CN101531996B - 源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法，本方法依据成形组织中不同种类细胞的贴附能力差异，进行分时间段贴壁筛选，通过不同时间段贴附细胞的间充质干细胞特异表面抗原检定后，筛选最佳贴壁时间段的贴附细胞，并收集和悬浮细胞后，进行细胞集落形成的克隆培养，获得纯化的成形组织间充质干细胞。本发明的有益效果是：(1)本发明方法可达到比较好的分选效果；(2)对最佳贴壁时间段分选的细胞采用单个细胞克隆方法进一步提高了成形组织间充质干细胞的纯化效率；(3)经最佳贴壁时间段分选的成形组织间充质干细胞具有较高的增殖潜能；(4)经最佳贴壁时间段分选的成形组织间充质干细胞具有显著的多分化潜能。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法。
(二)背景技术
人体的各种组织都有可能存在着具有一定分化潜能的干细胞。相关的研究已经表明，除了骨髓和脐带血之外，在其他的成形组织中，例如脂肪、新生儿脐带以及胎盘等，也存在着可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等的干细胞，这些干细胞被统称为间充质干细胞(MSCs)。这些间充质干细胞都可能将在医学上具有细胞移植和组织工程化的重大利用价值。
由于目前还尚未发现间充质干细胞专一的特异性标记分子，因此该干细胞的分离纯化采用的还是间接的方法：即采用贴壁粘附的方法进行筛选和纯化。对于液体组织(例如骨髓和脐带血)来源的间充质干细胞，通常采用分离液体组织中的单个核细胞，并在进行贴附培养的基础上，利用间充质干细胞的贴附性，在细胞培养瓶内贴壁形成纺锤状或纤维状细胞，并经过传代贴壁来逐步纯化间充质干细胞。对于成形组织(例如脐带和胎盘等)，一种方法是将组织剪切成碎块后直接进行贴附培养，然后分离纤维状细胞；另一种方法是采用胶原酶或胰酶消化组织块后收集分散细胞，再行贴附培养方法进行间充质干细胞分离和纯化。成形组织中间充质干细胞的这两种方法简单方便，但是这两种方法分离的细胞实际上是多种细胞的混合物，其中混有大量的内皮细胞或成纤维细胞，而非单纯的间充质干细胞。这种多细胞混合物的继代培养和扩增能力较低，难以形成真正的间充质干细胞株系。目前已有研究根据间充质干细胞表现为CD31-、CD34-、CD45-、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+和CD166+的特点，采用在细胞原代贴附培养、积聚一定的细胞数量基础上，再利用特异的抗体标记免疫磁珠进行分选，能有效地提高胎盘间充质干细胞的纯化率。但是，这种分离纯化方法比较烦琐、成本比较高，并且不适用于大量成形组织间充质干细胞的分离纯化。
因此，如果能在成形组织的间充质干细胞分离纯化中采用一种既分离纯化效率高，又简便快捷、成本低廉的方法，则对今后大量分离成形组织中的间充质干细胞具有重要的实际应用价值。
(三)发明内容
为了有效提高成形组织中间充质干细胞的体外分离纯化效率，本发明依据成形组织中不同种类细胞的贴附能力差异，进行分时间段贴壁筛选，目的是提供一种便捷有效的成形组织间充质干细胞分离和纯化方法。
本发明采用的技术方案是：
一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法，所述方法包括：
(1)取成形组织碎片用胶原酶消化，获得悬浮细胞，收集所述的悬浮细胞于培养液a中进行贴壁培养4～10小时，收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(2)将步骤(1)获得的未贴附细胞转移至细胞培养液b中贴壁培养，贴壁培养时间为步骤(1)所述的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，再次收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(3)步骤(2)获得的未贴附细胞重复步骤(2)的操作1～5次，每次各自贴壁培养时间为前一次的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，获得不同时间段贴附的贴壁细胞；
(4)对不同时间段获得的贴壁细胞分别培养扩增，并分别进行间充质干细胞特异表面抗原检定，筛选获得具有间充质干细胞表面抗原特性贴壁细胞的最佳贴壁培养时间段；
(5)取在最佳贴壁培养时间段贴附的贴壁细胞，悬浮于细胞培养液c中进行克隆培养，获得纯化的成形组织间充质干细胞。
本发明关键在于依据成形组织中不同种类细胞的贴附能力差异，进行分时间段贴壁培养筛选以获得最佳贴壁时间段的贴附细胞，培养过程中的其他参数，均可采用本领域常规手段进行。
所述细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c为本领域常规用于细胞培养的培养液，分别命名为a、b、c只是为了便于区分不同操作步骤中的细胞培养液，细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c可以相同，也可以有所不同，本发明推荐所述细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c相同，均优选为添加体积含量为10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)-LG(低糖DMEM)培养液。即所述的细胞培养液每L含有：基础DMEM-LG培养基900ml、100ml胎牛血清、L-谷氨酰胺2mmol。DMEM-LG培养基含有如下成份：1.0g/L葡萄糖(低糖)，3.7g/L碳酸氢钠，0.11g/L丙酮酸钠，含酚红，不含谷氨酰胺。
