CN101198691A

CN101198691A - 多种系干细胞的分离

Info

Publication number: CN101198691A
Application number: CN200680021325.1A
Authority: CN
Inventors: 宋淳旭
Original assignee: Individual
Current assignee: Scm Life Science Co Ltd
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2026-06-19
Also published as: US20060286669A1; EP1917348A2; US7781211B2; EP1917348B1; JP5155855B2; EP1917348A4; JP2009512419A; CN101198691B; WO2006138720A3; US20110014704A1; WO2006138720A2

Abstract

本申请公开了一种处理细胞的生物学样品的方法，其中所述细胞包括多种系干细胞、祖细胞、其他髓间质细胞，该方法包括：使细胞样品沉积在容器中；将上清液从该容器转移到另一个容器；以及从该上清液分离细胞，其在所述样品中具有相对较低的密度。

Description

多种系干细胞的分离

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2005年6月17日提交的美国临时申请第60/595,254号的优先权，其全部内容结合于此作为参考。

技术领域

本发明涉及细胞分离领域。本发明还涉及分离各种类型的干细胞或祖细胞的方法。

背景技术

已知骨髓含有造血干细胞和间充质干细胞以及祖细胞。造血干细胞(HSC)可产生各种类型的血液细胞[1]，而髓间质细胞(MSC)或间充质干细胞能够分化成若干不同组织，包括软骨、骨和脂肪[2，3，4]。MSC首先由Friedenstein和他的同事[5]基于它们对细胞培养皿的粘附性发现的。未分化的MSC在形态上是成纤维细胞状，自我更新，并且能够分化成主要为中胚层起源的结缔组织，即软骨、骨、和脂肪。还没有确定的特异且唯一识别MSC的细胞表面蛋白。MSC相关的特性的多样性可通过组织起源、分离方法和实验室之间的培养条件的差异进行解释[2，6，7，8]。尽管缺乏一致性，但是体内扩展的MSC表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD106和CD166[9]，但缺少造血表面标记物如CD11b、CD14、CD31、CD34或CD45或者对于这些标记物是微弱阳性的。

具有类似于来自不同源(主要包括骨髓、脐带血和脂肪组织)MSC的特性的细胞种群是已知的。尽管由于缺少特性标记物而很难鉴别这些细胞是否属于不同细胞类型，但是它们具有一些不同水平的表面标记物表达和各种分化能力，这可能是由于它们的不同分离和培养方法。MSC的分化的可能范围是不仅扩展至中胚层种系而且扩展至内胚层和/或外胚层种系。因此，术语“多种系干细胞或祖细胞(MLS/PC)”是指这些类型的干细胞或祖细胞，其能够分化为中胚层、外胚层和/或内胚层种系。

来源于成熟骨髓的MSC提供了打开一个新的医学策略的可能性，这是因为它易于分离和培养、它们的表现型在体外的稳定性以及低的或没有同种(异体)排斥。实际上，已经积累了MSC在人类和动物种的低免疫原性的实验证据[10]。目前，已经在实施成熟自体同源或同种异体MSC的临床应用，用于治疗各种疾病，并且已经产生非常理想的结果[11]

迄今，对于在培养基中分离和扩展MSC已经开发了若干方法。这些方法是基于利用密度梯度离心[12]、FACs筛选[13，14]、特异细胞表面抗体[12，15，17，18]、对昆布氨酸涂覆板的选择性粘附[19]、Hoechest染料排除和尺寸筛选培养[24]的。依据临床应用，这些方法潜在的缺点是培养细胞的异质性(不均匀性)、污染的高危险性、和/或生产的高成本。因此，对于临床环境中应用，需要一种新的方法，在较低污染可能性和成本条件下分离高度同源(均匀)细胞种群。

本申请公开了一种新的分离方法，开发用于生产临床应用中具有较低污染可能性和成本的高度同源MLSC种群。该方法不必需利用密度梯度离心、抗体选取、或FACS筛选，而是优选主要使用未涂覆的、骨胶原或多熔素涂覆的培养皿和细分级细胞培养基中的自然重力，以根据它们的细胞密度来分离粘附性骨髓细胞。分离了来源于单细胞源集落的MLSC系的若干不同的高度同质(均匀)种群并利用该方法从人类骨髓进行扩展。这些干细胞系是自我可更新的并且能够分化成若干不同种系，如成软骨种系、成骨(骨原)种系、成脂肪种系、神经原性(neurogenic)种系和肝原性(hepatogenic)种系。

