CN106011052A - 一种高纯度经血来源干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高纯度经血来源干细胞的制备方法：使用经血采集套装收集经血；收集中间层单个核细胞；加入磁珠缓冲液，充分混匀后加入FcR试剂，孵育后再加入交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后孵育；再加入磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中；加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；将分选柱取出，加入1.5‑2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；将所得悬液用经血干细胞原代培养基培养，每2‑3天半量换液一次；培养5‑7天后消化收集贴壁细胞，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；消化所得细胞，加入冻存液进行冻存。该方法获得的经血来源干细胞纯度高，生长周期短，自我更新能力强、污染率低。

Description

一种高纯度经血来源干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种高纯度经血来源干细胞的制备、体外培养扩增和冻存方法。
背景技术
经血干细胞来源于女性月经期间随经血脱落的子宫内膜组织，属于成体干细胞中的一类，并有着接近胚胎干细胞的多向分化潜能，在骨损伤、脊髓损伤、神经损伤、肝病、糖尿病、心血管疾病等重大疾病上有着广阔的临床应用前景。研究发现，经血来源的干细胞较之胚胎、骨髓、脐血等干细胞有着无可比拟的优势，如：采集方法简单安全，不具有侵入性，完全可自行采集，对供者不会造成伤害；分离的干细胞数量是骨髓来源的30倍，可以为疾病治疗提供丰富的干细胞来源；体外增殖能力强，一般24-36小时扩增一倍，可传代高达50次；增殖能力是骨髓干细胞的10多倍，能在短时间内提供治疗所需的足够细胞；分化潜能性大，除具备间充质干细胞一般特征外，还能表达Oct-4、SSEA-4和c-Kit/CD117等胚胎干细胞表面标志物，表明经血来源干细胞在再生医学上的巨大潜能；多次传代后，染色体核型无异常变化，动物实验显示无致瘤性，表明经血来源干细胞在临床应用领域的安全性；经血干细胞还具有免疫原性低，可供异体移植而无免疫排斥风险等优点。此外，经血干细胞来源广泛，理论上绝经前的大部分健康女性都可以作为潜在的供者，且不存在伦理道德争议。
然而，现有采集和分离培养技术条件下，由于采集得到的经血样本中细胞种类繁多，功能各异，在原代培养阶段表现为细胞形态多样，均一性差，表明其杂细胞多、干细胞纯度低，必须再经过3-5代的培养时间才能获得纯度较高的经血干细胞，同时该技术方法下培养细胞还存在较大的病菌、支原体污染风险。以上局限性都会影响到获得的干细胞进一步应用于实验研究和临床应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，通过该方法获得的经血来源干细胞具有纯度高，生长周期短，自我更新能力强、污染率低等特点，体外培养20代以内，干细胞未出现明显衰老及分化现象，能维持较快的增殖速度、稳定的形态和表型特征。
本发明所采用的技术方案为：
一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，该方法包括以下操作步骤：
(1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的混合体积比为(1-1.5):1，2-8℃下低温保存，保存期≤72小时；
(2)将经血采集管离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；
(3)将细胞沉淀与生理盐水按1:(1-1.5)的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心；
(4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1×108细胞：加入100-200μl磁珠缓冲液，充分混匀后加入50-100μlFcR试剂，2-8℃孵育5-10分钟后再加入50-100μl交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后在2-8℃孵育10-20分钟；
(5)步骤(4)所得液体再加入1-1.5ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为1×108细胞/ml；
(6)将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；
(7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5-2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；
(8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000-7000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2-3天半量换液一次；
(9)细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80％密度，消化收集贴壁细胞，按3000-5000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；
(10)将消化所得的细胞混合于2-8℃预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为0.1-1×107细胞/ml，放入冻存盒，于-80℃冰箱放置12-24小时后转入-196℃液氮冻存。
所述步骤(1)中抗生素保存液以HBSS(Hank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250μg/mL、庆大霉素120μg/mL及两性霉素B 3μg/mL。
所述步骤(2)中离心具体为：以(400-600)×g离心10分钟。
所述步骤(4)中抗人抗体为抗人CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、CD34、CD45单克隆抗体中的一种。
所述磁珠缓冲液的具体配方为：以磷酸缓冲盐溶液为基液，含体积百分比为0.5％的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)，含终浓度为2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。
所述步骤(6)中分选柱为MS分选柱、LS分选柱、XS分选柱中的一种。
所述步骤(8)中经血干细胞原代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为40％的Chang Amnio培养基，体积百分比为29％的UltraCULTURE培养基，体积百分比为1％的青/链双抗。
所述步骤(8)中细胞培养瓶为T25方瓶或T75方瓶；所述步骤(9)中细胞培养瓶为T150方瓶或T75方瓶。
所述步骤(9)中经血干细胞传代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为35％的Chang Amnio培养基，体积百分比为35％的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ng/ml的EGF(表皮生长因子)，浓度为10-20ng/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子)。
所述步骤(9)中消化细胞采用TrypLE Express或0.25％胰酶。
所述步骤(10)中经血干细胞冻存液：含体积百分比为32-40％的细胞培养液上清，体积百分比为8-10％的二甲基亚砜(DMSO)，体积百分比为25-30％的Chang Amnio培养基，体积百分比为25-30％的UltraCULTURE培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)本发明通过磁珠分选得到带有多向分化潜能表面抗原标记的经血干细胞前体细胞，再经过体外无血清培养基传代培养，不仅去掉了大量杂细胞，也降低了发生污染的风险，同时由于培养起始干细胞纯度较高，干细胞扩增速度快，培养周期显著缩短，且培养所得细胞具有多向分化能力强、临床应用安全性高的特点，具有广阔的临床治疗应用前景；
