CN105420189A - 一种无血清培养基及其制备方法和用途 - Google Patents

一种无血清培养基及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型无血清培养基。该培养基成分包括：所述无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、4-6体积份的人间充质干细胞培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。所述培养上清浓缩液通过以下步骤制得：收集脐带间充质干细胞培养上清液，离心去除细胞、细胞碎片与杂质等，微滤膜过滤，超滤浓缩。利用本发明的培养基进行干细胞培养，细胞在长期培养情况下依然保持多向分化潜能及较强的增殖能力。

Description

一种无血清培养基及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种新型、高效的无血清培养基及其制备方法和用途。
背景技术
间充质干细胞普遍存在于人体多种组织和器官中，并具有多向分化潜能，具有刺激组织再生、调节免疫等功能，在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。
骨髓间充质干细胞已经在临床上得到了广泛应用，而目前的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。其中，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(humanUmbilicalCordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)表达多种胚胎干细胞的特有标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，而且研究证实hUC-MSCs在神经疾病、免疫系统、内分泌系统以及癌症、心脏病等疾病的动物模型和临床研究中有良好治疗效果，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。
若要将hUC-MSCs进一步应用于临床，最重要的就是hUC-MSCs的体外大量扩增达到有效的临床治疗剂量，因此hUC-MSCs的体外培养成为了最基础同时也是最重要的技术之一。现有的hUC-MSCs培养方法多采用在基础培养基中添加FBS、青链霉素，但非人血清成分复杂，使hUC-MSCs在长期的培养过程中易分化，且存在传播异种病原体的危险。
此外，虽然已有科研工作者开发出多种类型的血清替代物，但目前市场可购买的供hUC-MSCs培养的血清替代物以及完全培养基的培养效果仍不理想，尤其对于干细胞的贴壁、增殖、以及细胞长期培养后的稳定性的维持等特性均无法达到预期效果。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的发明人研究发现，在hUC-MSCs的培养过程中，细胞会分泌多种对自身生长有利的因子、蛋白等成分，可以利用这些成分在无血清环境下进行细胞、特别是干细胞的长期扩增培养。
因此本发明的目的是提供一种无血清培养基，该培养基中含有从细胞培养物获得的浓缩液，特别适合在无血清环境下培养细胞。
本发明的另一个目的是提供该无血清培养基的制备方法。
本发明的又一个目的是提供所述培养基在制备干细胞培养介质中的用途。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供了一种无血清培养基，所述无血清培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的培养上清浓缩液。
优选地，所述无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、4-6体积份的培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；
更优选地，所述无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、5体积份的培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：
收集人脐带间充质干细胞培养上清液，离心，微滤膜过滤，超滤浓缩。
优选地，所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：
(1)将人脐带间充质干细胞以0.5-4×104个细胞/cm2的密度接种于无血清培养基中培养48-72小时使得细胞达70％-90％汇合，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；
(2)在4℃下以3000-5000g离心15-40min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；
(3)将经步骤(2)得到的上清液在4℃下以10000g离心30-60min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；
(4)将经步骤(3)得到的上清液过0.22μm微滤膜除菌；
(5)将经步骤(4)得到的滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃下以3000-4500g离心60-90min，将滤过液浓缩至其体积的1/20至1/50；
(6)将经步骤(5)得到的浓缩液以PBS缓冲液调节终体积为步骤(1)中收集的细胞培养上清液的1/20。
在步骤(1)中，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)优选为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。