发明内容

本发明提供成熟干细胞或祖细胞，其可用来治疗疾病如移植物抗宿主病(graft versus host disease)、骨关节炎、风湿性关节炎、成骨不全和其他疾病，以及修复组织如皮肤、软骨、骨、肌肉和神经。

本发明涉及一种处理细胞的生物学样品的方法，包括：(i)使细胞样品沉积在一个容器中；(ii)将上清液从该容器转移到另一个容器；以及(iii)从该上清液分离细胞，其在所述样品中具有相对较低的密度。

细胞的样品可以与生长介质混合。此外，在上述方法中，步骤(i)和(ii)实施至少三次，并且从来自上清液的分离细胞可以在容器中扩展。容器可以具有平底，并且可以涂覆有细胞粘附剂。细胞粘附剂可以是带正电荷或负电荷的分子。优选地，该细胞粘附剂可以是骨胶原、多熔素(聚赖氨酸，polylysine)、或其他带电荷的氨基酸，如聚精氨酸(polyarginine)、聚天冬氨酸酯(盐)(polyaspartate)、聚谷氨酸酯(盐)(polyglutamate)或者它们的组合。细胞的样品可以从骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织样品、或细胞因子活化的外周血获得，并且可以分离出多种系干细胞或祖细胞的单个集落。

在一个方面，本发明涉及分离多细胞种系干细胞。该细胞可以是祖细胞。

在一个实施方式中，所述分离方法可以不包括细胞样品的离心步骤。在另一个实施方式中，细胞的生物学样品可以在进行任何离心之前获得。而在另一个实施方式中，细胞的生物学样品可以在进行离心之后获得，优选通过通常用于MSC分离的传统密度梯度离心方法分离或分级的单核细胞。

在另一方面，本发明涉及一种制备内胚层、中胚层或外胚层细胞种系的方法，其中通过使适当诱导或转化/分化介质与利用如本文描述的制备方法获得的分离多种系干细胞进行接触。

根据本发明的以下描述、所附的参考附图以及权利要求书，本发明这些和其他目的将更充分地被理解。

附图说明

根据下文给出的详细描述和附图将更充分地理解本发明，附图仅以举例说明的方式给出，因此不是对本发明的限制，并且其中：

图1示出了利用细分级培养方法(亚组分培养方法，subfractionculturing method)用于从人类骨髓分离多种系干细胞的总体流程图。简言之，将1ml的人类骨髓与15ml的DMEM-HG、DMEM-LG、或a-MEM(20％FBS)混合并铺在10cm²细胞培养皿上。在2小时孵育之后，仅将上清液转移到新的培养皿。再重复一次。然后将上清液转移到未涂覆的、骨胶原或多熔素涂覆的培养皿。从这个阶段开始，将细胞孵育1天两次和2天一次。孵育最终的上清液直至出现单个细胞集落。当单个细胞集落大到足以转移到6孔板时，将细胞扩展至更大板以用于进一步研究。

图2A-2D示出了从骨髓分离的多种系干细胞的形态特性。(A&B)在骨髓细胞最后细分级之后三天的MLSC。细胞具有成纤维细胞状的形态。放大：(A)40X和(B)200X。(C)在第7天具有稠密和均匀形态的达到铺满的细胞。在分离的MLSC的六次传代之后，相比于处于较早传代的MLSC，小部分(少于2～3％)的MLSC的形态变成更宽和更大的形状。分离和扩展MLSC的形态是纺锤形状，类似于已知的髓间质干细胞。

图3A-3D示出了四种已建立的来自骨髓的多种系干细胞系的形态。称为A.D4(#1)、B.D4(#3)、C.D5(#1)和D.D5(#2)的四种已建立的多种系干细胞系(生长至约70～80％汇合)的照片。已建立的多种系干细胞系的形态是纺锤形并且这些干细胞生长如其他成纤维细胞一样快。

