CN101056974B - 鉴定和分离来自非骨软骨间充质组织的多潜能细胞 - Google Patents

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Abstract

鉴定和分离来自非骨软骨间充质组织的多潜能细胞。本发明涉及从非骨软骨间充质组织中鉴定和分离多潜能细胞。具体地，本发明涉及成体多潜能细胞或细胞群或包含所述细胞的组合物，所述细胞是从非骨软骨间充质组织中分离的、其特征在于对下列标志物为阳性：CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105，并且缺乏下列标志物的表达：CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133。

Description

鉴定和分离来自非骨软骨间充质组织的多潜能细胞
发明领域
本发明涉及分离的多潜能成体细胞，这些细胞是从非骨软骨间充质组织中分离的，并且由一组细胞表面标志物的存在与否所表征。本发明还涉及鉴定和分离所述细胞群的方法及其应用，例如，在制备组织修复和再生的药物组合物中的应用。
发明背景
干细胞显示能够保持其自身并且分化成为一种或多种细胞类型的区别特征。虽然对干细胞及其应用的研究还处在早期阶段，但是骨髓中的成体干细胞已经被用于移植超过30年。尽管如此，近年来，干细胞技术已取得巨大进展，使得目前干细胞被认为是组织和和器官的有希望的来源，具有用于组织修复和再生的重要治疗潜力。
使用干细胞是一些人类疾病的替代疗法，尤其是那些丧失功能细胞的疾病，包括软骨、骨和肌肉的损伤，神经变性疾病，免疫排斥，心脏病和皮肤病症(参见美国专利第5,811,094号、第5,958,767号、第6,328,960号、第6,379,953号、第6,497,875号)。
除细胞治疗应用之外，干细胞在新药研究与开发中具有应用潜力。一方面，对干细胞增殖和分化涉及机理的研究在寻找和表征新基因的过程中具有重大价值，所述新基因涉及广泛的生物过程，包括细胞发育和分化以及瘤形成过程(Phillipsetal.，2000；Ramalho-Santosetal.，2002；Ivanovaetal.，2002)。另一方面，干细胞技术使得能够产生特化细胞以及开发人和动物疾病的细胞模型，其中可以在临床前阶段确定新活性成分的功效和毒性(美国专利第6,294,346号)。
成体体细胞干细胞是存在于分化组织中的未分化细胞，并且具有增殖和分化成为一种或多种细胞类型的能力。成体干细胞存在于不同的成体组织中，其在骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、肌肉、骨骼、牙髓、胃肠上皮、肝和皮肤中的存在被广泛报道(Jiangetal.，2002)。根据它们的性质，可以将成体干细胞用于自体移植，并且在这种情况下，它们是免疫相容的并且它们的使用不会产生任何伦理问题。
成体干细胞应当能够产生完全分化的具有成熟表型的细胞，该细胞被整合入其存在的组织中并且能够执行该给定组织的专门功能。术语“表型”指细胞的可观察的特征，例如特征形态学、与其它细胞和细胞外基质的相互作用、细胞表面蛋白(表面标志物)和特征功能。
已经描述了能够对修复不同组织有贡献的不同成体干细胞群。在这些群中，特别关注那些间充质起源的，因为它们提供再生大量临床非常相关的结缔组织的理论可行性，所述结缔组织例如骨、软骨、腱、骨骼肌、心肌、血管内皮、皮下脂肪和骨髓基质。第一个分离的此类型细胞群是被称为间充质干细胞(MSC)，发现其存在于骨髓基质中(Friedensteinetal.，1976；Caplanetal.，1991；Pittengeretal.，1999)。这些细胞已经被广泛表征，并且对这些细胞进行的研究已经显示它们能够分化成为不同的间充质细胞系，例如脂肪细胞(Beresfordetal.，1992)、软骨细胞(Johnstoneetal.，1998)、成肌细胞(Wakitanietal.，1995)和成骨细胞(Haynesworthetal.，1992)。同样地，它们还具有分化成为神经元的能力(Sanchez-Ramosetal.，2000)。
成体干细胞的理想来源是通过容易的非侵入性过程可以获得所述成体干细胞、以及能够分离足够量细胞的来源。特别地，来源应该提供可以从活个体中容易地分离而没有显著的危险或不适的干细胞，并且该来源应该能够获得高产率并具有来自其它细胞的最小污染，没有分离和培养的超额费用。
获得骨髓的过程是痛苦的并且产率很低，需要通过用于体内回输的离体(exvivo)扩增显著增加细胞的数目，以获得治疗相应量。此步骤增加费用并且使得该过程费时，同时增加污染和材料丧失的风险。由于这些原因，非常需要能够从非骨髓的间充质组织中分离多潜能成体细胞。特别地，考虑到它们的手术易接近性，能够从诸如但不限于皮肤、脂肪和肌组织等非骨软骨间充质组织分离细胞将会是方便的。
若干作者已经报道了不同的多潜能成体细胞群在衍生自胚胎中胚层的软组织中存在。例如，已有报道可以从哺乳动物的骨骼肌和其它结缔组织中获得多潜能细胞(Youngetal.1993，Rogersetal.1995)。还从人吸出的脂肪组织中获得了多潜能细胞(Zuketal.，2001)。从成体结缔组织分离的多潜能细胞的另一实例是从骨髓获得的多潜能成体祖细胞(MAPC)(Jiangetal.，2002)。原则上，所有这些分离的细胞群都可以以与骨髓MSC相似的方式用于结缔组织的修复和再生(Caplanetal.，2001)。然而，直到目前，除MAPC外，这些细胞群中没有任何一个在表型水平被充分表征。因此，尽管已经在不同结缔组织中描述了多潜能成体细胞的存在，在本领域的现状中，不可能鉴定和明确地区分从软组织获得的不同多潜能细胞类型，或者获得基本上纯的细胞群。
目前，干细胞的表型表征包括，在其它的细胞群中，诸如细胞表面受体的标志物的确定；以及确定它们在体外培养中分化的能力。每一细胞类型具有表面标志物的某种组合，就是说，其具有表征该特定细胞类型的某种表达谱，将其从其它细胞中区分出来。
表面标志物的不同组合已经被用于鉴定和分离来自小鼠骨髓的基本上纯的造血干细胞群，例如：[Linneg/Iow，Thy1.1low，c-Kithigh，Sca-1+]，[Lin-，Thy1.1low，Sca-1+，rhodamine(若丹明)123low](Morrison，S.J.etal.，1995)或[Lin-，CD34-/int，c-Kit+，Sca-1+](Osawa，M.etal.，1996)。同样地，相似的标志物组合已经被用于富集人造血干细胞群[Lin-，Thy1+，CD34+，CD38neg/low](Morrison，S.J.etal.，1995)。