所用胶原酶推荐为IV型胶原酶。
所述间充质干细胞特异表面抗原检定为对CD31、CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和CD166中的三种以上抗原的检定。需满足CD31-、CD34-、CD45-、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+和CD166+，-表示阴性，+表示阳性。
所述成形组织来自下列之一：脂肪、新生儿脐带、胎盘等。
具体的，所述方法如下：
(1)取胎盘母体侧蜕膜组织，剪碎，碎片用IV型胶原酶消化，收集细胞悬浮于细胞培养液a中进行贴壁培养8小时，收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(2)将步骤(1)获得的未贴附细胞转移至细胞培养液b中贴壁培养16小时，再次收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(3)步骤(2)获得的未贴附细胞重复步骤(2)的操作3次，各次贴壁培养时间依次为24小时、48小时、72小时，分别获得不同时间段贴附的贴壁细胞；
(4)对不同时间段获得的贴壁细胞分别培养扩增，并分别进行间充质干细胞特异表面抗原检定，筛选获得具有间充质干细胞表面抗原特性贴壁细胞的最佳贴壁培养时间段；
(5)取在最佳贴壁培养时间段贴附的贴壁细胞，悬浮于细胞培养液c中进行克隆培养，获得纯化的蜕膜组织间充质干细胞；
所述细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c均为添加有体积含量为10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM-LG培养液。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本方法采用收集成形组织细胞后，进行分散悬浮细胞的不同时间段贴壁培养，然后再行特异表面抗原测定，筛选最佳贴壁时间段的贴附细胞，可以达到比较好的分选效果。
(2)对最佳贴壁时间段分选的细胞采用单个细胞克隆方法进一步提高了成形组织间充质干细胞的纯化效率。
(3)经最佳贴壁时间段分选的成形组织间充质干细胞具有较高的增殖潜能。与未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞相比，其对数生长期可以提前2～3天，并且最快可以在5天的时间内完成细胞单层的形成；而未进行分时间段贴壁分选的细胞在培养瓶中铺层较慢，细胞生长期可达9～11天之久。
(4)经最佳贴壁时间段分选的成形组织间充质干细胞具有显著的多分化潜能。
(四)附图说明
图1(A)为实施例2经最佳贴壁时间段分选的细胞克隆；
图1(B)为实施例2克隆细胞在24孔培养板中扩增铺层后的细胞形态；
图2为实施例3经最佳贴壁时间段分选的细胞(以-◆-表示)与未进行分时间段贴壁分选的细胞(以-◇-表示)扩增能力比较；
图3(A)为实施例4经最佳贴壁时间段分选的细胞与未进行分时间段贴壁分选的细胞向脂肪细胞分化潜能的比较
图3(B)为实施例4经最佳贴壁时间段分选的细胞与未进行分时间段贴壁分选的向成骨细胞分化潜能的比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
取胎盘母体侧蜕膜组织，剪碎成小块，取碎片5g加入到10mL含0.1％(w/v，即1g/L，每1L消化液中含1g酶)IV型胶原酶(Sigma公司，125U/mg)的消化液(消化液溶剂为双蒸水)中消化30分钟后收集细胞，以细胞培养基(添加10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)和2mM L-谷氨酰胺(Sigma公司)的DMEM-LG(Hyclone公司)培养液(按900mL基础DMEM-LG培养液添加100mL胎牛血清和2mmol L-谷氨酰胺配制，下同)悬浮后，收集悬浮细胞进行不同时间段的贴壁培养。
1、收集的悬浮细胞在6孔培养板中贴壁培养8小时后，收集未贴附的悬浮细胞，保留已经贴附在培养板中的细胞继续扩增培养；收集的悬浮细胞转移至新的6孔培养板中继续贴壁培养16小时，然后再次收集未贴壁的悬浮细胞，保留已经贴附在培养板中的细胞继续扩增培养；收集的悬浮细胞再次转移至新的6孔培养板中继续贴壁培养24小时，然后再次收集未贴壁的悬浮细胞，保留已经贴附在培养板中的细胞继续扩增培养；如此循环，分别进行8、16、24、48和72小时的不同时间段贴壁培养，并扩增各时间段贴附的细胞，直至细胞在培养板中达到80～90％铺层。
2、用Tryspin-EDTA(GIBCO公司)消化并收获各时间段贴附的细胞，并以0.1％IV型胶原酶消化的胎盘母体侧蜕膜组织细胞直接在6孔培养板中连续贴壁培养72小时的贴附细胞(未进行分时间段贴壁分选的细胞)作对照。收获的细胞用磷酸缓冲液(PBS)洗涤一次后悬浮在PBS中。用流式细胞术测定各种贴附细胞扩增后的不同标记性细胞表面抗原的比例见表1。