图4示出了通过细分级培养方法来自骨髓的分离MLSC的细胞表面蛋白。流式细胞仪分析表明，MLSC对于典型MSC整联蛋白(CD29)和基质受体(CD44和CD105)一贯是阳性。HMSC8292(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD，USA)细胞用作对照。已知典型MSC表达的细胞表面蛋白也在MLSC中被表达，表明MLSC可能具有MSC特性。

图5示出了在通过细分级培养方法从骨髓分离的MLSC上没有观察到造血干细胞表面蛋白。流式细胞仪分析表明，MLSC对于用于早期造血干细胞的HLA-DR和CD34标记蛋白是阴性的。HMSC8292(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD，USA)细胞用作对照。这些结果表明，分离的MLSC不具有造血干细胞表现型。

图6示出了在通过细分级培养方法从骨髓分离的MLSC系上观察到的细胞表面蛋白CD31(PECAM)表达的比较。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD31的表达通过FACS分析进行检测。已建立的MLSC系D4(#3)对于CD31是微弱阳性，而其他MLSC系是阴性的。生长介质中的FGF增加D5(#2)的CD31的表达。这些结果表明，D4(#3)在分化能力和/或细胞功能上具有不同的细胞特性。

图7示出了在通过细分级培养方法从骨髓分离的MLSC系上观察到的细胞表面蛋白CD105(SH2)表达的比较。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD105的表达通过FACS分析进行检测。已建立的MLSC系D5(#1)表现出中等水平的CD 105表达，而其他干细胞系表现出高水平的CD105。这些结果表明，D5(#1)在分化能力和/或细胞功能上具有不同的细胞特性。

图8示出了在通过细分级培养方法从骨髓分离的MLSC系上观察到的细胞表面蛋白CD73(SH3，SH4)表达的比较。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD73的表达通过FACS分析进行检测。已建立的MLSC系D4(#1)表现出非常低水平的CD73表达，并且D4(#3)和D5(#2)表现出中等水平，而D5(#1)一点也不表达。这些结果表明，每一个干细胞系在分化能力和/或细胞功能上具有独特的细胞特性。

图9示出了在通过细分级培养方法从骨髓分离的MLSC系上观察到的细胞表面蛋白CD34表达的比较。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD34的表达通过FACS分析进行检测。已建立的MLSC系D4(#1)、D4(#3)和D5(#2)表现出低水平的CD34表达，而D5(#1)表现出没有CD34表达。这些结果表明，每一个干细胞系在分化能力和/或细胞功能上具有独特的细胞特性。

图10A-10D示出了分离MLSC的成软骨分化。利用甲苯胺蓝(Toluidine-blue)的组织化学染色表明，成软骨分化的MLSC对于该染色是高度阳性的(在成软骨诱导后21天进行测试)。(A&B)在常规介质(常规血清组，regular medium)中生长的细胞团块。(C&D)在成软骨诱导介质中生长的细胞团块。结果表明，在成软骨诱导介质中生长的MLSC分泌高水平的蛋白聚糖(proteoglycans)并且可被分化成软骨细胞。

图11A-11D示出了分离MLSC的成骨分化。在成骨诱导后21天，利用冯·科萨染剂(von Kossa stain)的组织化学染色显示出存在与成骨分化的MLSC中基质有关的矿物。(A&B)在常规介质中生长的细胞团块。(C&D)在成骨诱导介质中生长的细胞团块。结果表明，在成骨诱导介质中生长的MLSC可生成高水平的钙并且可被分化成骨细胞。

图12A-12D示出了分离MLSC的成脂肪分化。利用油红-O(Oilred-O)的组织化学染色表明，成脂肪分化的MLSC对于该染色是高度阳性的(在成脂肪诱导后21天进行测试)。(A&B)在常规介质中生长的细胞团块。(C&D)在成脂肪诱导介质中生长的细胞团块。结果表明在成脂肪诱导介质中生长的MLSC可产生中性脂类液泡并且可被分化成脂肪细胞。

