CN104560871B

CN104560871B - 经血间充质干细胞的培养方法

Info

Publication number: CN104560871B
Application number: CN201410836460.8A
Authority: CN
Inventors: 曾桂芳; 李陶; 杨威仁; 何毅欣; 胡祥; 刘沐芸
Original assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2034-12-29
Also published as: CN104560871A

Abstract

本发明提供了一种制备经血间充质干细胞的方法，包括采集女性经血为原料，无菌处理经血；分离经血中的干细胞；培养经血间充质干细胞；经血间充质干细胞的冻存；经血间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术特点：采集女性的经血，保存液于保存液中；防范细菌污染方法，从采集源头减少污染几率，用无菌水多次冲洗采集杯的，有效减少污染几率；采用差异离心方法，尽量除去经血中的细菌；通过羟乙基淀粉（HES）对样品进行重复多次分离，可获得最大量的经血间充质干细胞；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持经血间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力等。所用到的方法简单易行，操作方便，并且能最大量获得所需的干细胞并培养成功。

Description

经血间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种制备经血间充质干细胞的方法，属于干细胞技术领域

背景技术

胚胎干细胞(ESCs)具有细胞全能性可以分化成全部三层胚层细胞层的多种细胞类型。但是胚胎干细胞的成畸胎瘤的潜在性和其在大型临床应用方面的局限性严格限制了它在科学研究中的应用。但是，随着患有无数病症的患者的数目的增多，我们正在迫切的寻找具有使用临床价值的其他干细胞来源。许多其他来源的干细胞都可以用于在早期的临床试验，如心脏病，脊髓损伤，骨和软骨修复等。许多组织和器官的基质干细胞碎片都在体外显现了其多分化潜能性，因为它们可以分化成诸如神经原细胞系和生心细胞系，成骨细胞系，软骨细胞系和成脂细胞系。事实上，基质细胞可以分化成外胚层和中胚层细胞系，它们可以进一步进行它们的多潜能性分化。那么现在我们所面临的问题则是是否可以安全获得一个基质干细胞来源，其中这些干细胞都具有自我更新能力和原有的多分化潜能性。最近，基质干细胞已经被发现存在于子宫内膜组织内。但是直接获得这些细胞却是一个很具有损害性的过程。在每个月经周期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经周期的结束而停止。经血以及这些组织中含有一些具有可再生能力的细胞的异质群体。子宫基质细胞含有的多分化潜能性标志物与骨髓间质干细胞中存在的相同，事实上子宫基质细胞中的这些标志物部分是来源于骨髓的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经血来源样品在制备间充质干细胞中降低污染率的应用和经血间充质干细胞的培养方法。该分离制备的方法中用到物理的方法对样品进行初步的清洗并除去大部分细菌，再通过羟乙基淀粉（HES）对样品进行分离，获得经血间充质干细胞。所用到的方法简单易行，操作方便，并且能最大量获得所需的干细胞并培养成功。

经血间充质干细胞常采用淋巴细胞分离液分离获得经血干细胞，多用含10%FBS的培养基培养，多用含10%DMSO的冻存液冻存。

现有技术中，制备经血间充质干细胞的方法通常会存在以下不足之处：

1)经血干细胞分离的现有技术，无法除去经血采集过程中流经阴道而附带的细菌，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从采集源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染；

2) 现有分离方法，没有除去经血中细菌或真菌的操作步骤

3) 现有的分离方法，不能获得最大量的经血原始的干细胞，而本实验方法可以最大量的获得原始的经血干细胞

4）干细胞培养过程中细胞易衰老，细胞扁平，增值缓慢或停止增殖，失去分化能力等，目前尚未有方法或技术经验阐述有效维持经血间充质干细胞形态，防止细胞老化，维持细胞在增殖过程中保留分化能力；

5）间充质干细胞长期传代后可能发生端粒酶失活、癌基因表达增高抑癌基因表达下降、核型改变等风险，目前缺少经血间充质干细胞这方面的研究资料。

本发明采用的技术方案为：

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种制备经血间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1）使用月亮杯采集女性经期中第二天或第三天的经血作为原料；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，4℃保存。

2）48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，转移至离心管中，首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清。加入清洗，充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min ，除去上清。

3）加入1%-6%羟乙基淀粉（HES），充分混匀后，静止10-60分钟，取上层稍微清晰层，离心取得原始经血中的经血干细胞。

4）下层继续加入新的1%-6%羟乙基淀粉（HES），充分混匀后，静止10-60分钟，取上层稍微清晰层，离心取得原始经血中的经血干细胞。（重复2-3次）

5）将两次离心获得的原始经血干细胞，使用无血清培养基进行培养，其中P0代蜕膜间充质干细胞长满至80%-90%的密度后，使用0. 25%胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内进行传代，要求传代时细胞密度达到80%-90%以上，传代后细胞按3-8×10³个/cm2密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦PH变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；