表1：不同时间段贴附细胞中标记性细胞表面抗原的比例(％)
| 贴壁培养时间(小时) | CD31+ | CD90+ | CD105+ | CD29+ |
| 对照细胞(直接72小时) | 42.55±10.31 | 13.23±4.34 | 19.41±5.12 | 21.78±7.64 |
| 8 | 51.47±9.54 | 5.28±1.02 | 4.07±1.33 | 6.54±1.39 |
| 16 | 43.14±5.86 | 11.93±3.15 | 8.77±2.04 | 9.82±1.66 |
| 24 | 24.08±5.42 | 25.15±4.43 | 12.25±5.26 | 17.06±7.54 |
| 48 | 9.45±2.36 | 56.52±7.44 | 41.58±5.27 | 36.16±8.22 |
| 72 | 2.13±0.42 | 89.43±6.38 | 91.75±8.54 | 86.64±9.35 |
| 克隆细胞 | 0.16±0.07 | 95.35±4.82 | 97.22±3.52 | 93.43±5.22 |
对照细胞和在24小时内贴壁分选的细胞，CD31抗原阳性率较高，而CD90、CD105和CD29抗原阳性率较低，由此推测在这些细胞主要为内皮细胞及其它细胞；在48小时时间段才贴附的细胞CD31抗原阳性率显著降低，而CD90、CD105和CD29抗原阳性率显著增加，特别是在72小时时间段贴附的细胞，其CD31抗原阳性率最低，而CD90、CD105和CD29抗原阳性率最高，由此推测这个时间段贴附的大部分细胞具有间充质干细胞的表面抗原特征。
实施例2：筛选细胞的克隆：
根据实施例1的结果，筛选经最佳贴壁时间段(72小时)分选的细胞进行细胞克隆培养。用Tryspin-EDTA消化并收获72小时时间段贴附的细胞。收获的细胞用PBS洗涤一次后悬浮在细胞培养基(配制：100mL胎牛血清、2mmol L-谷氨酰胺，900mL基础DMEM-LG培养基混合)中，并进行有限稀释方法进行细胞密度梯度倍释后，于96孔培养板中进行细胞克隆培养。当细胞克隆形成后，收集单个细胞的克隆，然后转入24孔培养板中进行传代扩增培养。参见图1(A)为单个细胞形成的细胞克隆；图1(B)为克隆细胞在24孔培养板中扩增铺层后的细胞形态，呈长纤维状细胞。
收集24孔培养板中铺层的细胞，用流式细胞术测定其相应的标记性表面抗原比例如表1。结果表明，对最佳贴壁时间段贴附细胞的克隆培养进一步提高了CD90、CD105和CD29抗原阳性细胞的比例。
实施例3：扩增能力比较分析
收集经最佳贴壁时间段(72小时)贴附的细胞，并以0.1％IV型胶原酶消化的胎盘组织细胞直接在6孔培养板中连续贴壁培养72小时的贴附细胞(未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞)作对照，在24孔培养板中用细胞培养基(配制：100mL胎牛血清、2mmol L-谷氨酰胺、900mL基础DMEM-LG培养基混合)培养，并进行细胞扩增能力测定。实验结果如图2，其中-◇-表示未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞，-◆-表示经最佳贴壁时间段(72小时)贴附的细胞。
从图2的比较结果分析，在经最佳贴壁时间段(72小时)贴附的细胞具有显著的生长优势：细胞快速生长，在培养的第3天开始出现对数生长期，至第5天基本上达到铺层；未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞出现生长快速的时期比较滞后，大约在第6～7出现对数生长期，至第9～11天才达到铺层。
在1∶3的传代比例下进行传代能力分析。比较分析两种贴附细胞的传代扩增能力，发现最佳贴壁时间段(72小时)贴附细胞能传17～21代，而未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞仅传6～8代。至此之后，细胞逐渐失去扩增和分化能力。
实施例4：向脂肪细胞和成骨细胞的分化能力比较
收集经最佳贴壁时间段(72小时)贴附的细胞以及未进行分时间段贴壁分选的贴附细胞，分别制备制成单细胞悬液，以2×104个/培养皿接种于直径30mm的培养皿进行贴壁培养，待细胞达到铺层80～90％时，用脂肪细胞诱导液(DMEM-LG培养液900mL，添加100mL胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10μg/ml胰岛素、1μmol地塞米松、0.5mmol 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、100μmol吲哚美辛)进行脂肪细胞的定向诱导分化；用成骨细胞诱导液(DMEM-LG培养液900mL，添加100mL胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、0.1μmol地塞米松、10mmolβ-甘油磷酸钠、50μmol 2-磷酸-抗坏血酸)进行成骨细胞定向诱导。
在脂肪细胞定向诱导分化实验中，第7天起光镜下可见黄色的圆形脂滴沉着的细胞，外形变为圆形，椭圆形，细胞核被脂滴挤于一侧。油红O染色示胞核呈蓝色，脂滴呈红色。随着诱导时间的延长，脂肪细胞的比例逐渐增高。但是，通过脂滴OD值测定分析，两种贴附细胞定向分化脂肪细胞的潜能具有显著的差异(图3(A))，72小时时间段贴附的细胞具有比较高的脂肪细胞分化潜能。