图13A-13I示出了分离MLSC的神经原性分化。利用GFAP、Nestin(巢蛋白)、和NeuN抗体的免疫组织学染色表明，用FGF生长的神经原性分化的MLSC对于该染色是高度阳性的(在神经原性诱导后7天和14天进行测试)。(A，D&G)在标准培养基中生长并用所述抗体孵育的MLSC。(B，E&H)在神经原性诱导后7天用每一种抗体染色的细胞。(C，F&I)在神经原性诱导后14天用每一种抗体染色的细胞。结果表明，在神经原性诱导介质中生长的MLSC可分别合成神经胶质细胞特异性蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神经细胞标记蛋白、Nestin和NeuN，并且可被分化成神经细胞。

图14A-14I示出了用FGF生长的分离MLSC的神经原性分化。利用GFAP、Nestin、和NeuN抗体的免疫组织学染色表明，用FGF生长的神经原性分化的MLSC对于该染色是高度阳性的(在神经原性诱导后7天和14天进行测试)。(A，D&G)在标准培养基中生长并用所述抗体孵育的MLSC。(B，E&H)在神经原性诱导后7天用每一种抗体染色的细胞。(C，F&I)在神经原性诱导后14天用每一种抗体染色的细胞。结果表明，在具有FGF的神经原性诱导介质中生长的MLSC可分别合成神经胶质细胞特异性蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神经细胞标记蛋白、Nestin和NeuN，并且可被分化成神经细胞。

图15A-15D示出了在肝原性诱导介质中生长的分离MLSC的形态变化。在肝原性诱导介质中生长后14天观察形态变化。(A)在标准培养基中生长的MLSC的形态。(B，C&D)在肝原性诱导介质中生长14天的MLSC的肝脏形态变化。结果表明，在肝原性诱导介质中生长的MLSC可分化成肝细胞。

图16A-16F示出了通过RT-PCR分析观察到的软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和神经细胞特异性基因表达。总RNA通过RT-PCR分析(A)II型骨胶原(成软骨的，500bp)、(B)骨桥蛋白(成骨的，330bp)、(C)过氧化物酶体增殖子活化的受体γ2(PPARγ2)(成脂肪的，352bp)、(D)神经丝分子(NF-M)(神经原性的，430bp)以及(E)甲胎蛋白(αFP)(肝原性的，216bp)的表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达用作内部对照。M：DNA分子大小标记物；N：未诱导的；C：成软骨的；O：成骨的；A：成脂肪的；Ne：神经原性的；以及H：肝原性的。这些结果有力地表明，分离的MLSC可在每一种特定分化条件下表达细胞特异性基因并且可被分化成多种系。

图17示出了分离MLSC系的细胞因子分泌。利用Quantikine

Human TGF-β1、b-NGF、LIF、IL10、HGF、IL2、TGF-α、和IL12，对MLSC培养物上清液的等分样品通过ELISA进行分析。TGF-β1、LIF、TGF-α和IL10表现出高水平的分泌，而其他表现出低的或没有分泌。通过分离MLSC的高水平TGF-β1分泌表明，这些干细胞可在抑制T细胞活化中起作用。而且，相对高水平的其他细胞因子如LIF、TGF-α和IL10表明这些细胞可以具有免疫调节活性。

具体实施方式

在本中请中，“一个”和“一种”用来指单个和多个目标。

如本文使用的，“体样(身体样品，bodily sample)”是指获自哺乳动物的期望用来分离单个细胞型的任何样品。这样的体样包括骨髓样品、外周血、脐带血、脂肪组织样品、和细胞因子活化的外周血。

如本文使用的，“细胞的样品(细胞样品)”是指任何样品，其中包含不同类型细胞的混合物，包括骨髓样品、外周血、脐带血、脂肪组织样品、和细胞因子活化的外周血。

如本文使用的，细胞的“同源(均匀)”种群通常表明，相同类型的细胞存在于该种群中。基本上同源的可以表示约80％同源，或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同源。

如本文使用的，“低密度细胞”是指具有比样品中的其他细胞更低的密度并且是分离目标的细胞。低密度细胞包括但不限于多种系干细胞、祖细胞、其他髓间质细胞。

如本文使用的，“MLSC”是指多种系干细胞。

如本文使用的，“MLSC/PC”是指多种系干细胞或祖细胞。

如本文使用的，“MSC”是指髓间质细胞或间充质干细胞(这些术语可互换使用)。

细分级技术(subfractionation technique)