并且优选地，步骤(1)中的无血清培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和任选的人脐带间充质干细胞的培养上清浓缩液；优选包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、任选的4-6体积份的培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、任选的5体积份的培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
另一方面，本发明提供所述无血清培养基的制备方法，所述制备方法包括：
收集人脐带间充质干细胞培养上清液，离心，微滤膜过滤，超滤浓缩，得到培养上清浓缩液；
采用β-巯基乙醇、非必需氨基酸和a-MEM/DMEM-F12配制预混液；
将培养上清浓缩液、预混液和重组人碱性成纤维生长因子混合。
其中，所述培养上清浓缩液优选通过包括以下步骤的方法制得：
(1)将人脐带间充质干细胞以0.5-4×104个细胞/cm2的密度接种于无血清培养基中培养48-72小时使得细胞达70％-90％汇合，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；
(2)在4℃下以3000-4500g离心15-40min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；
(3)将经步骤(2)得到的上清液在4℃下以10000g离心30-60min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；
(4)将经步骤(3)得到的上清液过0.22μm微滤膜除菌；
(5)将经步骤(4)得到的滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃下以3000-4500g离心60-90min，将滤过液浓缩至其体积的1/20至1/50；
(6)将经步骤(5)得到的浓缩液以PBS缓冲液调节终体积为步骤(1)中收集的细胞培养上清液的1/20。
又一方面，本发明提供所述无血清培养基在制备干细胞培养介质中的用途。
其中，所述干细胞从哺乳动物、例如人的组织或器官中分离得到，所述组织或器官为骨髓、脐带和脂肪中的一种或多种；优选地，所述干细胞为哺乳动物来源的脐带间充质干细胞，更优选为人来源的脐带间充质干细胞；进一步优选地，所述干细胞是从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。
发明人研究发现，人脐带间充质干细胞在培养过程中会分泌多种对细胞自身生长有利的因子、蛋白等成分。基于此，本发明利用人脐带间充质干细胞培养上清液经浓缩得到的浓缩液提供了一种新型的无血清培养基。利用本发明的培养基可在无血清环境下进行干细胞的长期扩增培养，同时该干细胞依然保持多潜能性及较强的增殖能力，该干细胞可以是来自哺乳动物(例如人)的骨髓、脐带和脂肪中的一种或多种，特别是从新生儿脐带中分离得到的脐带间充质干细胞。
具体而言，本发明提供的新型无血清培养基不含血清成分，避免了在细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能；并且，该无血清培养基的使用解决了常规无血清培养中细胞贴壁能力差，增殖缓慢的缺点，且在长期培养过程中，仍能保持良好的增殖能力和多向分化潜能，为动物细胞的体外培养提供了一种高效的解决方案；此外，培养上清液本身是细胞培养的废弃物，其回收利用降低了细胞培养的成本。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是在培养基组成筛选过程中的细胞图，其中图1A为高浓度β-巯基乙醇培养基在细胞接种4小时后细胞形态，图1B为低浓度bFGF培养基接种24小时后细胞形态，图1C为高浓度bFGF培养基培养细胞在传代后细胞形态，图1D为低浓度培养上清浓缩液培养基培养细胞形态，图1E为高浓度培养上清浓缩液培养基培养细胞形态。
图2是使用本发明的无血清培养基培养脐带间充质干细胞的图片，其中图2A为接种2小时后的细胞形态，图2B为接种24小时后的细胞形态，图2C为接种48小时后的细胞形态。
图3为利用本发明的无血清培养基与其他培养基进行hUC-MSC持续传代的倍增曲线研究结果，表明利用本发明的无血清培养基培养的hUC-MSC在长期培养中仍能保持较高增殖速度。图中的SCL-M1和SCL-M2为本发明无血清培养基组，FBS-1和FBS-2为血清添加组，SR-1和SR-2为市售血清替代物添加组。
图4为Vi-Cell细胞活力分析仪对获得的脐带间充质干细胞的细胞活力、生长特性分析结果，其中图4A为hUC-MSCs的实时活力分析，图4B为hUC-MSC的直径分布图，结果表明hUC-MSC的活性在99％以上，细胞直径分布在9-15μm左右。
图5(5A至5I)为流式细胞仪分析细胞表面分子的结果，显示所述hUC-MSC表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC的阳性比例大于99％；表达CD45、CD34、HLA-DR的阳性比例小于1％。
图6为获得的hUC-MSC向成骨细胞和成骨细胞的定向诱导分化结果，其中图6A示出了茜素红与成骨过程的钙结节发生显色反应产生的深红色化合物，图6B示出了油红O对成脂细胞脂肪泡特异性着色。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
未注明具体条件的，按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条件进行；未注明商购来源的，为可以市售购得的常规产品。
实施例中采用的间充质干细胞培养上清浓缩液如下制备：
