.9～1.1的体积比混合；得刮宫样品；

采集液为：在每500mL的采集液中含有400单位肝素以及浓度为4mg/mL的环丙沙星和浓度为10mg/mL的卡那霉素，其余为DMEM培养基(Invitrogen公司)；

2)、宫内膜干细胞分离培养：

A、样本的初处理：

将刮宫样品于3～5℃进行摇床孵育22～26小时，然后进行过滤(过滤目的是为了滤除刮宫样品中的绒毛和蜕膜、胚胎组织)；得滤液；

B、利用密度梯度离心法，收集血液中的碎片组织及单核细胞，依次进行以下步骤：

滤液1500～2500g离心8～12分钟，分别得位于上层的上清和位于下层的血液；

取部分上清用于病毒检测，如病毒检测为阳性，则结束整个操作；如病毒检测为阴性，则继续进行以下操作：

去除其余上清后，得血液；用PBS缓冲液稀释血液，PBS缓冲液与血液的体积用量比为1.5～2.5∶1；

将稀释后的血液加至人淋巴细胞分离液(市购产品)上，稀释后的血液和分离液的体积比为1.8～2.2∶1，600～1000g离心12～18分钟，离心完毕后，离心管内出现明显的分层；吸出位于中间的单核细胞层(白膜层)，用PBS缓冲液洗涤细胞后离心(洗涤2次，每次均是400g离心10分钟)，最后用Chang完全培养基制成单细胞悬液；

C、细胞的培养：

将上述步骤所得的单细胞悬液接种于Chang完全培养基中，细胞接种密度为1×10⁵～1×10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养；培养时间为4～5天；

Chang完全培养基由以下成分组成：65ml的MEM alpha(MEM-alpha培养基，Invitrogen公司)、18ml的Chang B(基液)(Irvine Scientific公司)、2ml的Chang C(基液)(Irvine Scientific公司)、1ml的Penicillin/Streptomycin(青霉素/链霉素硫酸盐，Invitrogen公司)、1ml的L-glutamine(L-谷氨酰胺，Invitrogen公司，浓度为200mM)和15ml的ES-FBS(胎牛血清，Invitrogen公司)；

D、细胞扩增和纯化：

待步骤3)的4～5天的培养结束后，更换培养基，弃除未贴壁细胞；根据细胞生长状况，每3～4天全量换液一次，待细胞生长达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000～6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；

上述过程在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行；

3)、细胞冻存：

待上述步骤所得的P1代细胞铺满瓶底后，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，用预冷的冻存液重悬细胞，得细胞悬液，细胞悬液中细胞的浓度是1～2*10⁶/ml；并分装于4支2ml冻存管中；冻存液为DMSO(Calbiochem公司)与Chang完全培养基按照1∶9的体积比混合而得；

将上述细胞悬液进行如下冻存程序(即，将上述4支冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序)：

第一步、4℃，等待(即温度降至4℃后，进入第二步)；

第二步、1.0℃/分钟降至-3.0℃(箱体)；

第三步、10.0℃/分钟降至-20.0℃(箱体)；

第四步、1.0℃/分钟降至-40.0℃(箱体)；

第五步、10.0℃/分钟降至-90.0℃(箱体)；

第六步结束；得冻存样本；

将所述冻存样本放入液氮储存罐保存。

在本发明中，经过培养贴壁生长的部分为目标细胞。

现在世界上大部分干细胞库的做法是从人体取得干细胞(或混有干细胞的其他组织，人脐带、羊水、外周血等)后，稍加分离即进行冻存，等到需要时再将冻存的细胞复苏、培养增殖。

本发明的优越之处在于从刮宫样品中取得体液标本后，经过密度梯度分离后，去除大部分红细胞，再进行纯化扩增培养，获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞(人宫内膜间充质干细胞)，再进行冻存，这样就保证了冻存细胞的质量，且以后需要用到该份细胞，复苏后的培养时间也较其他方法短得多(图2复苏细胞的生长曲线，显示细胞的增殖能力)。

本发明的优越之处在于干细胞资源来自刮宫术后废弃的体液，采集方便，变废为宝，其所含干细胞含量丰富，增殖较快；通过高效的分离方法能够保证被储存的干细胞的质量。

在现有技术中，蜕膜组织和子宫内膜活检组织中分离得到干细胞没有进行严格的间充质干细胞鉴定。特别是子宫内膜活检时，一般是在进行常规例行病理诊断时顺便获得样品。而本发明所采用的是刮宫的方法，从刮宫的体液中分离宫内膜干细胞，进过包括微生物的清除、干细胞鉴定，培养、扩增和储存等技术。在目前还没有人报道。与从经血中分离宫内膜干细胞相比，减少了微生物污染的可能性，因为刮宫是在无菌的环境下进行的，由此所获得的细胞活力更高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是实施例1中培养不同时间的宫内膜干细胞放大100倍的显微照片；