目前，尚未知有多少与妥协和分化细胞相关的标志物也存在于不同的多潜能成体间充质细胞群中。例如，用于富集多潜能成体间充质细胞的常用标志物是CD44(透明质酸受体)。尽管如此，CD44也存在于妥协和分化细胞类型的不同类型中。关于哪些标志物与干细胞相关的不确定以及干细胞在成体细胞中存在的低百分比使得鉴定和纯化多潜能成体间充质细胞群变得困难，所述与干细胞相关的标志物能够使干细胞从那些显示更高程度分化的细胞中区分出来。
使用多潜能成体细胞的显著缺陷是大多数用于获得多潜能成体细胞的目前来源被其它细胞类型污染，使得多潜能成体细胞群的鉴定、分离和表征过程复杂化，所述多潜能成体细胞群可用于治疗或其它目的。因此，存在获得以基本上纯的形式分离的多潜能成体细胞群的需要。
对来自非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞群的表征使得能够设计鉴定和分离的方法，以及鉴定与自我再生相关的生长因子。此外，可能存在与分化的起始阶段相关的生长因子，对其的了解可能使得体内和用于体内回输的离体分化更有效，以及能够实行对干细胞分化的控制。
本发明提供来自非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞群，优选来自脂肪组织，所述细胞群通过存在于细胞表面的免疫表型标志物来分离和表征，显示它们的多潜能性质。
类似地，本发明提供来自非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞群的鉴定和分离方法，该方法根据特征免疫表型标志物的模式，使得能够获得基本上同质的多潜能成体细胞标志物的组合。
发明的简要描述
一方面，本发明涉及分离的多潜能成体细胞，下文称为本发明的多潜能成体细胞，其(a)是从非骨软骨间充质组织分离的；(b)表达CD9<+>、CD10<+>、CD13<+>、CD29<+>、CD44<+>、CD49a<+>、CD51<+>、CD54<+>、CD55<+>、CD58<+>、CD59<+>、CD90<+>和CD105<+>；以及(c)缺乏CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的表达。本发明的多潜能成体细胞呈现增殖和分化成为不同细胞谱系的能力。在一特定实施方案中，本发明的多潜能成体细胞能够分化成为骨表型细胞、肌表型细胞和神经元表型细胞。
另一方面，本发明涉及分离的细胞群，其包括本发明的多潜能成体细胞，或者由本发明的多潜能成体细胞组成。在一实施方案中，所述细胞群几乎是，即，基本上是，同质的。
另一方面，本发明涉及基本上同质的细胞组合物，其包括本发明的多潜能成体细胞或者本发明的多潜能成体细胞的细胞群。
另一方面，本发明涉及表达特化细胞的至少一个特征的细胞，其中该细胞衍生自本发明的分离的多潜能成体细胞。在一实施方案中，本发明涉及表达特化细胞的至少一个特征的细胞，其中所述至少一个特征是选自以下细胞的特征：上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、心肌细胞和胰腺细胞。包括表达特化细胞的至少一个特征的所述细胞的分离细胞群组成本发明的其它方面，其中所述细胞衍生自本发明的分离多潜能成体细胞。
另一方面，本发明涉及获得本发明的分离多潜能成体细胞的方法，其包括：
a)收集非骨软骨间充质组织；
b)通过酶消化获得细胞悬浮物；
c)沉淀所述细胞并且在合适的培养液中重新悬浮所述细胞；以及
d)培养所述细胞，并且除去显示未附着的细胞。
依照所述方法获得和分离的细胞含有本发明多潜能成体细胞的特征，即，它们(a)是从非骨软骨间充质组织分离的；(b)以下标志物为阳性：CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105；以及(c)缺乏以下标志物的表达：CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133。另外，所述细胞呈现增殖和分化成为不同细胞谱系的能力。
在一优选实施方案中，所述非骨软骨间充质组织是结缔组织，优选为脂肪组织。在另一优选实施方案中，本发明的多潜能成体细胞可以被遗传修饰。
另一方面，本发明涉及鉴定多潜能成体细胞群的方法，其中所述细胞群包括本发明的分离多潜能成体细胞，或者由本发明的分离多潜能成体细胞组成，所述方法包括：
(a)将所述细胞与标记的化合物一起孵育，该化合物与所述细胞群的一个或多个特征标志物特异结合；以及
(b)检测所述细胞与这些特异结合化合物的结合存在与否。
在一优选实施方案中，所述特异结合化合物是抗体。
另一方面，本发明涉及分离本发明的多潜能成体细胞群的方法，其包括：
a)收集非骨软骨间充质组织；
b)通过酶消化从所述组织获得细胞悬浮物；
c)将所述细胞悬浮物与标记的化合物一起孵育，该化合物特异结合一个或多个表征所述群的表面标志物；以及
d)选择那些具有所述标志物表达谱的细胞。
所述表面标志物的存在与否表征所述细胞，因此，是所述细胞群的特征。最终选择具有本发明多潜能成体细胞的特征标志物表达谱的细胞。
在一优选实施方案中，所述分离方法由进行阴性选择以及随后的阳性选择组成，通过阴性选择排除显示与标记化合物结合的细胞，所述标记化合物特异结合选自CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的标志物，通过阳性选择选择显示与标记化合物结合的细胞，所述标记化合物特异结合选自CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105的标志物。优选地，所述特异结合的标记化合物是抗体。
另一方面，本发明涉及本发明多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞群的治疗用途，例如，作为药物的用途。在一实施方案中，本发明涉及本发明多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞群在组织的修复和再生中的用途。
因此，另一方面，本发明涉及药物组合物，其包括本发明的多潜能成体细胞或本发明的多潜能成体细胞群以及药物可接受载体。在一优选实施方案中，所述药物组合物用于组织的修复和再生。
