CN103305461A

CN103305461A - 一种以月经产物制备间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN103305461A
Application number: CN2013102771663A
Authority: CN
Inventors: 陈义龙; 高畅
Original assignee: Shunho Cell Biotech Tianjin Co ltd
Current assignee: Shun Hao Cell Biotechnology (tianjin) Ltd By Share Ltd
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: CN103305461B

Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种以月经产物制备间充质干细胞的方法，该方法采用月经产物采集、预处理、分离间充质干细胞、扩增间充质干细胞、冻存间充质干细胞得到间充质干细胞，该方法具有工业化简单、易于操作的优点。

Description

一种以月经产物制备间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以月经产物制备间充质干细胞的方法。

背景技术

随着干细胞研究的兴起，特别是对成体干细胞的深入研究，使得体外分离培养不同组织来源的干细胞并建立相应的细胞系成为可能。其中，有关间充质干细胞的体内分布、体外分离、培养、诱导分化、发育潜能等的研究已经取得了突破性进展。由于间充质干细胞在成体组织中分布广泛，易于获取，并且可以在体外模拟体内的条件下大量扩增培养，最重要的是其诸多的临床应用潜能已被证实，例如在组织工程创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中必不可少，而且在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。因此，间充质干细胞已成为一种生物医学工程领域的“明星细胞”，引起越来越多的科学家、新闻工作者、普通民众等人群的强烈关注。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）主要来源于胚胎发育早期的中胚层，其具有自我更新、多向分化和调节免疫等特点。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育的多种组织中，用的最多的也是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的增加，干细胞数量及其增殖分化能力显著降低；取材时对患者有损伤；有骨髓疾病时无法采集；即使是健康供者，亦不能抽取过多的骨髓。这些缺点都限制了骨髓来源间充质干细胞的应用。

近年来，也有研究者提出从新生儿月经产物来源血里分离提取间充质干细胞，并且证实月经产物来源血来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的生物学特性、免役表型、分化潜能等。但月经产物来源血来源的间充质干细胞分离效率较低，难以在细胞治疗及组织工程领域广泛应用。也有报道从胎儿的肝脏、肾脏、肺脏等部位分离提取间充质干细胞，但是来源于胎儿的间充质干细胞在临床应用时显然受到伦理道德及传统观念的限制。因此，寻找一种简单易行而且没有伦理道德限制的间充质干细胞来源已成为当务之急。

各项研究显示，伴随女性月经周期脱落的子宫内膜组织及血液成分中可以分离出大量间充质干细胞，并可在体外培养条件下大量扩增并保持其生物学特性不发生改变。相比骨髓/月经产物来源/月经产物来源血/胎肝/胎肾/胎肺等来源的间充质干细胞，月经产物来源的间充质干细胞分离方法简单、易于大量扩增培养，并且在采集月经血产物时没有痛苦、可多次采集、采集没有论理障碍限制等一系列的优点，月经产物势必成为一种新的可供科研及临床使用间充质干细胞来源。

发明方法

本发明的目的在于提供一种新的制备间充质干细胞的方法：以女性月经产物为原料，通过月经产物的采集、预处理、细胞的分离、培养、冻存等方法保存月经产物来源的间充质干细胞。该方法具有工业化简单、易于操作的优点，利用本发明的方法可以从月经产物中分离得到间充质干细胞，并可通过传代培养、冻存等方法制备及保存大量的间充质干细胞以满足科研及临床需求。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种新的间充质干细胞的制备方法：

1、一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于：

（1）月经产物采集

收集月经开始第2~3天的月经产物，将月经产物加入样本采集管内，样本采集管内的采集液为100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml及200U肝素，样本采集管可在0~12℃存放36小时；