将从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞以2×104个细胞/cm2的密度接种于T175细胞培养瓶中，加25ml无血清培养基培养48小时(细胞达70％汇合)，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；其中无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；
在4℃下以3000g离心30min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；
将离心得到的上清液移入新的离心管中，在4℃下以10000g离心50min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；
回收上清液过0.22μm微滤膜除菌；
将滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃以3000-4500g离心80min，将滤过液浓缩至其体积的1/30；
用PBS缓冲液调节终体积为最初收集的细胞培养上清液的1/20。
实施例1培养基组成的筛选
(一)β-巯基乙醇的含量筛选
受试培养基：0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3或0.5体积份的β-巯基乙醇，10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，5体积份的培养上清浓缩液，94体积份的a-MEM。
在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSC，以2×104个细胞/cm2密度接种于T75细胞培养瓶，加12-15ml受试培养基，观察细胞生长情况。
结果：在培养基中分别含0.01和0.02体积份β-巯基乙醇的两个浓度组中，细胞贴壁速度较慢，在接种4小时后，仍有部分细胞未贴壁，约8小时后，细胞基本全部贴壁；在培养基中分别含0.05、0.1、0.15和0.2体积份β-巯基乙醇的四个浓度组中，在接种4小时后细胞已完全贴壁，细胞明亮，伸出触角；在培养基中分别含0.3和0.5体积份β-巯基乙醇的两个浓度组中，在接种4小时后，细胞也已经贴壁，但部分细胞状态变差，出现分化早期症状(见图1A)。
(二)重组人碱性成纤维生长因子的含量筛选
受试培养基：0.1体积份的β-巯基乙醇，1、2、5、8、10、12、15、18或20ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，5体积份的培养上清浓缩液，94体积份的a-MEM。
参考第(一)部分方法，以相同细胞源、相同密度接种，加12-15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
结果：在培养基中分别含1、2ng/mlbFGF的两个浓度组中，细胞增殖缓慢，细胞状态差，呈现营养不足状态(参见图1B)；在培养基中分别含5、8、10、12、15ng/mlbFGF的浓度组中，细胞正常生长，亮度高，生长好；在培养基中分别含18、20ng/mlbFGF的浓度组中，细胞增殖良好，明亮，但经过多次传代过程中，细胞易分化，细胞会成团状汇集，或触角变长(参见图1C)。
(三)培养上清浓缩液的含量筛选
受试培养基：0.1体积份的β-巯基乙醇，10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)，1、2、4、5、6、8或10体积份的培养上清浓缩液，94体积份的a-MEM。
参考第(一)部分方法，以相同细胞源、相同密度接种，加12-15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
结果：在培养基中分别含1、2体积份培养上清浓缩液的两个浓度组中，细胞增殖缓慢，在接种48小时后观察细胞，hUC-MSC部分细胞聚集达60％左右汇合后，细胞扁平，停止增殖(见图1D)；在培养基中分别含4、5、6体积份培养上清浓缩液的三个浓度组中，细胞生长状态良好，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60％，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90％以上汇合；在培养基中分别含8、10体积份培养上清浓缩液的两个浓度组中，细胞呈现局部不均匀聚集，且在培养瓶内出现漂浮物，部分细胞死亡(见图1E)。
实施例2无血清培养基的制备及应用
无血清培养基制备：
配方：0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、5体积份的所制培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
取β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、和a-MEM/DMEM-F12配制预混液，将培养上清浓缩液和重组人碱性成纤维生长因子与预混液混合。
细胞培养：在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSCs，以2×104个细胞/cm2密度接种于T175细胞培养瓶，加15mL本发明无血清培养基，移入CO2浓度为5％的37℃恒温培养箱中。接种2小时后观察细胞已贴壁，继续培养，约4小时后细胞即完全贴壁；在接种24小时后观察细胞，hUC-MSCs呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60％；接种48小时后观察细胞，hUCMSC细胞明亮，达90％以上汇合，胰酶消化收集细胞冻存。结果参见图2。
实施例3无血清培养基的制备及应用
无血清培养基制备：