此外，另一方面，本发明涉及将本发明的多潜能成体细胞或本发明的多潜能成体细胞群在制造药物组合物中的用途，所述药物组合物用于组织的修复和再生。
并且，另一方面，本发明涉及治疗方法，其包括将所述药物组合物对需要所述方法的患者给药。在一实施方案中，所述治疗方法用于组织的修复和再生。
另一方面，本发明涉及体内或体外评价细胞对生物或药物试剂或者对所述试剂的组合库的反应的方法，所述方法包括：
(a)分离本发明的多潜能成体细胞的细胞群，其中所述细胞是几乎同质的；
(b)通过培养扩增所述细胞群；
(c)向所述细胞群施加生物试剂或药物试剂或者所述试剂的组合库，
并且评价所述试剂对所述培养细胞的作用。
在一实施方案中，所述本发明步骤(a)的多潜能成体细胞群是从个体或者其统计显著的群中分离的。在其它实施方案中，本发明步骤(a)的多潜能成体细胞的细胞或细胞群几乎是，即，基本上是，同质的。在另一实施方案中，在步骤(c)之前，允许所述细胞分化成为特异类型的细胞。
附图的简要说明
图1a-1d显示荧光免疫细胞术的直方图，其对应从健康供者的吸脂样品分离的细胞中所获得的表面标志物的谱。结果显示所研究标志物在细胞培养物中随时间的演化，表明在每一种情况中被分析细胞所属的特定时期。图1a显示在第0天时标志物的表达。图1b显示在培养第7天时标志物的表达。图1c显示培养4周后标志物的表达，并且图1d显示培养3个月后标志物的表达。
图2a-2d显示荧光免疫细胞术的直方图，其对应从第二健康供者的吸脂样品分离的细胞中所获得的表面标志物的谱。结果显示所研究标志物在细胞培养物中随时间的演化，表明在每一种情况中被分析细胞所属的特定时期。图2a显示在第0天时标志物的表达。图2b显示在培养第7天时标志物的表达。图2c显示培养4周后标志物的表达，并且图2d显示培养3个月后标志物的表达。
图3a-3d显示荧光免疫细胞术的直方图，其对应从第三健康供者的吸脂样品分离的细胞中所获得的表面标志物的谱。结果显示所研究标志物在细胞培养物中随时间的演化，表明在每一种情况中被分析细胞所属的特定时期。图3a显示在第0天时标志物的表达。图3b显示在培养第7天时标志物的表达。图3c显示培养4周后标志物的表达，并且图3d显示培养3个月后标志物的表达。
图4a-4d显示在骨发生培养液中孵育3周的细胞的显微图片。图4a显示来自人骨髓的间充质干细胞(阳性对照)。图4b显示在骨发生培养液中孵育第1周的本发明细胞，即来自非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞。图4c显示在骨发生培养液中孵育第2周的本发明细胞。图4d显示在骨发生培养液中孵育第3周期间的本发明的多潜能成体细胞。
发明的详细描述
出于设计用于从骨软骨非间充质组织(软组织)获得确定的多潜能成体细胞群的鉴定和分离方法的目的，分析从皮下脂肪组织获得的新分离人间充质细胞的表型，并且研究表面标志物在细胞体外扩增期间的演化，以及它们分化成为不同细胞系的能力。
首先，当细胞被新分离时以及培养物在体外培养发育期间，通过流式细胞术监测来自皮下脂肪组织的成体细胞上一系列表面标志物的表达。为此，一系列常用的标志物被用来鉴定干细胞，以及表征分化的细胞，其包括但不限于：整合素、造血标志物、生长因子受体和细胞外基质受体(实施例1)。
通过确定其免疫表型谱的方法表征来自非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞使得能够根据某组表面标志物的存在与否来定义该细胞群。这些标志物是使用特定抗体能够鉴定的表位，构成能够鉴定所述细胞群以及设计用于分离或纯化所述细胞群的方案的有价值工具。
随后，一旦被表征，对所述分离的细胞进行分化分析，其目的为显示它们的多潜能性质。为此，诱导所述分离和经表征的细胞体外分化为表达特化细胞的至少一个特征的细胞。本领域技术人员已知可以用于诱导本发明的多潜能成体细胞分化为不同的特定细胞类型的方法，实施例2、3和4详细地描述了它们中的一些，实施例2、3和4分别显示本发明的多潜能成体细胞在体外分化成为骨表型细胞、肌表型细胞和神经元表型细胞。
因此，一方面，本发明涉及分离的多潜能成体细胞，下文称为本发明的多潜能成体细胞，其(a)是从非骨软骨间充质组织中分离的；(b)表达CD9<+>、CD10<+>、CD13<+>、CD29<+>、CD44<+>、CD49a<+>、CD51<+>、CD54<+>、CD55<+>、CD58<+>、CD59<+>、CD90<+>和CD105<+>；以及(c)缺乏CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的表达。
包含本发明的多潜能成体细胞，或者由本发明的多潜能成体细胞组成的分离细胞群构成本发明的其它方面。在一特定实施方案中，所述细胞群几乎，即，基本上，是同质的。
本发明的多潜能成体细胞是从非骨软骨间充质组织分离的。术语“非骨软骨间充质组织”指除软骨和骨髓之外的间充质组织。非骨软骨间充质组织在本说明书中也被称为“软组织”。非骨软骨间充质组织的说明性的、非限制性实例包括皮肤、脂肪和肌组织。在一特定实施方案中，本发明的多潜能成体细胞是从皮下脂肪组织分离的。
可以从来自任何动物的任何非骨软骨间充质组织的合适来源获得本发明的多潜能成体细胞，所述动物包括人类。通常，从非病理的出生后哺乳动物非骨软骨间充质组织获得所述细胞。在一优选实施方案中，从诸如皮下脂肪组织的非骨软骨间充质组织的来源获得本发明的多潜能成体细胞。并且，在一特定实施方案中，从哺乳动物分离本发明的多潜能成体细胞，所述哺乳动物例如啮齿动物、灵长类等等，优选地，从人类分离本发明的多潜能成体细胞。
还通过一组标志物的存在与否表征本发明的多潜能成体细胞，即所述细胞因为它们(i)对某些标志物为阳性[CD9<+>、CD10<+>、CD13<+>、CD29<+>、CD44<+>、CD49a<+>、CD51<+>、CD54<+>、CD55<+>、CD58<+>、CD59<+>、CD90<+>和CD105<+>]，并且(ii)对某些标志物为阴性[CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133]而被表征。
根据常规方法，可以通过所述细胞的单独染色(流式细胞术)，或者通过所述群的原位组织切片，常规地通过表面标志物进行本发明多潜能成体细胞或包含所述细胞的细胞群的表型表征。在一特定实施方案中，可以通过流式细胞术监测所述表面标志物在本发明的多潜能成体细胞上的表达。