（2）月经产物预处理

将采集的月经产物全部转移至样品杯中，加入0.1%~0.2% Ⅳ胶原酶，将样品杯封口后置于37℃恒温培养箱内震荡孵育，100~150转/分钟，30~60分钟；

（3）分离间充质干细胞

将孵育后的液体用100μm细胞筛网过滤，收集滤液，采用密度梯度离心收集单个核细胞的方法收集消化液内的月经产物来源间充质干细胞，具体操作为：在离心管内加入淋巴细胞分离液，将滤液叠加至淋巴细胞分离液上，在室温下离心，2000转/分钟，15分钟，离心结束后可见淋巴细胞分离液层上清晰的白膜层，吸取离心后上清液至离心管，加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，用电动吸液器吹打混合至均匀，1500转/分钟，离心10分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀；沉淀中加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为原代月经产物来源间充质干细胞；

（4）扩增间充质干细胞

取原代月经产物来源间充质干细胞与细胞培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液反复浸洗培养瓶底部贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%~0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1~3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心，1000转/分钟，离心 5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中加入培养液重悬；分装细胞悬液至若干个细胞培养瓶，各瓶补加培养液；待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增月经产物来源间充质干细胞；

（5）冻存间充质干细胞

取经扩增的月经产物来源间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1~3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心洗涤1~2次，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为待冻存的月经产物来源间充质干细胞；

将0~4℃冷藏后的细胞冻存保护液与待冻存的月经产物来源间充质干细胞混合，使细胞密度为1~3×10⁶/ml，将混合细胞后的冻存保护液分装至冻存管，分装完成后，将冻存管置于冻存盒中，在0~5℃冷藏20~40分钟，在零下80℃冷冻4~6小时，最后放入零下196℃保存，即得。

上述制备方法中冻存保护液为冻存保护液为胎牛血清（FBS）与二甲基亚砜（DMSO）混合液，体积比为9:1。

上述所述的培养液为体积比为9:1的DMEM/F12和胎牛血清（FBS）。

上述所述的冻存保护液的制备方法为：取胎牛血清（FBS），置于0~5℃条件下冷藏5~10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于0~5℃条件下冷藏5~10分钟。

本发明所述的青霉素和链霉素购自Gibco公司；pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）为自行配制；胰蛋白酶-EDTA消化液购自Gibco公司；DMEM/F12购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司，Ⅳ胶原酶购自Gibco公司，电动吸液器购自瑞宁公司。

附图说明

图1为实施例1分离得到的原代间充质干细胞

图2为实施例1传代扩增第3天的贴壁间充质干细胞

图3为实施例3间充质干细胞经诱导后所得角膜上皮细胞（Human Corneal Epithelial Cell，HCEPC）

制备实施例

实施例1

（1）月经产物采集

收集供者月经开始第3天的月经产物，将月经产物20ml加入到样本采集管内与20ml采集液混合，填写供者姓名及采集时间等信息，样本采集管保存在4℃运输箱内，运输至公司实验室处理。

（2）月经产物预处理

将40ml月经产物转移至100ml样品杯中，加入0.1% Ⅳ胶原酶10ml（月经产物和酶液的混合液终体积为50ml），将样品杯封口后置于37℃恒温培养箱内震荡孵育，120转/分钟，30分钟。

（3）分离间充质干细胞

将孵育后的50ml消化液用100μm细胞筛网过滤，收集滤液并加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至60ml；在2支50ml离心管内各加入15ml淋巴细胞分离液，分别吸取30ml稀释后的滤液叠加至淋巴细胞分离液上；在室温下离心，2000转/分钟，15分钟，吸取离心后10ml刻度以上的上清液35ml至50ml离心管，加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）至45ml，用电动吸液器吹打混合至均匀，1500转/分钟，离心10分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀；沉淀中加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为原代月经产物来源间充质干细胞。