(2)获得的经血干细胞培养基为以商业培养基为原料，按一定比例进行配制所得，不添加异源血清，成分较为明确，无外源性细菌、病毒污染风险，适合临床治疗应用；
(3)使用的冻存液有利于细胞活性维持和复苏，有利于该经血来源干细胞的功能研究和进一步应用。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P1代时倒置显微镜下观察到的细胞形态图；其中(A)为对比例的P1代细胞、(B)为实施例1的P1代细胞。
图2所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞扩增曲线。
图3所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时端粒酶活性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：高纯度经血来源干细胞的制备
本实施例高纯度经血来源干细胞的制备，具体包括以下步骤：
(1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的混合体积比为1:1，2-8℃下低温保存，保存期≤72小时；
所述抗生素保存液以HBSS(Hank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250μg/mL、庆大霉素120μg/mL及两性霉素B 3μg/mL。
(2)将采集管以600×g离心10分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
(3)将细胞沉淀与生理盐水按1:1的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心。
(4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1×108细胞：加入100μl磁珠缓冲液，充分混匀后加入100μlFcR试剂(Miltenyi Biotec，货号130-091-332)，2-8℃孵育5-10分钟后再加入100μl交联抗人抗体(抗人CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、CD34、CD45单克隆抗体中的一种)的微磁珠试剂(Miltenyi Biotec，货号130-091-332，粒径50nm)，混匀后在2-8℃孵育15分钟；
(5)加入1ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为1×108细胞/ml；
本实施例磁珠缓冲液的具体配方为：以磷酸缓冲盐溶液(PBS)为基液，含体积百分比为0.5％的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)，含终浓度为2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。
(6)将上述细胞悬液全部加入到放置于磁性分选架的MACS分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤。
(7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液。
(8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按6000细胞/cm2的密度接种到T25方瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2-3天半量换液一次。
所述经血干细胞原代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为40％的Chang Amnio培养基，体积百分比为29％的UltraCULTURE培养基，体积百分比为1％的青/链双抗。
(9)细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80％密度，用TrypLEExpress消化并收集贴壁细胞，按5000细胞/cm2的密度接种到T75方瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养。
所述经血干细胞传代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为35％的Chang Amnio培养基，体积百分比为35％的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ng/ml的EGF(表皮生长因子)，浓度为10-20ng/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子)。
(10)将消化所得的细胞混合于经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为1-10×107细胞/ml，于-80℃放置12-24小时后，转入-196℃液氮冻存。
所述经血干细胞冻存液：含体积百分比为32％的细胞培养液上清，体积百分比为8％的二甲基亚砜(DMSO)，体积百分比为30％的Chang Amnio培养基，体积百分比为30％的UltraCULTURE培养基。
对比例：
(1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的体积比为1:1，2-8℃下低温保存，保存期≤72小时；
所述抗生素保存液以HBSS(Hank's平衡盐溶液)为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250μg/mL、庆大霉素120μg/mL及两性霉素B 3μg/mL。
(2)将采集管以600×g离心10分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
(3)将细胞沉淀与生理盐水按1:1的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心。
(4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，按6000细胞/cm2的密度接种到T25方瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2-3天半量换液一次。
所述经血干细胞原代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为40％的Chang Amnio培养基，体积百分比为29％的UltraCULTURE培养基，体积百分比为1％的青/链双抗。
(5)细胞培养至10-15天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80％密度，用TrypLEExpress消化并收集贴壁细胞，按5000细胞/cm2的密度接种到T75方瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养。
所述经血干细胞传代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为35％的Chang Amnio培养基，体积百分比为35％的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ng/ml的EGF(表皮生长因子)，浓度为10-20ng/ml的bFGF(碱性成纤维生长因子)。
(6)将消化所得的细胞混合于经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为1-10×107细胞/ml，于-80℃放置12-24小时后，转入-196℃液氮冻存。
所述经血干细胞冻存液：含体积百分比为32％的细胞培养液上清，体积百分比为8％的二甲基亚砜(DMSO)，体积百分比为30％的Chang Amnio培养基，体积百分比为30％的UltraCULTURE培养基。