对本发明的多潜能成体细胞、或者包含或由所述细胞组成的细胞群的通过其免疫表型谱的表征可被用于根据某组表面标志物的存在与否来定义所述细胞或细胞群。这些标志物是可以用特异抗体鉴定的表位，构成能够鉴定所述细胞群以及设计其分离和纯化方案的有用工具。可以将抗所述表面标志物的单克隆抗体用于鉴定本发明的多潜能成体细胞。
使用抗体确定表面标志物的谱可以是直接的，即使用标记的抗体，或者间接的，即使用抗一级特异抗体的二级标记抗体，因此完成信号放大，其中该一级特异抗体抗所述细胞标志物。
另一方面，可以通过不同的方法确定抗体结合的存在与否，所述方法包括但不限于免疫荧光显微镜方法和放射摄影术。类似地，有可能通过流式细胞术进行对抗体结合水平的监测，流式细胞术是允许将荧光色素水平与存在于细胞表面与标记抗体特异结合的抗原的数量相关联的技术。
在鉴定和分离的分析中，所述细胞群与特异试剂接触，根据所述分析是通过直接还是间接检测方法进行，该试剂分别被标记或未被标记。术语“特异试剂”指特异结合对的一成员；特异结合对的多个成员包括但不限于抗原和抗体结合对、包含MHC抗原和T细胞受体的对、互补核苷酸序列、以及肽配体与其受体的对。所述特异结合对包括所述结合对的特异成员的类似物、片断和衍生物。
特别感兴趣的是将抗体用作具有亲和力的试剂。任何本领域普通技术人员都应清楚特异单克隆抗体的生产。在鉴定和分离细胞群的试验中，抗体被标记。为此，所使用的标志物包括但不限于：磁性颗粒、生物素和荧光色素，它们使得能够鉴定和分离抗体与之结合的细胞类型。因此，例如，通过流式细胞术对包含本发明多潜能成体细胞的细胞群的分析使得能够在同一样品中使用不同的抗体，所述抗体被在不同波长激发的荧光色素所标记。因此，有可能获知所述群对这些表面标志物的特定谱，以及进行针对使用的该组标志物的分离。
可以通过亲和分离技术分离展示期望表型的群，该技术包括磁性分离(使用被特异抗体包被地磁性颗粒)、亲和层析、与单克隆抗体结合的细胞毒性剂或与单克隆抗体一起使用并且与附着在固体支持物上的抗体一起振荡摇动的细胞毒性剂、以及其它适合的技术。通过流式细胞术可以得到更精确的分离，流式细胞术使得能够根据染色的强度和诸如细胞大小和细胞复杂度等其它参数分离细胞群。
本发明的多潜能成体细胞展示增殖和分化成为不同细胞系的能力。本发明的多潜能成体细胞可以分化成为的细胞系的说明性、非限制性实例例如包括骨表型细胞、肌表型细胞和神经元表型细胞。
通过常规方法，本发明的多潜能成体细胞可以增殖和分化成为其它谱系的细胞。可以通过本领域公知的方法进行鉴定以及随后从其未分化的相对部分中分离已分化细胞的方法。
本发明的多潜能成体细胞还能够用于体内回输的离体扩增。就是说，分离后，可以将本发明的多潜能成体细胞用于体内回输的离体保持在培养液中并允许其在培养液中分化。这样的培养液例如包含Dulbecco′sModifiedEagle′sMedium(DMEM)、抗生素和谷氨酰胺，并且通常向其中补充2-20％的胎牛血清(FBS)。本领域技术人员具有根据所使用细胞的需要修改或调节培养液和/或培养液补充物浓度的技能。血清经常含有存活和扩增所必需的细胞因子和成分。血清的实例包括FBS、牛血清(BS)、牛血清(CS)、胎牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)，山羊血清(GS)、马血清(HS)、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)等等。还可考虑，如果本发明的多潜能成体细胞是人源的，那么向细胞培养液中补充人血清，优选为自体来源的。应该理解，如果认为需要使补体级联的成分失活，可以将血清在55-65℃热灭活。还可以调节血清浓度、从培养液中撤除血清来促进一种或多种期望细胞类型的生存。优选地，约2％至约25％的FBS浓度对本发明的多潜能成体细胞有益处。在另一实施方案中，本发明的多潜能成体细胞可以在具有明确组成的培养液中扩增，在该培养液中用血清白蛋白、血清转铁蛋白、硒和重组蛋白的组合代替血清，该重组蛋白包括但不限于胰岛素、血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
许多细胞培养液已经含有氨基酸；然而，一些培养液需要在培养细胞前补充。这样的氨基酸包括但不限于L-丙胺酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等等。
细胞培养中还通常使用抗微生物剂以减轻细菌、支原体和真菌污染。通常，使用的抗细菌的或抗真菌的化合物是青霉素/链霉素的混合物，但是还可以包括但不限于两性霉素(Fungizone)、氨苄青霉素、庆大霉素、争光霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素等等。
激素也可以被有利地用于细胞培养，其包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、地塞米松、b-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、促乳素、孕酮、生长激素释放抑制因子/人生长激素(HGH)等等。
本发明的多潜能成体细胞的维持条件还含有使得细胞能够保持在未分化形式的细胞因子。在分化之前从培养液中除去抑制细胞分化的补充物对于本领域技术人员是显而易见的。事实上，根据细胞类型，这些因子可能引起不希望的作用。
可以转染或遗传工程化本发明的多潜能成体细胞以表达至少一种感兴趣的多肽。在一实施方案中，所述感兴趣的多肽是能够诱导或增加基因表达的产物，所述基因参与组织的修复或再生。
另一方面，本发明涉及获得本发明的分离的多潜能成体细胞的方法，其包括：
a)收集非骨软骨间充质组织；
b)通过酶消化获得细胞悬浮物；
c)沉淀所述细胞并且在适合的培养液中重新悬浮所述细胞，以及
d)在固体表面上培养所述细胞，并且除去显示不与所述固体表面附着的细胞。
依照所述方法获得的细胞含有本发明的多潜能成体细胞的特征。
如本文中所用，术语“固体表面”指允许本发明的多潜能成体细胞附着的任何材料。在一特定实施方案中，所述材料是经处理的以促进哺乳动物细胞向其表面的附着的塑料材料。
可以通过本领域技术人员已知的常规技术进行步骤a)-d)。简而言之，可以通过常规方法从任何非骨软骨间充质组织的适合来源获得本发明的多潜能成体细胞，所述非骨软骨间充质组织来自任何适合的动物，包括人类，例如来自人脂肪组织。所述动物可以是活的或者死亡的，只要该动物中的非骨软骨间充质组织是存活的。通常，使用公知的方案从活的供者中获得人脂肪细胞，所述公知的方案例如手术或脂肪抽吸术。实际上，由于吸脂方法更加常见，所以吸脂流出物是特别优选的来源，从其可以得到本发明的细胞。因此，在一特定实施方案中，本发明的多潜能成体细胞来自通过吸脂获得的人皮下脂肪组织。