（4）扩增间充质干细胞

配制细胞培养液，其为体积比为9:1的DMEM/F12和胎牛血清（FBS）混合液。

取原代月经产物来源间充质干细胞与10ml细胞培养液混合均匀，分别吸取5ml细胞悬液接种至2个底面积75cm²的细胞培养瓶，每瓶补加细胞培养液10ml；接种第2天上午去掉旧培养液，各加入15ml新鲜细胞培养液；以后第5天换液一次；第8天观察细胞已贴满培养瓶底90%以上，吸弃培养瓶内旧培养液，每次吸取pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml浸洗培养瓶底部贴壁细胞，反复浸洗2次，吸弃洗涤液；各加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1ml，静置2min，再各加入1ml胎牛血清（FBS）终止消化，再加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml制备细胞悬液；转移细胞悬液至1个50ml离心管内，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中加入30ml培养液重悬；分装细胞悬液至6个细胞培养瓶，各瓶补加10ml培养液；接种第2天上午去掉旧培养液，各加入15ml新鲜细胞培养液，接种第4天观察观察细胞已贴满培养瓶底90%以上，吸弃培养瓶内旧培养液，每次吸取pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml浸洗培养瓶底部贴壁细胞，反复浸洗2次，吸弃洗涤液；各加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1ml，静置2min，再各加入1ml胎牛血清（FBS）终止消化，再加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml制备细胞悬液；转移细胞悬液至4个50ml离心管内，配平离心管，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟；吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中各加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）10ml，用电动吸液器吹打使混合均匀；合并40ml细胞悬液至 1个50ml离心管，再次混匀，吸取10μl细胞悬液计数，计数结果为3.6×10⁷个；1000转/分钟，离心5分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为扩增后的待冻存的月经产物来源间充质干细胞。

（5）冻存间充质干细胞

配制细胞冻存保护液：取胎牛血清（FBS），置于4℃条件下冷藏10分钟，逐滴加入二甲基亚砜，滴加完成后，混合均匀，置于4℃条件下冷藏10分钟。

配制细胞冻存保护液18ml，配制好的细胞冻存保护液置于4℃冷藏10分钟后与步骤（4）待冻存的月经产物来源间充质干细胞混合，细胞密度为2×10⁶/ml。将混合细胞后的冻存保护液分装至18个2.0ml的冻存管，每管1.0ml。分装完成后，于冻存管外壁上写明细胞名称、冻存日期、细胞代数等信息。将冻存管置于冻存盒中，在4℃冷藏30分钟，在零下80℃冷冻5小时，最后放入零下196℃保存。

实施例2

月经产物来源间充质干细胞流式检测

按照流式细胞术检测细胞表面标志：收集3.5×10⁶个细胞，分装至6个微量离心管，加入PBS至1ml，离心1500rpm、10min、RT，弃上清，加入PE标记的CD73、CD105抗体以及FITC标记的CD45、CD34、HLA-DR抗体各10μl，剩余一管作为对照，4℃下避光孵育30min，PBS重复洗涤一次，再加入200μl的PBS重悬细胞，直接用流式细胞仪检测。

检测结果：CD73、CD90、CD105均为阳性，CD73阳性率97.3%、CD105阳性率99.5%；CD45、CD34、HLA-DR均为阴性，CD45阳性率0.2%，CD34阳性率0.6%、HLA-DR阳性率0.7%。

实施例3

月经产物来源间充质干细胞定向诱导分化为角膜上皮细胞（Human Corneal Epithelial Cell，HCEPC）

配制诱导培养液：为上述细胞培养液添加终浓度为50μg/L的表皮细胞生长因子（EGF）、10mg/L的牛血清白蛋白、5mg/L的转铁蛋白、30mg/L的牛脑垂体提取物、5mg/L的胰岛素及0.5mg/L的氢化可的松。即体积比为9:1的DMEM/F12和胎牛血清（FBS）的混合液中加入终浓度50μg/L的表皮细胞生长因子（EGF）、10mg/L的牛血清白蛋白、5mg/L的转铁蛋白、30mg/L的牛脑垂体提取物、5mg/L的胰岛素及0.5mg/L的氢化可的松，例如1000ml的细胞培养液中加入50μg的表皮细胞生长因子（EGF）、10mg牛血清白蛋白、5mg转铁蛋白、30mg牛脑垂体提取物、5mg胰岛素及0.5mg氢化可的松。