配方：0.05体积份的β-巯基乙醇、2体积份的非必需氨基酸水溶液、4体积份的培养上清浓缩液、90体积份的DMEM-F12和终浓度为15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
按照实施例2方法，制备无血清培养基。
细胞培养参照实施例2方法，观察细胞在接种24h后细胞状态良好，汇合度达40％，继续培养，在48h后，细胞呈梭形旋涡状汇合，达80％，继续培养未卷起。
实施例4无血清培养基的制备及应用
无血清培养基制备：
配方：0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5体积份的非必需氨基酸水溶液、6体积份的培养上清浓缩液、95体积份的a-MEM和终浓度为5ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
按照实施例2方法，制备无血清培养基。
细胞培养参照实施例2方法，细胞在接种4h基本贴壁完成，呈明亮原点状，在接种24h后细胞状态良好，开始呈漩涡装汇合，汇合度30-50％，继续培养，在48h后，细胞明亮，触角伸展自然，细胞汇合达80％。
实施例5不同培养基对于细胞倍增的影响
受试培养基：
本发明的无血清培养基(SCL-M)：94体积份的a-MEM/DMEM-F12，0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、5体积份的培养上清浓缩液和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；
有血清培养基(FBS)：89体积份的a-MEM/DMEM-F12，0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、10体积份的FBS和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；
添加常规血清替代物的无血清培养基(SR)：89体积份的a-MEM/DMEM-F12，0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、10体积份的血清替代物(Gibco公司产品，货号10828-010)和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
取实施例2培养的第1代细胞，2×104个细胞/cm2密度接种于6孔板中，每孔分别加三种测试培养基2ml，培养48h后，胰酶消化后计6孔细胞总数，以同样的密度继续接种6孔板，重复同样操作至21代。每组培养基做2个重复。
累积倍增计算：
(1)倍增数(Populationdoubling,PD)＝[log10(NH)-log10(N0)]/log10(2)；其中NH为收获细胞数量，N0为接种细胞数量。
(2)累计倍增(cumulativepopulationdoubling，CPD)为连续传代PD之和。
结果如图3，在利用本发明无血清培养基进行hUC-MSCs持续传代培养时，在高代数(P21)细胞仍能保持良好扩增效果(SCL-M1和SCL-M2组)；在利用添加血清的培养基进行持续传代时，在第13代时，细胞增殖显著减慢(FBS-1和FBS-2组)；在利用添加血清替代物的培养基时(SR-1和SR-2组)，细胞增殖相对稳定，但是较其他组整体缓慢。
实施例5细胞活力仪分析hUCMSC的细胞活力、生长特性
取实施例2培养的第3代细胞接种到T25培养瓶中，待细胞达到95％-100％汇合后，0.125％胰酶消化，收集细胞以1×105个/孔密度接种于两个6孔板。待细胞全部贴壁后且部分生长10小时后，收集两孔细胞加500μLPBS制成细胞悬液，上机分析(细胞活力分析仪Vi-CellXR，Beckman公司)。此后每12小时取样分析，绘制生长曲线。
结果参见图4，表明hUCMSC活性在99.7％以上，细胞直径分布在在9-12μm，成梭形旋涡状生长的hUCMSC消化后具有完整圆度；并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
实施例6流式细胞仪分析hUCMSC的表面标志
取实施例2培养的第3代细胞，待细胞生长至90％汇合后，2mL0.125％胰酶消化，然后在4℃下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1×105个转移至流式管，分别加5μLCD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、IgG1-PE(同型对照)和IgG1-FITC(同型对照)抗体，混匀4℃避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500μLPBS重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XL，Beckman公司)，每个样本收集1×104个细胞。结果参见图5，并且细胞免疫表型如下：
阳性表达(大于99％)：CD29，CD44，CD73，CD105，CD90，HLA-ABC；
阴性表达(小于1％)：CD34，CD45，HLA-DR。
实施例7hUC-MSC多向分化潜能的鉴定
1)成骨诱导分化
取实施例2培养的第3代hUCMSC以3×104个细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，24小时后，每孔添加新鲜配制的人UCMSC成骨诱导分化培养基(HUXUC-90021，赛业产品)2mL，此后每3天更换新鲜的成骨分化诱导培养基，2周后多聚甲醛固定，茜素红染色3-5min。
结果参见图6A，表明以本发明培养基培养得到的hUCMSC在成骨诱导两周后，茜素红与成骨过程的钙结节发生深红色显色反应。
2)成脂诱导分化