优选地，在处理之前洗涤非骨软骨间充质组织的样品。在一方案中，使用生理相容的盐溶液(例如磷酸缓冲的盐水(PBS))洗涤非骨软骨间充质组织的样品，然后激烈搅动并且放置使其沉淀，该步骤从所述组织中除去松散物质(例如，破坏的组织、血液、红细胞等等)。因此，通常重复所述洗涤和沉淀步骤直至上清液相对不含有碎片。通常余留的细胞以不同大小的团存在，使用设定为降解大结构(gauged)的步骤继续进行所述方案同时最小化对细胞本身的破坏。达到此结果的一种方法是使用酶处理经洗涤的细胞团，该酶削弱或破坏细胞之间的连接(例如胶原酶、分散酶(dispase)、胰蛋白酶等等)。这些酶处理的量和持续时间根据使用的条件而不同，但是这些酶的使用是本领域公知的。作为这些酶处理的另一选择或者与这些酶处理联合，可以使用其它处理降解所述细胞团，所述其它处理例如机械搅动、声能量、热能量等等。如果通过酶方法完成降解，则需要在合适的时间后中和该酶的作用以便将对所述细胞的有害影响降到最低。
降解步骤通常产生聚集细胞和流体部分的浆或悬浮物，所述流体部分通常含有游离的基质细胞(例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞)。分离过程的下一阶段是从本发明的细胞中分离所述聚集细胞。可以通过离心完成此目的，离心迫使细胞成为被上清液覆盖的沉淀。然后弃去上清液并且在生理相容液体中悬浮所述沉淀。此外，悬浮的细胞通常包括红细胞，并且在大多数方案中需要裂解它们。选择性裂解红细胞的方法为本领域已知，并且可以使用任何适合的方案(例如在高渗或低渗培养液中孵育、通过使用氯化铵裂解等等)。当然，如果红细胞被裂解，那么应当将剩余细胞从裂解物中分离，例如通过过滤、沉淀或密度分离法。
无论红细胞是否被裂解，都可以将悬浮的细胞洗涤、再次离心并且重新悬浮一次或连续多次以达到更高的纯度。或者，可以根据细胞表面标志物谱或者根据细胞大小和粒度来分离所述细胞。
在最后的分离和重新悬浮之后，可以培养所述细胞，并且如果需要，分析数量和存活率以便评价产率。期望地，使用合适的细胞培养液、以合适的细胞密度和培养条件、在固体表面上培养所述细胞且使其不分化。因此，在一特定实施方案中，在合适的细胞培养液(例如，DMEM，通常补充有5-15％(例如10％)的合适血清，例如胎牛血清或人血清)存在下，并且在允许细胞附着到固体表面上且增殖的条件下孵育，使所述细胞不分化地被培养在固体表面上，所述表面由塑料材料制成，例如Petri培养皿或细胞培养锥形瓶。孵育后，洗涤细胞以除去未附着细胞和细胞片断。在相同培养液和相同条件下保持培养细胞直至它们形成足够的融合，通常，约为80％细胞融合，当需要时更换细胞培养液。在达到期望的细胞融合之后，可以通过连续传代的方法扩增所述细胞，所述连续传代使用诸如胰蛋白酶等脱附着剂并且以合适的细胞密度(通常2,000-10,000细胞/cm2)接种至更大的细胞培养表面上。所述细胞可以被传代一些次而不失去它们的发育表型。通常，将所述细胞以期望的密度铺板，该期望密度例如从约100细胞/cm2至约100,000细胞/cm2(例如约500细胞/cm2至约50,000细胞/cm2，或者，更具体地，从约1,000细胞/cm2至约20,000细胞/cm2)。如果以较低密度铺板(例如约300细胞/cm2)，可以更容易地将所述细胞克隆分离。例如，一些天之后，以所述密度铺板的细胞会增殖为同质群。在一特定实施方案中，细胞密度为2,000-10,000细胞/cm2。
选择保持附着在固体表面上的细胞并且通过常规方法分析其表型以证实本发明的多潜能成体细胞的身份，该身份将在下文描述。保持最终附着于固体表面上的细胞组成本发明的多潜能成体细胞的同质细胞群。实施例1详细描述了从人皮下脂肪组织分离本发明的多潜能成体细胞。
通常，保持附着在固体表面上的细胞显示期望的表型，尽管需要证实才能根据本发明使用该细胞。因此，细胞对固体表面的附着构成选择本发明的多潜能成体细胞的一个标准。可以使用常规方法证实感兴趣的表型。
可以通过任何合适的常规技术鉴定细胞表面标志物，通常基于阳性/阴性选择；例如，可以使用抗细胞表面标志物的单克隆抗体，其在细胞中的存在/缺乏需要证实；尽管也可以使用其它技术。因此，在一特定实施方案中，使用抗CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105的单克隆抗体证实所述标志物在所选细胞中的缺乏；以及抗CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的单克隆抗体证实所述标志物在所选细胞中的缺乏。所述单克隆抗体是已知的并且本领域技术人员可以通过常规方法获得。
可以通过如前面公开的常规方法分析所选细胞分化成为不同细胞系的能力。
如果需要，可以使用克隆细胞群的合适方法将本发明提供的本发明多潜能成体细胞和细胞群克隆扩增。例如，可以物理地挑出细胞的增殖群并且接种到另一板中(或多孔板的孔中)。或者，可以将所述细胞以辅助向每一孔中放置单个细胞的统计比例(例如从约0.1个至约1个细胞/孔，或者甚至约0.25个至约0.5个细胞/孔，例如0.5个细胞/孔)亚克隆到多孔板上。当然，可以通过以低密度铺板克隆所述细胞(例如在Petri培养皿或其它适合的底物中)，并且使用诸如克隆环等装置将它们从其它细胞中分离。可以在任何适合的培养液中扩增克隆群产物。在任何情况下，可以将所分离的细胞培养至可以评价其发育表型的合适点。
发明人进行的其它分析显示通过使用合适血清(例如胎牛血清或人血清)的特殊筛选的份额，可以延长本发明细胞的用于体内回输的离体扩增而不诱导分化的时间。本领域已知测量存活率和产率的方法(例如台盼蓝排除法)。
如果需要，可以手动进行分离本发明细胞群细胞的任何步骤和过程。或者，可以通过合适装置辅助分离所述细胞的过程，本领域已知许多这样的装置。
另一方面，本发明涉及鉴定多潜能成体细胞群的方法，其中所述群包含本发明的多潜能成体细胞或由本发明的多潜能成体细胞组成，所述方法包括：
(a)将所述细胞与标记的与所述细胞群的一个或多个特征标志物特异结合的化合物一起孵育；以及
(b)检测是否存在所述细胞与这些特异结合化合物的结合。
可以按照与本发明细胞的免疫表型表征相关的前面的描述进行此方法。在一优选实施方案中，所述特异结合化合物是抗体。
另一方面，本发明涉及分离本发明多潜能成体细胞群的方法，其包括：
a)收集非骨软骨间充质组织；
b)通过酶消化从所述组织中获得细胞悬浮物；