6）P0～P30代蜕膜间充质干细胞的冻存：每10⁶-10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮或气氮中保存备用；

其中，

所述的步骤1）和步骤2）中的保存液为0.9%生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂。抗生素浓度为终浓度为0.5-3%的青霉素和链霉素以及终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B，以及肝素

所述的步骤2）中的清洗液为0.9%生理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B。其中青霉素和链霉素为0.5-3%的终浓度，两性霉素B为1-10ug/ml的终浓度。

所述的步骤5）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、 bFGF、(TGF)-β1、EGF和Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL；

所述的步骤6）中的经血间充质干细胞冻存液由基础液、渗透性冷冻保护剂所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4 mol/L所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。

本发明的制备蜕膜间充质干细胞的方法，具有如下技术效果：

1）选择经期中第二或第三天的经血作为原料，保存于保存液中，可以防范污染方法，从源头减少污染几率。

2）差异离心洗涤经血样品，利用密度差尽量除去细菌，有效减少污染几率；

3）本专利方法中在分离经血间充质干细胞时候，采用羟乙基淀粉多次沉淀法，可最大量的获得经血原始干细胞，提高生产量；

4）使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞可按此方法从P0代传代至P30维持性能稳定，可维持蜕膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持经血间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定；

5）本方法中酶消化和冻存复苏对细胞无伤害。

附图说明

图1 是经血样品羟乙基淀粉沉淀静止时的实验图

图2是经血样品原代培养的经血间充质干细胞形态图

图3是经血间充质干细胞的表面标记检测结果图；

图4是采用无血清培养基培养的P0～P10代蜕膜间充质干细胞形态图；

图5是采用无血清培养基培养的P2、P5和P10代蜕膜间充质干细胞，与老化细胞和未分化细胞形态的对照图；

图6是生长曲线测定检测结果图；

图7是成骨、成脂、成软骨诱导分化检测结果图；

图8是不同代次经血干细胞流式检测结果图；

图9是端粒酶检测结果图；

图10是癌基因检测结果图；

图11是G显带核型分析结果图。

具体实施方式

实施例1 制备蜕膜间充质干细胞

本实施例中的制备经血间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

使用女性专用的月亮杯，采集女性第二或第三天的经血，每次采集经血量10-12ml。将采集到的经血马上倒入装有保存液的收集瓶中，4℃保存，尽快送到实验室进行处理。在实验室中对样品进行差异离心洗涤尽量去除细菌，再加入羟乙基淀粉（HES）获得经血中的单个核细胞，进行培养间充质干细胞。

所述原代培养方法为：

（1）使用月亮杯采集女性经血量多的一天，采集2-3次，每次采集3-15ml经血。将每次采集到的经血马上倒入装有保存液的收集瓶中，拧紧保存液瓶盖，4℃保存，24-48小时内送到实验室进行处理。

（2）在无菌操作中，将经血样品转移至新的无菌管中，加入含有终浓度为0.5-3%的青霉素和链霉素以及终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B的清洗液中，充分重悬洗涤样品。

（3）对样品进行离心洗涤。首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清，加入清洗液充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min ，除去上清。

（4）经血经过离心洗涤后，加入2%-6%羟乙基淀粉充分混匀后静置10-60分钟，待样品分层，取上层样品。重复2-3次。

（5）取上层样品转移至新的收集管中加入清洗液充分混匀，离心200-400g/10min，去上清。

（6）将离心洗涤后的细胞加入无血清培养基,置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养二氧化碳恒温恒湿培养箱条件： 37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%。

（7）次日，在无菌操作下将细胞中的培养基轻轻吸出，弃去。加入新的培养基晃匀，继续培养。此后每三天换一次液。

（8）培养5-13天后即可获得经血间充质干细胞原代细胞混合液。

所述细胞传代培养方法为

（1）倒置显微镜镜下观察细胞融合达85%～90%后，将培养容器取出培养箱，将培养容器内旧培养液转移至50ml离心管，备用。用4～5ml生理盐水轻轻冲洗细胞培养瓶1～2遍，洗涤后的生理盐水弃去。

（2）消化：每个培养容器按比例加入0. 25%胰酶消化细胞，轻轻摇动培养容器，使消化液流遍所有细胞表面，消化时间为3～5min（同时在倒置显微镜镜下观察到细胞大部分由梭形变为圆形），消化结束后向每个培养容器中加入培养基适量，反复吹打容器底或摇动容器至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养容器中加入适量生理盐水冲洗容器壁，洗涤液合并加入离心管中，用生理盐水定容至50ml，200g，10min离心洗涤，去除上清液。