A为P0代换液4天，100X；

B为P1代3天，100X；

C为P2代3天，100X；

D为P7代3天，100X；

E为P22代3天，100X；

图2复苏细胞生长曲线；

图3是实施例1中流式细胞分析结果图。

具体实施方式

实施例1：通过刮宫术培养获取人宫内膜干细胞的分离、培养、扩增及冻存、复苏：

1)、准备采集套装和配制培养基：

负压采集瓶(无菌)。

采集液：在2000mg的环丙沙星、5000mg的卡那霉素和400单位肝素中添加DMEM基础培养基(即DMEM培养基)，直至定容至500ml，得采集液。

即，该500ml采集液中含有400单位肝素以及浓度为4mg/mL的环丙沙星和浓度为10mg/mL的卡那霉素。

使用前，该采集液于2～4℃环境下存放。

配制Chang完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha培养基(MEM alpha，Invitrogen公司)、18mL Chang B基液(Irvine Scientific公司)、2mL ChangC基液(Irvine Scientific公司)、1mL青霉素硫酸盐或者链霉素硫酸盐(Penicillin/Streptomycin，Invitrogen公司)、1mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen公司)、15mL ES-FBS(胎牛血清，Invitrogen公司)，充分混匀，置4℃冰箱待用。

2)、样品采集

在志愿者(22岁，已签订知情同意书)术前1个小时到达手术室。手术开始前1分钟，将负压采集瓶放至负压吸引器合适的位置。在严格消毒和无痛麻醉下，利用负压吸引管吸引子宫腔内的胎物至负压采集瓶中，再用刮匙清理宫腔并进行收集，即，吸出物是由绒毛、蜕膜、子宫内膜组织碎片、胚胎组织和一定量的体液(血液)等组成，以此作为人流产物，此为常规技术。

待手术结束后，加等体积的采集液至负压采集瓶中(即将人流产物与采集液按照1∶1的体积比混合，得刮宫样品)，保持低温状态(4-10℃)尽快送至实验室。

刮宫样品送至实验室后，将负压采集瓶中的刮宫样品转移至新的50ml离心管中，放入摇床孵育，温度设置为4℃。

3)、病毒和无菌检查：

待刮宫样品摇床孵育满24h后，将孵育所得的刮宫样品先进行过滤，以滤除绒毛、蜕膜、胚胎组织，并将过滤过所得物混匀；2000g离心10分钟；分别得位于上层的上清和位于下层的血液；

取所得的部分上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌、霉菌检查，并鉴定，若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；同时，取所得的部分上清液通过ELASA进行病毒检测，检测范围包括HBsAg、HBcAb、HCVAb、HIV-A、TP-PA、CMV-IgM，若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序。

取位于下层的血液进入以下步骤进行分离培养。

即，进行病毒、无菌检查和进行血液分离培养为同时分别进行，由于病毒和无菌检查需要一定的时间，如果阳性结果，则无需继续进行对血液的分离培养。

4)、宫内膜干细胞分离培养：

将上述位于下层的血液(即将上述2000g离心10分钟所得物去除所有的上清后)，利用密度梯度离心分离子宫碎片组织及单核细胞，具体如下：

首先用PBS缓冲液按一定比例(PBS缓冲液与血液的体积比为2∶1)稀释血液细胞，电动移液器吹打混匀；得稀释后血液；

在超净工作台中取干净离心管，转移15mL人淋巴细胞分离液至每根50ml离心管中；

铺层加样：将稀释后的血液小心的加至已倒好的人淋巴细胞分离液上(加样时动作要轻柔，避免冲散分层液面或与分层液面混合而影响分离效果)，稀释后血液和人淋巴细胞分离液的体积比为2∶1；

配平离心管，800g离心15分钟，离心机升降速要调至最低速挡，确保离心稳定，分层清晰；

提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上依次为红细胞层、粒细胞层、分离液层、单核细胞(MNC)层和血浆层；

吸出单核细胞层(可见部分碎片组织)：把吸管或移液管直接伸入单核细胞层，先吸该层中央部分细胞，再吸取四周细胞，动作要轻柔，保证不把该层细胞吹散。如果分离液层和MNC层呈乳白色，界面不清楚，提示含有较多单核细胞，酌情吸取分离液层，速度要缓慢，确保不吸取到红细胞层；

洗涤细胞：吸出的单核细胞混有部分细胞分离液，需用PBS缓冲液加以洗涤；用电动移液器加PBS缓冲液将细胞稀释两倍以上，混匀，400g离心10分钟；离心完毕后，小心取出离心管，去除上清；重复上述步骤一次；