c)将所述细胞悬浮物与标记的化合物一起孵育，该标记的化合物特异结合表征所述细胞群的一个或多个表面标志物，以及
d)选择具有所述标志物表达谱的那些细胞。
所述表面标志物的存在与否表征所述细胞，因此，是所述细胞群的特征。最终选择具有本发明多潜能成体细胞的特征标志物表达谱的细胞。
在一优选实施方案中，所述分离方法由进行阴性选择以及随后的阳性选择组成，通过阴性选择排除显示与标记化合物结合的细胞，该标记化合物特异结合选自CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的标志物，通过阳性选择选择与标记化合物结合的细胞，该标记化合物特异结合选自CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105的标志物。优选地，所述特异结合的标记化合物是抗体。
可以按照如前所述的获得本发明多潜能成体细胞的方法进行本方法。
在细胞组合物中可以发现本发明的多潜能成体细胞，或本发明多潜能成体细胞的细胞群。因此，另一方面，本发明涉及基本上同质的细胞组合物，其包含本发明的多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞的细胞群。
可以将本发明的多潜能成体细胞用于修复和再生组织。因此，另一方面，本发明涉及将本发明的多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞群用于治疗用途，例如，用作药物。在一实施方案中，本发明涉及将本发明的多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞群用于组织的修复和再生。
另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞的群以及药物可接受载体。在一优选实施方案中，所述药物组合物用于组织的修复和再生。
本发明的多潜能成体细胞的两种或更多种类型的组合被包括在本发明提供的药物组合物的范围内。
本发明的药物组合物包含预防或治疗有效剂量的本发明多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞的细胞群，以及药物可接受载体。在一特定实施方案中，术语“药物可接受”指联邦或州政府的管理机构批准，或者列在美国药典、欧洲药典或者用于动物尤其人类的其它公认药典中。术语“载体”指与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。如果需要，所述组合物还可以含有少量的pH缓冲剂。E.W.Martin的“Remington′sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)”中描述了适合药物载体的例子。这些组合物含有预防或治疗有效剂量的纯化形式的本发明多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞的细胞群以及适合量的载体，以便于提供对个体适当给药的形式。制剂应当适合给药的方式。在一优选实施方案中，所述药物组合物是无菌的并且是对个体给药的适当形式，所述个体优选为动物个体，更优选为哺乳动物个体，并且最优选为人类个体。
本发明的药物组合物可以以多种形式存在。这些形式例如包括固体、半固体和液体剂型，例如冻干制剂、液体溶液或悬浮液，可注射和适合输注的溶液等等。优选形式依赖于给药和治疗应用的意图方式。
可以通过常规方法将本发明的多潜能成体细胞或细胞群或包含其的药物组合物对需要其的个体给药。在一特定实施方案中，通过涉及将所述细胞转移至期望组织的方法对个体给予所述细胞或细胞群，所述方法为体外或者体内直接向动物组织转移。可以通过任何适当方法将所述细胞转移至期望组织，所述适当方法通常根据组织类型而变化。例如，可以将细胞接种至组织中的期望位点以建立群等等。可以使用设备将细胞转移至体内位点，所述设备例如导管、套针、套管、支架(可以与所述细胞一起接种)等等。
可以将本发明的药物组合物用于联合治疗中。在一特定实施方案中，对需要治疗的个体给予所述联合治疗，例如是需要组织修复和再生的患者。在一实施方案中，将所述联合治疗与组织修复或再生的其它类型治疗一起使用。依照上述实施方案，可以在给予本发明的多潜能成体细胞之前、同时或之后使用本发明的联合治疗。
并且，另一方面，本发明涉及本发明多潜能成体细胞或本发明多潜能成体细胞的细胞群在制备用于组织修复和再生的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明还涉及治疗方法，其包括将所述药物组合物给予需要其的患者。在一实施方案中，所述治疗方法用于组织修复或再生。
另一方面，本发明涉及体外或体内评价细胞对生物或药物试剂或者所述试剂的组合文库的反应的方法，其包括：
(a)分离本发明多潜能成体细胞的细胞群，其中所述细胞几乎是同质的；
(b)通过培养扩增所述细胞群；
(c)对所述细胞群施加生物试剂或药物试剂或者所述试剂的组合文库，并且评价所述试剂对所述培养细胞的作用。
在一实施方案中，从个体或从其统计显著的群中分离步骤(a)的本发明多潜能成体细胞的群。在另一实施方案中，步骤(a)的本发明多潜能成体细胞的细胞群的细胞几乎，即，基本上，是同质的。在另一实施方案中，在步骤(c)之前，允许所述细胞分化成为特异细胞类型。
此外，另一方面，本发明涉及表达特化细胞的至少一个特征的细胞，其中所述细胞衍生自本发明的多潜能成体细胞。这些细胞也是多潜能成体细胞，其分化阶段比本发明的多潜能成体细胞的分化阶段更成熟。在一实施方案中，本发明涉及表达特化细胞的至少一个特征的细胞，其中所述至少一个特征是选自以下的细胞的特征：上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、心肌细胞和胰腺细胞。包含所述细胞的分离细胞群构成了本发明的另一方面，所述细胞表达特化细胞的至少一个特征，其中所述细胞衍生自本发明的分离多潜能成体细胞。
用以下实施例说明本发明，但它们不以任何方式限制本发明。
实施例1
从软组织分离多潜能成体细胞以及表面标志物的表征
通过选择具有增殖和分化能力的细胞从软组织中分离多潜能成体细胞，其特征为它们显示对细胞培养的塑料容器的附着。然后，通过使用流式细胞术监测一系列表面标志物在新分离的细胞上的表达以及在体外培养物发育期间的表达来表征所述细胞。