（3）细胞计数：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量生理盐水，轻轻吹打重悬浮细胞，吹打混匀，取样计数。计数后200g，10min二次离心，去除上清液。

（4）在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度3-8x10³个/cm2。

（5）将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件： 37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%。培养至细胞融合达85%～90%。

所述细胞冻存方法为：

（1）配制保护剂浓度为终浓度2倍、终体积一半的冻存液（即10%DMSO+培养基），往培养基中添加DMSO时，需沿着管壁缓缓加入，置于4℃冰箱10min以上；

（2）消化：观察需冻存的细胞融合达85%～90%后，每个培养容器按比例加入25%胰酶消化细胞，轻轻摇动培养容器，使消化液流遍所有细胞表面，消化时间为3～5min（同时在倒置显微镜镜下观察到细胞大部分由梭形变为圆形），消化结束后向每个培养容器中加入培养基适量，反复吹打容器底或摇动容器至细胞大部分脱落,移入50ml离心管中，原培养容器中加入4～5ml 4℃预冷生理盐水冲洗容器壁，洗涤液合并加入离心管中，用4℃预冷生理盐水定容，200g，10min离心洗涤。

（3）细胞计数：将洗涤后的离心管中加入1～2ml培养基，用1ml枪头轻轻吹打混匀，合并5～10个离心管中的细胞悬液至1个离心管中，用3ml塑料吸管轻轻吹打混匀，取10µl细胞悬液计数，并计算细胞活率。

（4）根据细胞计数结果，在离心管中加入一定量培养基，使管内细胞密度为冻存终密度的2倍。

（5）向细胞悬液中沿管壁缓缓加入与管内已加入专用培养基等体积的细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度与指令要求一致。（冻存密度范围：0.5～1×10⁷/ml）

（6）将细胞悬液分装于冻存管内，每管1ml。

（7）在冻存管上做好标记，包括脐带编号、细胞代数、细胞冻存批号、冻存日期、操作者等相关信息。

（8）将需冻存的细胞置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。

所述细胞复苏方法为

(1)恒温水浴箱的温度调节至40℃；从液氮中取出细胞冻存管，立即投入40℃ 温水中轻轻晃动，直至冻存液完全溶解。

(2)打开冻存管盖子，往冻存管中缓缓加入4℃预冷生理盐水1ml（注意动作轻柔），轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到50ml离心管内；再次往冻存管中加入1ml 4℃预冷生理盐水，1ml枪头吹打洗涤，一并移入离心管中。

(3)往离心管中缓缓加入4℃预冷生理盐水200g离心10min，弃上清液。

（4）往离心管中加入相应培养基，轻轻吹打混匀，转移至培养瓶中，二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养。

所述OLYMPUS显微镜拍照方法为

培养出的经血间充质干细胞融合至80-90％以上，将其置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图2，图4，图5所示。

所述细胞表面标志流式检测方法

将5×10⁶细胞消化成单细胞悬液；以PBS洗涤两遍后调整浓度至1×10

⁵/ml，流式细胞仪检测细胞表面标记阳性指标CD90、CD73和CD105，阴性指标CD34、CD14、CD45、CD79a、HLA-DR，阳性细胞率均超过95％，阴性指标符合低于2%，符合间充质干细胞的特征，如图3所示。

所述细胞生长曲线绘制的方法

取制备好的细胞，消化至单细胞悬液；无血清培养基调整浓度至1×10⁴/ml，点加入96孔板中；设13组每组8个复孔，每孔200μl，置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养；每2天换液，分别在培养至1-13天后，每孔加20μl的浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)，继续培养；4小时后小心移去培养上清；每孔加入100μl的二甲基亚砜，微量振荡器震荡5分钟；置酶标仪上测570nm或490nm下的光吸收值，统计学分析后绘制出生长曲线。如图6所示。

所述多向分化能力鉴定方法为

将1×10⁴/ml的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至60-80％，换成Invitrogen公司的成骨诱导完全培养基，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导24天后，茜素红染色后拍照，可见有大量钙结节产生，如图7所示。

将1×10⁴/m的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至80-90％，换成Invitrogen公司的成脂诱导完全培养基，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导14天后，油红O染色后拍照，可见所有细胞内均有脂滴产生，如图7所示。

将5×10⁵的P2代细胞悬液接种于15ml的离心管中，离心后培养，第二天换成Invitrogen公司的成软骨诱导完全培养基，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导21天后，切片，阿尔新蓝染色拍照，可见所有细胞内均有软骨产生，如图7所示。

所述的细胞端粒酶检测的方法为

取1*10⁶ 细胞根据TRAPEZE® Telomerase Detection Kit试剂盒的说明书提取样品进行鉴定，检测结果如图9 所示，可以看出多次传代后细胞未丧失端粒酶活性；