将实施例2所述经扩增后的P3~P4代月经产物来源间充质干细胞消化后制备单细胞悬液，取10μl细胞悬液计数后，用15ml细胞培养液接种1.5×10⁶个细胞至底面积75cm²的细胞培养瓶，接种第2天弃去全部旧培养液，加入15ml细胞培养液继续培养，第4天上午接种的细胞已贴满瓶底80%以上，弃去全部旧培养液，加入15ml诱导培养液，以后每3天全量更换一次诱导培养液，连续诱导21天，观察间充质干细胞形态学变化。第21天终止诱导培养，对诱导细胞行免疫荧光染色，检测角膜上皮细胞特异性蛋白AE5的表达。

加入诱导培养液3天后，可见部分单层贴壁的成纤维样细胞变圆变短，体积逐渐增大；诱导第7天，贴壁细胞已显示出上皮细胞形态，胞质比增大；继续诱导，上皮样细胞越来越多，细胞偏圆偏小，散在分布。

按照上述制备实施例的制备方法，可以获得大量合格的月经产物来源间充质干细胞，并可将其冻存以建立月经产物来源间充质干细胞库。月经产物来源间充质干细胞库还应有细胞来源登记、信息追溯、随机访问等机制。建立月经产物来源间充质干细胞数据库，包括但不局限于适宜的月经产物采集、运输、细胞分离、培养、扩增、冻存、复苏等技术以及相应的质量管理体系等。

制备实施例包括但不限于上述。

Claims

1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于：

（1）月经产物采集

收集月经开始第2~3天的月经产物，将月经产物加入样本采集管内，样本采集管内的采集液为100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）及肝素，样本采集管可在0~12℃存放36小时；

（2）月经产物预处理

（3）分离间充质干细胞

将孵育后的液体用100μm细胞筛网过滤，收集滤液，采用密度梯度离心收集单个核细胞的方法收集消化液内的月经产物来源间充质干细胞，具体操作为：在离心管内加入淋巴细胞分离液，将滤液叠加至淋巴细胞分离液上，在室温下离心，2000转/分钟，10分钟～20分钟，离心结束后可见淋巴细胞分离液层上清晰的白膜层，吸取离心后上清液至离心管，加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，混匀，室温下离心，1500转/分钟，5分钟～15分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀；沉淀中加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为原代月经产物来源间充质干细胞；

（4）扩增间充质干细胞

取原代月经产物来源间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液反复浸洗培养瓶底部贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%~0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1~3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中加入培养液重悬；分装细胞悬液至若干个细胞培养瓶，各瓶补加培养液；待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增月经产物来源间充质干细胞；

（5）冻存间充质干细胞

2.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中消化酶为终浓度0.1%~0.2%的Ⅳ胶原酶（Collagenase Ⅳ）。

3.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中分离间充质干细胞操作中离心参数分别为2000rpm，15min；1500rpm，10min；1000rpm，5min。

4.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中扩增间充质干细胞时细胞接种密度优化为2×10⁴/cm²，接种液体量为15ml。

5.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中冻存间充质干细胞时细胞冻存密度为1.5×10⁶/ml，装量为1.5ml；

一、申请发明专利或者实用新型专利应当提交权利要求书，一式一份；

二、权利要求书应当打字或者印刷，字迹应当整齐清晰，呈黑色，符合制版要求，不得涂改，字高应当在3.5毫米至4.5毫米之间，行距应当在 2.5毫米至3.5毫米之间，权利要求书首页用此页，续页可使用同样大小和质量相当的白纸。纸张应当纵向使用，只限使用正面，四周应当留有页边距：左侧和顶部各25毫米，右侧和底部各15毫米；

三、权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚和简要地表述请求保护的范围。权利要求书有几项权利要求时，应当用阿拉伯数字顺序编号，编号前不得冠以“权利要求”或者“权项”等词；

四、权利要求书中使用的科技术语应当与说明书中使用的一致，可以有化学式或者数学式，必要时可以有表格，但不得有插图。不得使用“如说明书……部分所述”或者“如图……所示”等用语；

五、每一项权利要求仅允许在权利要求的结尾处使用句号；

六、权利要求书应当在每页下框线居中位置顺序编写页码。