在成骨细胞定向诱导分化实验中，一般从第5天开始，可以看到有细胞形态转变为立方形，折光性强，随着诱导时间的延长，立方形的细胞比例逐渐增高。细胞继续增殖，形成复层。改良钙钴法碱性磷酸酶染色的诱导细胞胞浆深棕色或深黑色，其中充满致密的黑色沉淀。但是，通过碱性磷酸酶pNP值测定分析，两种贴附细胞定向分化成骨细胞的潜能具有显著的差异(图3(B))，72小时时间段贴附的细胞具有比较高的成骨细胞分化潜能。
总结：
(1)本分选技术有效地富集了成形组织的间充质干细胞：
经最佳贴壁时间段(72小时)的贴附筛选后，CD90阳性细胞比例达到89.4％，CD105阳性细胞比例达到91.8％，CD29阳性细胞比例达到86.6％，并且基本上排除了CD31阳性细胞。
(2)分选的细胞具有扩增和继代培养的优势：
经本分选技术分选的细胞具有显著的扩增能力。分选细胞的对数生长期比未分选细胞要提前3～4天，由此导致分选细胞的快速形成细胞增殖，并在5天左右完成一个世代的铺层。
(4)扩增的分选细胞具有分化多潜能性：
最佳贴壁时间段贴附的细胞具备较高的分化多潜能性，能定向诱导成脂肪细胞和成骨细胞。
(3)克隆培养有效促进了胎盘间充质干细胞的纯化效率：
通过最佳贴壁时间段分选的贴附细胞，经过克隆培养，能形成高度纯化的成形组织间充质干细胞集落。
Claims (6)
1.一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法，所述方法包括：
(1)取成形组织碎片用胶原酶消化，获得悬浮细胞，收集所述的悬浮细胞于细胞培养液a中进行贴壁培养4～10小时，收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(2)将步骤(1)获得的未贴附细胞转移至细胞培养液b中贴壁培养，贴壁培养时间为步骤(1)所述的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，再次收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(3)步骤(2)获得的未贴附细胞重复步骤(2)的操作1～5次，每次各自贴壁培养时间为前一次的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，获得不同时间段贴附的贴壁细胞；
(4)对不同时间段获得的贴壁细胞分别培养扩增，并分别进行间充质干细胞特异表面抗原检定，筛选获得具有间充质干细胞表面抗原特性贴壁细胞的最佳贴壁培养时间段；
(5)取在最佳贴壁培养时间段贴附的贴壁细胞，悬浮于细胞培养液c中进行克隆培养，获得纯化的成形组织间充质干细胞；
所述细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c均为添加有体积含量为10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM-LG培养液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所用胶原酶为IV型胶原酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞特异表面抗原检定为对CD31、CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和CD166中的三种以上抗原的检定。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述成形组织来自下列之一：脂肪、新生儿脐带、胎盘。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述成形组织来自胎盘。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)取胎盘母体侧蜕膜组织，剪碎，碎片用IV型胶原酶消化，收集细胞悬浮于细胞培养液a中进行贴壁培养8小时，收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(2)将步骤(1)获得的未贴附细胞转移至细胞培养液b中贴壁培养16小时，再次收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；
(3)步骤(2)获得的未贴附细胞重复步骤(2)的操作3次，各次贴壁培养时间依次为24小时、48小时、72小时，分别获得不同时间段贴附的贴壁细胞；
(4)对不同时间段获得的贴壁细胞分别培养扩增，并分别进行间充质干细胞特异表面抗原检定，筛选获得具有间充质干细胞表面抗原特性贴壁细胞的最佳贴壁培养时间段；
(5)取在最佳贴壁培养时间段贴附的贴壁细胞，悬浮于细胞培养液c中进行克隆培养，获得纯化的蜕膜组织间充质干细胞；
所述细胞培养液a、细胞培养液b、细胞培养液c均为添加体积含量为10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM-LG培养液。
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