从皮下脂肪组织进行所述多潜能成体细胞的分离，通过吸脂术从3个健康供者(供者1、2和3)获得所述皮下脂肪组织。首先，用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤来自皮下脂肪组织的样品。为了完成对细胞外基质的破坏和所述细胞的分离，使用盐溶液中的II型胶原酶(5mg/ml)在37℃进行30分钟酶消化。通过加入含有10％胎牛血清的等体积的DMEM使胶原酶失活。在250g离心分离此细胞悬浮物10分钟以获得细胞沉淀物。
以终浓度0.16M加入NH4Cl，并且在室温下孵育该混合物10分钟以诱导存在的红细胞的裂解。在250-400g离心分离所述悬浮物并且在含有1％氨苄青霉素-链霉素的DMEM-10％FBS中重新悬浮。最后，铺板所述细胞，每cm2接种2×104-3×104个细胞。
在含有5％CO2的气氛中，将所述细胞在37℃培养20-24小时。24小时后，用PBS洗涤所述培养物以除去悬浮物中的细胞和组织残留物。将通过对塑料容器的附着所选出的细胞培养在DMEM+10％胎牛血清(FBS)中。
分离后，用一系列表面标志物的存在/不存在来表征来自供者之一的分离的多潜能成体细胞。为了进行此表征，通过流式细胞术监测以下表面标志物的表达：
-整合素：CD11b、CD18、CD29、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD61、CD104。
-造血标志物：CD3、CD9、CD10、CD13、CD14、CD16、CD19、CD28、CD34、CD38、CD45、CD90、CD133和血型糖蛋白。
-生长因子受体：CD105、NGFR。
-细胞外基质受体：CD15、CD31、CD44、CD50、CD54、CD62E、CD62L、CD62P、CD102、CD106、CD166。
-其它：CD36、CD55、CD56、CD58、CD59、CD95、HLA-I、HLA-II、β2-微球蛋白。
对新分离的细胞以及第7天的、培养4周后和3个月后的来自所述3个健康人供者的样品进行免疫表型表征。考虑到选择是以细胞培养物对塑料容器的附着来进行的，来自培养物中特定细胞部分的细胞被认为是“新分离的细胞”，所述特定细胞部分是分离后24小时内附着的细胞部分。
通过胰蛋白酶的温和消化收集将要被表征的细胞，用PBS洗涤并且在4℃下与荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的抗体一起孵育30分钟，所述抗体抗每一个待分析的细胞表面标志物。洗涤所述细胞标志物并且使用Epics-XL细胞仪(Coulter)立即进行分析。作为对照，使用经非特异的、经FITC或PE标记的、相应同种型抗体染色的细胞。
图1a-1d、2a-2d和3a-3d显示按供者分组的直方图，表明在每种情况下所分析细胞属于培养期间的哪一时间，该分组是为了更清楚地表示所研究标志物在培养期间的演变。
在不同时间分析表面标志物不仅确定了其存在与否，还确定了它们在培养过程中的行为。得到的结果显示从不同健康供者分离的细胞群在它们的表型表征中显示同型的行为。
对于表面标志物的表达谱的分析(图1a-1d、2a-2d和3a-3d)，使用3个标准确定哪些标志物定义了所述细胞群并且相对细胞群的其它类型，该细胞群能够被鉴定并分化。这些标准是：
1.弃去那些在培养期间在样品之间变化或随时间变化的标志物。
2.证实那些阳性标志物在时间0时(新分离的细胞)也是阳性的。
3.根据它们的生物相关性进行选择，弃去表征特定细胞类型的标志
物(例如，CD3是淋巴细胞专有的标志物)。
应用这些标准，本发明提供的从非骨软骨间充质组织中分离的多潜能成体细胞被表征为CD9<+>、CD10<+>、CD13<+>、CD29<+>、CD44<+>、CD49A<+>、CD51<+>、CD54<+>、CD55<+>、CD58<+>、CD59<+>、CD90<+>和CD105<+>阳性，并且缺乏CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的表达。
实施例2
来自人非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞体外分化为骨表型细胞
在分化分析中，使用本发明的被表征的人多潜能成体细胞。从被分析的脂吸出物的3个样品中分离细胞，每一脂吸出物对应一个健康供者(实施例1)。如实施例1所述分离和表征多潜能成体细胞。人骨髓的间充质干细胞(MSC)的样品被用作阳性对照。
以10,000细胞/cm2的密度将所分离的细胞接种到6孔板上(每个样品一个板)，并且在标准培养液(DMEM，10％FBS，2mML-谷氨酰胺和抗生素)中孵育。培养2天后，用新鲜培养液替换一个孔(对照)中的培养液，并且用骨发生诱导培养液替换其它孔中的培养液，所述骨发生诱导培养液含有标准培养液并加入下列成分：
-地塞米松100M
-抗坏血酸50μM
-p-甘油磷酸10mM
在正常条件下培养细胞3周，每2-3天更换培养液。三周后，可以观察到存在磷酸钙的矿化沉积，其表明骨结节的存在。通过茜素红染色(Standfordetal.，1995)检测这些结节。具体地，除去培养液，用PBS洗涤细胞两次并且用70％冷乙醇在室温下固定30分钟。然后用PBS洗涤固定的孔并且用茜素红(40mM，pH4.1)在室温下染色10分钟。用足量的水洗涤染色的细胞，并且在显微镜下检查磷酸钙沉淀，该磷酸钙沉淀被强烈地染成红色。
图4a-4d显示用茜素红染色的骨诱导细胞的显微照片。尽管磷酸钙的形成在作为阳性对照的对应来自骨髓的MSC的样品中更快(图4a)，在来自脂肪组织的3个样品中，可以看到大量骨基质的形成，尽管在每一样品中具有不同的密度。所有在其中诱导了骨发生的孔均显示相同的行为，并且在对照孔中(未接触骨发生刺激因素)未检测到骨基质的形成。没有观察到形成的骨基质的量和每一样品从组织中分离后培养时间(3至9周之间)之间的关系。
实施例3
来自人非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞体外分化为肌表型细胞
在分化分析中，使用本发明的被表征的人多潜能成体细胞。从被分析的脂吸出物的3个样品中分离细胞，每一脂吸出物对应一个健康供者(实施例1)。如实施例1所述分离和表征多潜能成体细胞。人骨髓的MSC的样品被用作阳性对照。
以10,000细胞/cm2的密度将所分离的细胞接种到标准培养液(DMEM，10％FBS，2mML-谷氨酰胺和抗生素)中。培养2天后，用新鲜培养液替换一个孔(对照)中的培养液，并且用肌发生诱导培养液替换其它孔中的培养液(Wakitanietal.，1995)，所述肌发生诱导培养液含有标准培养液并加入下列成分：