取实施例2培养的第3代hUCMSC以2×104个细胞/cm2接种至6孔细胞培养板，待细胞达到100％汇合后，每孔添加成脂诱导分化培养基A液(HUXUC-90031，赛业产品)开始诱导，3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时，如此循环。当脂滴出现较多但较小时，用成脂诱导液B维持7天，诱导结束后4％多聚甲醛固定，油红O染色。
结果参见图6B，表明以本发明培养基培养得到的hUCMSC在成脂诱导两周后，油红O对成脂细胞着色明显。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的培养上清浓缩液。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、4-6体积份的培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；
优选地，所述无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、5体积份的培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：
收集人脐带间充质干细胞培养上清液，离心，微滤膜过滤，超滤浓缩；
优选地，所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：
(1)将人脐带间充质干细胞以0.5-4×104个细胞/cm2的密度接种于无血清培养基中培养48-72小时使得细胞达70％-90％汇合，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；
(2)在4℃下以3000-5000g离心15-40min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；
(3)将经步骤(2)得到的上清液在4℃下以10000g离心30-60min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；
(4)将经步骤(3)得到的上清液过0.22μm微滤膜除菌；
(5)将经步骤(4)得到的滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃下以3000-4500g离心60-90min，将滤过液浓缩至体积的1/20至1/50；
(6)将经步骤(5)得到的浓缩液以PBS缓冲液调节终体积为步骤(1)中收集的细胞培养上清液的1/20。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的无血清培养基，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞；
优选地，所述步骤(1)中的无血清培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和任选的人脐带间充质干细胞的培养上清浓缩液；优选包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、任选的4-6体积份的培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、任选的5体积份的培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。
5.如权利要求1至4中任一项所述无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
收集人脐带间充质干细胞培养上清液，离心，微滤膜过滤，超滤浓缩，得到培养上清浓缩液；
采用β-巯基乙醇、非必需氨基酸和a-MEM/DMEM-F12配制预混液；
将培养上清浓缩液、预混液和重组人碱性成纤维生长因子混合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：
(1)将人脐带间充质干细胞以0.5-4×104个细胞/cm2的密度接种于无血清培养基中培养48-72小时使得细胞达70％-90％汇合，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；
(2)在4℃下以3000-4500g离心15-40min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；
(3)将经步骤(2)得到的上清液在4℃下以10000g离心40-80min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；
(4)将经步骤(3)得到的上清液过0.22μm微滤膜除菌；
(5)将经步骤(4)得到的滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃下以3000-4500g离心60-90min，将滤过液浓缩至其体积的1/20至1/50；
(6)将经步骤(5)得到的浓缩液以PBS缓冲液调节终体积为步骤(1)中收集的细胞培养上清液的1/20。
7.如权利要求1至4中任一项所述的无血清培养基在制备干细胞培养介质中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述干细胞从哺乳动物、例如人的组织或器官中分离得到，所述组织或器官为骨髓、脐带和脂肪中的一种或多种；
优选地，所述干细胞为哺乳动物来源的脐带间充质干细胞，更优选为人来源的脐带间充质干细胞。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述干细胞是从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。
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