细胞计数：将以上所得细胞充分混匀，用台盘蓝染色，计数活细胞；

接种细胞：根据细胞计数结果，调整细胞密度至2*10⁵/ml接种于75cm²培养瓶内(内装10ml的Chang完全培养基)。当然，接种时的细胞密度可采用1*10⁵-1*10⁶/ml。Chang完全培养基的体积比为：V_MEM alpha∶V_Chang B∶V_Chang C∶V_{Penicillin/Streptomycin}∶V_{L-glutamine 200mM}∶V_ES-FBS＝65∶18∶2∶1∶1∶15(具体如步骤1)中的配制Chang完全培养基所述)。

5)细胞扩增和纯化：

细胞培养于75cm²培养瓶中(内设含有密度为2*10⁵/ml细胞的Chang完全培养基10ml)，置于培养箱内，瓶盖拧松半圈，确保瓶内空气与培养箱内空气相通，保持培养箱37℃、饱和湿度、CO₂体积浓度5％的状态开始培养。

4天后，从CO₂培养箱中取出细胞培养瓶，在无菌条件下去除瓶中的培养基，弃除未贴壁细胞，添加10mL Chang完全培养基到培养瓶中，再次放入CO₂培养箱培养，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次(即全量更换Chang完全培养基一次)。待细胞达到80％-90％融合时，在每个培养瓶中加入1mL0.25％(质量浓度)的胰蛋白酶消化，水平方向轻轻摇晃，使胰酶铺满平底，作用1分钟后，倒置显微镜下观察消化效果，待大部分细胞(即80％～90％)缩至圆形后，再加入10mL Chang完全培养基终止消化；然后按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代。

传代培养过程中，根据细胞生长情况，每3-4天进行全量或半量换液，直至细胞再次达到融合(即细胞达到80％-90％融合时)，细胞铺满瓶底，重复以上操作进行传代，记为P2代，依此操作进行传代。

细胞原代培养3-4天全量换液后，去除未贴壁细胞，镜下观察，可见较多几个细胞聚集在一起的克隆，细胞增殖迅速，其倍增时间大约为24-36小时，2天后细胞形态呈均匀长梭形，培养4-5天后细胞可达到80％-90％融合，细胞呈漩涡状分布。传代后细胞24小时内完全贴壁，3-4天可铺满瓶底，继续传代。

图1显示了培养传代过程中的细胞形态图：A原代培养4天，换液后2天的细胞形态图，可见细胞形态较多，有圆形、多角形、梭形等，此时细胞较杂；B是P1代细胞传代后3天的图，细胞形态趋于一致；C是P2代细胞传代后3天的图，D是P7代细胞传代后3天的图，细胞呈漩涡状排列，此时细胞纯度较高；E是P22代细胞传代后3天的图，细胞密度较低，增殖速度开始减慢。

以上结果说明，从细胞形态来看，本发明分离培养的细胞符合干细胞的特点，细胞的增殖能力较强，本发明中细胞可传代至30代左右。

6)、细胞冻存

选择P1代细胞进行冻存，既保证了冻存时细胞的原始状态，也能够使细胞扩增到足够数量级。

每个试管内装含有密度为1～2*10⁶/ml的P1代细胞1ml。

具体为：在上述步骤5)中，待P1代细胞生长至融合80％-90％后，用1ml质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞。用少量Chang完全培养基重悬细胞，台盘蓝染色，计算细胞数量和细胞活率，确定细胞活率在80％以上，用Chang完全培养基调整细胞密度为2-4*10⁶/ml，加入等体积预冷(4℃)的2倍浓度的冻存液(20％DMSO)；然后分装于2ml的冻存管中。采用的冻存液终浓度是含有10％DMSO(calbiochem公司)的Chang完全培养基(即，冻存液为DMSO与Chang完全培养基按照1∶9的体积比混合而得)；即，冻存前细胞的终浓度为1-2*10⁶/ml。

将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序。冻存程序设置如下：

第一步：4℃，等待(即温度降至4℃后，进入第二步)；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃(箱体)；

第三步10.0℃/分钟降至-20.0℃(箱体)；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃(箱体)；

第五步10.0℃/分钟降至-90.0℃(箱体)；

第六步结束；

取出冻存样本，放入液氮储存罐(即为-196℃)长期保存。

实施例2、细胞复苏培养

将上述实施例1所得的冻存的样本从液氮储存罐中取出，立即放入37℃水浴中解冻。当观察到冻存管内的冰核只有黄豆大小的时候，将冻存管取出，立刻放入冰水混合物中。在无菌条件下，将冻存管中样本轻柔吸出，加入一支50mL无菌离心管中，再立即加入10mL的Chang完全培养基，充分混匀洗涤，在4℃、1000rpm的条件下离心10分钟，去除管中上清。重复操作一次。用台盘蓝进行细胞计数及活率分析。按照10000个/cm²的密度(利用Chang完全培养基)将细胞接种到75cm²培养瓶中，放入37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱培养。根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，以5000-6000个/cm²密度传代，复苏后细胞形态正常，增殖速度没有改变，传代至30代左右，细胞出现老化现象，从图2复苏细胞的生长曲线看出，细胞的倍增时间保持在24-36小时。