-抗坏血酸-2-磷酸0.1mM
-地塞米松0.01μM
-ITS+1(Sigma-Aldrich)
-5-氮杂胞苷3μM
24小时后，用标准培养液替换该培养液，并且培养细胞2-3周，每2-3天更换培养液。此时间之后，细胞获得伸长的表型，形成纤维状结构并且可以观察到一些细胞融合。为了检测成肌细胞表型，将获得的细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定30分钟，并且与抗肌球蛋白重链的抗体一起孵育，其中肌球蛋白重链是肌的特异性抗原。结果证明本发明的人多潜能成体细胞分化为肌表型细胞。
实施例4
来自人非骨软骨间充质组织的多潜能成体细胞体外分化
为神经元表型细胞
在分化分析中，使用本发明的被表征的人多潜能成体细胞。从被分析的脂吸出物的3个样品中分离细胞，每一脂吸出物对应一个健康供者(实施例1)。如实施例1所述分离和表征多潜能成体细胞。人骨髓的MSC的样品被用作阳性对照。
以低密度，3×103细胞/cm2，将所分离的细胞接种到补充有10ng/mlbFGF的标准培养液(DMEM，10％FBS，2mML-谷氨酰胺和抗生素)中，并且孵育24-36小时以产生大量的细胞。然后洗涤孔并且加入神经元诱导培养液(BlackandWoodbury，2001)，其包含：
-αMEM
-BHA200μM
-青霉素/链霉素
-L-谷氨酰胺2mM
-Forskolin10μM
-2％DMSO
-氢化可的松1μM
-胰岛素5μg/ml
-CIK25mM
-丙戊酸2mM
诱导少许小时后，能够观察到形态变化；细胞获得圆形形状并且非常有折射力，具有与神经细胞的轴突和树突相似外观的延长部分。3天后，将得到的细胞用4％PFA固定，并且与抗神经元特异抗原NF-200和TuJ1的抗体一起孵育。结果证明本发明的人多潜能成体细胞分化为肌表型细胞
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Claims (20)

1.分离的多潜能成体细胞，其(a)是从非骨软骨间充质组织中分离的，(b)表达CD9<+>、CD10<+>、CD13<+>、CD29<+>、CD44<+>、CD49A<+>、CD51<+>、CD54<+>、CD55<+>、CD58<+>、CD59<+>、CD90<+>和CD105<+>；并且(c)缺乏CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的表达。
2.如权利要求1所述的分离的多潜能成体细胞，其是通过包括以下的方法分离的：
(a)通过酶消化非骨软骨间充质组织获得细胞悬浮物；
(b)沉淀和在培养液中重新悬浮所述细胞；以及
(c)在固体表面上培养所述细胞，并且除去未附着在所述固体表面上的细胞。
3.如权利要求1或2所述的分离的多潜能成体细胞，其中所述非骨软骨间充质组织是结缔组织。
4.如权利要求3所述的分离的多潜能成体细胞，其中所述结缔组织是脂肪组织。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的多潜能成体细胞，其中所述细胞是遗传修饰的细胞。
6.表达特化细胞的至少一个特征的细胞，其中所述细胞衍生自权利要求1至5中任一权利要求所述的分离的多潜能成体细胞。
7.如权利要求6所述的细胞，其中所述至少一个特征是选自以下细胞的特征：上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、心肌细胞和胰腺细胞。
8.分离的细胞群，其包含权利要求1至7中任一权利要求所述的细胞。
9.如权利要求8所述的分离的细胞群，其中所述细胞群几乎是同质的。
10.鉴定多潜能成体细胞群的方法，其中所述群包含权利要求1所述的分离的细胞，所述方法包括：(a)将所述细胞与标记的特异结合化合物一起孵育，所述特异结合化合物针对所述群的一个或多个特征标志物；以及(b)检测所述细胞与这些特异结合化合物的结合的存在与否。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述特异结合化合物是抗体。
12.分离权利要求1所述的多潜能成体细胞的群的方法，其包括：
(a)通过酶消化从非骨软骨间充质组织组织中获得细胞悬浮物；
(b)将所述细胞悬浮物与标记的化合物一起孵育，所述化合物特异结合所述多潜能成体细胞的一个或多个表面标志物；以及
(c)选择具有期望的标志物表达谱的细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中进行阴性选择，通过所述阴性选择排除显示与标记的化合物结合的细胞，所述化合物特异结合选自CD11b、CD14、CD15、CD16、CD31、CD34、CD45、CD49f、CD102、CD104、CD106和CD133的标志物。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中进行阳性选择，通过所述阳性选择选择与标记的化合物结合的细胞，所述化合物特异结合选自CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49a、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105的标志物。
15.如权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中所述特异结合的标记的化合物是抗体。
16.基本上同质的细胞组合物，其包含权利要求1至5中任一权利要求所述的多潜能成体细胞或者权利要求8或9所述的细胞群。
17.药物组合物，其包含权利要求1至5中任一权利要求所述的多潜能成体细胞、或权利要求8或9所述的或根据权利要求12至15中任一权利要求所述的方法获得的细胞群，以及药物可接受载体。
18.权利要求1至5中任一权利要求所述的分离多潜能成体细胞、或权利要求8或9所述的或根据权利要求12至15中任一权利要求所述的方法获得的细胞群在制备治疗用药物中的用途。
19.权利要求1至5中任一权利要求所述的分离多潜能成体细胞、权利要求8或9所述的或根据权利要求12至15中任一权利要求所述的方法获得的细胞群在制备用于组织修复和再生的药物组合物中的用途。
20.权利要求17所述的药物组合物在制备用于组织修复和再生的药物中的用途。
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