检测方法：
(一)细胞形态观察：
将待检的细胞培养瓶放置于带摄像功能的倒置显微镜下观察。经血干细胞呈梭形，具折光性，高密生长条件下成簇排列。通常细胞形态越均一表明纯度越高。
图1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P1代时倒置显微镜下观察到的细胞形态图；其中(A)为对比例的P1代细胞、(B)为实施例P1代细胞。从(A)可以看出对比例的P1代细胞形态多样，呈椭圆、半月、多角及梭形，而实施例1的P1代细胞形态较为均一，主要呈长梭形(B)。由此可见，实施例1的P1代细胞中干细胞纯度显著高于对比例，且具有典型的间充质干细胞形态特征。
(二)细胞扩增曲线：
当细胞长到70-80％密度后，从培养箱中取出细胞消化，取0.5-1ml细胞悬液样本用细胞计数仪计数，所得细胞密度乘以细胞悬液总体积即为细胞总量。在细胞培养P1至P5每次传代时计细胞总量。根据细胞计数结果，以培养时间(天)为横坐标，以扩增倍数为纵坐标，绘制细胞扩增曲线(P1代细胞的扩增倍数设为1)。
图2所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞扩增曲线；从图2可见，实施例1的各代次细胞传代时间均早于对比例，培养期间的扩增速度也明显更快，达到相同扩增倍数所需的生长周期也更短。
(三)端粒酶活性分析：
细胞传代培养过程中采用TRAP(端粒酶重复序列扩增程序)分析方法检测其端粒酶活性。取1×105待测细胞，用裂解液裂解后取1μg上清，进行端粒酶重复序列PCR反应，反应产物用DIG标记的探针杂交后，用酶标仪检测吸光度。本实验中，人胚胎干细胞(hESC)作为阳性对照(100％)。
图3所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时端粒酶活性。从图3可见，实施例1的经血干细胞在各传代时间的端粒酶活性均高于对比例，表明实施例1的干细胞具有更强的自我更新和增殖能力。
(四)细胞表面标志物流式分析：
取(0.5-1)×106P5代经血干细胞，抗体稀释液洗涤2遍后加入5μlPE(藻红蛋白)或FITC(异硫氰酸荧光素)标记的抗人CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、CD34、CD45、HLA-DR抗体，4-8℃避光孵育30分钟，抗体稀释液洗涤2遍后重悬于500ul抗体保存液中。用流式细胞仪检测细胞样本中上述抗体阳性率。
表1所示的是本发明实施例1与对比例经血干细胞培养到P5代时细胞表面标记物的流式分析结果。从表1可见，实施例1的P5代细胞CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44表达率均高于对比例细胞，表明其维持更强的间充质样干细胞特性，及更高的干细胞纯度。此外，实施例1干细胞还维持较高水平的CD117表达率，表明其拥有更强的生存、增殖和多系分化能力。
表1
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的混合比例为(1-1.5):1，2-8℃下低温保存，保存期≤72小时；
(2)将经血采集管离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；
(3)将细胞沉淀与生理盐水按1:(1-1.5)的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心；
(4)将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1×108细胞：加入100-200μl磁珠缓冲液，充分混匀后加入50-100μl FcR试剂，2-8℃孵育5-10分钟后再加入50-100μl交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后在2-8℃孵育10-20分钟；
(5)步骤(4)所得液体再加入1-1.5ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为1×108细胞/ml；
(6)将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；
(7)将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5-2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；
(8)将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000-7000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2-3天半量换液一次；
(9)细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80％密度，消化收集贴壁细胞，按3000-5000细胞/cm2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；
(10)将消化所得的细胞混合于2-8℃预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为0.1-1×107细胞/ml，放入冻存盒，于-80℃冰箱放置12-24小时后转入-196℃液氮冻存。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中抗生素保存液以HBSS为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250μg/mL、庆大霉素120μg/mL、两性霉素B 3μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中抗人抗体为抗人CD73、CD105、CD166、CD90、CD29、CD44、CD117、CD34、CD45单克隆抗体中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述磁珠缓冲液的具体配方为：以磷酸缓冲盐溶液为基液，含体积百分比为0.5％的胎牛血清或牛血清白蛋白或人血清白蛋白，含终浓度为2mM的乙二胺四乙酸。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中分选柱为MS分选柱、LS分选柱、XS分选柱中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(8)中经血干细胞原代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为40％的Chang Amnio培养基，体积百分比为29％的UltraCULTURE培养基，体积百分比为1％的青/链双抗。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(8)中细胞培养瓶为T25方瓶或T75方瓶；所述步骤(9)中细胞培养瓶为T150方瓶或T75方瓶。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(9)中经血干细胞传代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为35％的Chang Amnio培养基，体积百分比为35％的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ng/ml的EGF，浓度为10-20ng/ml的bFGF。
9.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(9)中消化细胞采用TrypLE Express或0.25％胰酶。
10.根据权利要求1所述的一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤(10)中经血干细胞冻存液：含体积百分比为32-40％的细胞培养液上清，体积百分比为8-10％的二甲基亚砜，体积百分比为25-30％的ChangAmnio培养基，体积百分比为25-30％的UltraCULTURE培养基。
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