所述的细胞癌基因与抑癌基因检测的方法为

取经血间充质干细胞1x10⁶ 细胞提取RNA（参照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书），逆转录为CDNA(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit），加入癌基因以及抑癌基因进行荧光定量PCR检测。使用2-△△Ct方法分析实验数据，检测相关原癌基因与抑癌基因的表达是否发生显著变化。Real-time PCR 检测癌基因（c-Myc，c-fos，k-ras）和抑癌基因（P53，P21，RB）表达，检测结果如图10 所示，可以看出癌基因和抑癌基因表达表达较稳定；

所述的细胞核型分析的方法为

取培养中的经血间充质干细胞秋水仙素处理，消化，离心收集，PBS洗涤。低渗KCL（0.075M）处理，处理时间在20-40分钟，滴加少量固定液，离心1500rpm X 5min去上清，保留１ml上清，轻轻吹打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。离心去上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。4度过夜，离心去上清。滴片，载玻片事先放在0度冰水浴，取出玻片后从高处滴片。快速过火或空气干燥，.吉姆萨染色后，镜下观察染色体是否正常。图11所示。

Claims

1.一种制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使用月亮杯采集女性经期中第二天或第三天的经血作为原料；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，4℃保存；

2）48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，转移至离心管中，首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清；加入清洗液，充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min ，除去上清；

3）差异离心后，加入1%-6%羟乙基淀粉，充分混匀后，静止10-60分钟，取得经血中的经血干细胞；

4）使用无血清培养基培养经血间充质干细胞，其中P0代经血间充质干细胞长满至80%密度后，使用胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内一固定时间点进行传代，要求传代时细胞密度80%-90%以上，传代后细胞按3-8×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；

5）P0～P30代蜕膜间充质干细胞的冻存：每10⁶-10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮或气氮中保存备用；

所述步骤1）中，保存液采用的抗生素浓度为终浓度为0.5-3%的青霉素和链霉素以及终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B与生理盐水充分混匀；

所述步骤4）传代培养为：在原代细胞融合达85%～90%，进行传代培养，传代细胞密度为3-8×10³个/cm²；

所述的差异离心为首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清，加入含有抗生素的生理盐水充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min ，除去上清；

所述步骤5）冻存的方法：

1A）配制保护剂浓度为终浓度2倍、终体积一半的冻存液，即10%DMSO+培养基，往培养基中添加DMSO时，需沿着管壁缓缓加入，置于冷藏冰箱10min以上；

2A）消化：观察需冻存的细胞融合达85%～90%后，每个培养容器按比例加入胰酶消化细胞，轻轻摇动培养容器，使消化液流遍所有细胞表面，消化时间为3～5min；同时在倒置显微镜镜下观察到细胞大部分由梭形变为圆形，消化结束后向每个培养容器中加入培养基适量，反复吹打容器底或摇动容器至细胞大部分脱落,移入离心管中，原培养容器中加入4～5ml预冷生理盐水冲洗容器壁，洗涤液合并加入离心管中，用预冷生理盐水定容，离心洗涤；

3A）细胞计数：将洗涤后的离心管中加入1～2ml培养基，用枪头轻轻吹打混匀，合并5～10个离心管中的细胞悬液至离心管中，用塑料吸管轻轻吹打混匀，取细胞悬液计数，并计算细胞活率；

4A）根据细胞计数结果，在离心管中加入一定量培养基，使管内细胞密度为冻存终密度的2倍；

5A）向细胞悬液中沿管壁缓缓加入与管内已加入专用培养基等体积的细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度范围在0.5～1×10⁷/ml；

6A）将细胞悬液分装于冻存管内，并冻存管上做好标记；

7A）将需冻存的细胞置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐；

其中，

所述的步骤1）和步骤2）中的保存液为0.9%生理盐水；

所述的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、 bFGF、(TGF)-β1、EGF和Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL；

所述的步骤5）中的冻存液由基础液、渗透性冷冻保护剂，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4 mol/L，所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。

2.如权利要求1所述的制备经血间充质干细胞的方法，其特征是：所述步骤1）中，获取经血干细胞的方法为对经血进行差异离心充分洗涤并除菌，再用羟乙基淀粉获得经血中的干细胞。

3.如权利要求1所述的制备经血间充质干细胞的方法，其特征是：所述步骤4）中，原代培养的方法为，将重悬的经血干细胞分装到培养瓶中，添加无血清培养基，置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养，培养条件恒温为37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%；每隔2-3天换液一次。

4.如权利要求1所述的制备经血间充质干细胞的方法，其特征是：所述的步骤1）和步骤2）中的保存液还含有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素、两性霉素B。