实施例3.流式细胞检测

选择实施例1中所得培养P5代的宫内膜间充质干细胞按如下步骤进行流式检测。

每个试管内装有浓度为5*10⁶/ml的P5代细胞2ml。

1)细胞悬液制备：

用1ml的0.25％(质量浓度)的胰酶将细胞消化下来，500rpm，5min离心，弃上清。加PBS洗2遍，然后2ml PBS重悬细胞，从而使细胞浓度为5*10⁶/ml。

2)4％多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(1500rpm，离心5min)。

3)5％的BSA固定40min。

4)根据流式抗体(直标)稀释度要求每10⁶个细胞/200ul分别加入20ul抗体(CD29、CD45、CD105、CD117、CD90、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)，避光，37℃孵育30min。

5)用PBS洗一遍，1500rpm，离心5min，弃上清，再加入500ul PBS重悬，准备上机检测。

6)流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司，型号FC-500。所用抗体来自于贝克顿迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富兰克林湖，NJ)。根据检测的干细胞大小特点利用前向散射光(FS)、侧向散射光(SS)找到目标细胞群。

根据所选择的抗体的荧光素标记选择流式检测通道，对目标细胞的荧光强弱进行分析，计算出细胞表面标记分子的阳性百分比。具体如图3所示。

从以上实施例可见：本发明方法可以成功从女性经血样品中分离获得人宫内膜干细胞，细胞经过扩增和纯化培养可培养至20代；细胞经过冻存后能够复苏继续传代培养，保持干细胞形态。经过流式细胞检测，复苏细胞表达CD29、CD105、CD90、CD73、CD44，不表达CD34、CD117、CD45、HLA(DR-DP-DQ)。表明本发明能够建立人宫内膜干细胞株，本发明的人宫内膜干细胞储存方法实际可行，并具有其他细胞库储存方法不具备的优点。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、样品收集：

将人流产物与采集液按照1∶0.9～1.1的体积比混合；得刮宫样品；

所述采集液为：在每500mL的采集液中含有400单位肝素以及浓度为4mg/mL的环丙沙星和浓度为10mg/mL的卡那霉素，其余为DMEM培养基；

2)、宫内膜干细胞分离培养：

A、样本的初处理：

将刮宫样品于3～5℃进行摇床孵育22～26小时，然后进行过滤；得滤液；

B、利用密度梯度离心法，收集血液中的碎片组织及单核细胞，依次进行以下步骤：

滤液1500～2500g离心8～12分钟，分别得位于上层的上清和位于下层的血液；

取部分上清用于病毒检测，如病毒检测为阳性，则结束整个操作；如病毒检测为阴性，则继续进行以下操作：

用PBS缓冲液稀释血液，所述PBS缓冲液与血液的体积用量比为1.5～2.5∶1；

将稀释后的血液加至人淋巴细胞分离液上，所述稀释后的血液和人淋巴细胞分离液的体积比为1.8～2.2∶1，600～1000g离心12～18分钟，离心完毕后，离心管内出现明显的分层；吸出位于中间的单核细胞层，用PBS缓冲液洗涤细胞后离心，最后用Chang完全培养基制成单细胞悬液；

C、细胞的培养：

将上述步骤所得的单细胞悬液接种于Chang完全培养基中，细胞接种密度为1×10⁵～1×10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养；培养时间为4～5天；

所述Chang完全培养基由以下成分组成：65ml的MEM alpha培养基、18ml的ChangB、2ml的Chang C、1ml的Penicillin/Streptomycin、1ml的浓度为200mM的L-glutamine和15ml的ES-FBS；

D、细胞扩增和纯化：

待步骤3)的4～5天的培养结束后，更换培养基，弃除未贴壁细胞；每3～4天全量换液一次，待细胞生长达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000～6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；

上述过程在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行；

3)、细胞冻存：

待上述步骤所得的P1代细胞铺满瓶底后，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，用预冷的冻存液重悬细胞，得细胞悬液，所述细胞悬液中细胞的浓度是1-2*10⁶/ml；所述冻存液为DMSO与Chang完全培养基按照1∶9的体积比混合而得；

将上述细胞悬液进行如下冻存程序：

第一步、4℃，等待；

第二步、1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步、10.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步、1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步、10.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步结束；得冻存样本；

将所述冻存样本放入液氮储存罐保存。

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