本申请描述了一种新的方法，即细分级培养方法，用于从体样或来源于如人类骨髓分离高度同源的多种系干细胞(MLSC)种群。从1ml的骨髓抽吸物建立了共16个骨髓细胞系。在这16个样品中，对通过FACS分析表现出不同表现型的4个细胞系进一步表征。所有这些细胞系表现出多种系干细胞的特性，如自我更新能力和分化成中胚层、外胚层和内胚层种系细胞的能力。

已经知道，骨髓MSC很难在没有污染的情况下通过造血细胞进行分离[20，21]。对于临床环境中的应用，为了防止免疫原性问题并且为了正确地评价临床效果，具有同源的MSC种群很重要。传统地，MSC的同源种群的分离是通过MSC特异性抗体柱纯化来实现的。然而，即使这种方法也是不足够的，因为还没有这样完好的MSC特异性抗体是可利用的。

用于从生物学样品如骨髓样品分离MLSC的本发明方法的原理是这样的，多种系干细胞或祖细胞具有低细胞密度，因此它们可以以此为基础从样品的其他细胞中分离出来。例如，成熟MSC比快速自我更新(RS)细胞更大[22，23]。已知RS细胞具有更大的对于多种系分化的能力。

在另一方面，使用骨胶原或多熔素涂覆的培养皿，以便获得更多粘附性干细胞。申请人已发现，相比于未涂覆培养皿的表面，任何带电荷的培养物表面(正或负)有助于干细胞附着至其。相比于未涂覆培养皿，更多细胞附着至骨胶原或多熔素涂覆的培养皿，分别大致为约2～3倍(数据未示出)。依据获得单细胞来源的髓细胞集落，利用其他人类骨髓抽吸物和三种不同的小鼠骨髓样品株获得相似结果(数据未示出)，表明这种方法与其他骨髓抽吸物是一致的，并且也可用来分离在其他物种中的MLSC。

因此，在一个实施方式中，培养皿的底部可以涂覆正电荷的氨基酸如多熔素、聚精氨酸、或负电荷的氨基酸如聚天冬氨酸酯(盐)、聚谷氨酸酯(盐)、或它们的组合以有助于干细胞或祖细胞更好地粘附至培养皿的底部。

为了实施本发明的细分级培养方法，不必需采用任何类型的离心以从样品中预除去任何类型的细胞如红细胞或白细胞，因为大多数更重或更密实的细胞可第一、二的2小时孵育步骤中除去。因此，本发明体系的一个优点在于，可以避免传统使用的梯度离心和单核细胞分级步骤(其可能将污染物如Picoll、Fiscoll或Ficoll-Hypaque引入细胞培养物中。因此，本发明的细分级培养方法是一种简单、有效和经济的方案，用于从体样(优选为骨髓样品)分离高度同源MLSC。

可替换地，通过传统的MSC分离的密度梯度离心方法分离/分级的单核细胞也可放入D1培养皿中以获得单细胞源集落，然后分离干细胞或祖细胞的同源种群。因此，分级培养方法可利用通过传统密度梯度离心分级的单核细胞来加以应用。

本申请描述了在分离单细胞源干细胞系的细胞表面蛋白表达中的特性的多样性，其表明在生物学样品(尤其是骨髓样品)中存在若干不同类型的多种系干细胞或祖细胞(都是示例性的)。分离的MLSC对于CD34、HLA-DR、CD73、CD31、CD166、HLAI类通常是阴性的或模糊阳性的，而对于CD44、CD29、CD105是高度阳性的。然而，来自D4和D5培养皿的一些细胞系表现出不同水平的表面蛋白，这表明在骨髓中可存在若干不同类型的多种系干细胞或祖细胞。Hung等人还推测，骨髓可能包括多族的MSC，其在表面标记物分析中不相同[24]。具有不同表面标记物的这些MSC可以代表不同的细胞分化潜力。因此，通过本发明的细分级培养方法分离单细胞源同源干细胞使得有可能分离组织特异干细胞或定型祖细胞，只要这些族的细胞存在于骨髓或其他特异性分离的体样中，并且培养条件在细胞表达期间不改变它们的潜力。MSC处理和细胞移植过程的安全性和效力通过能够用特异性质来表征细胞的亚种群而得以改进，如在本申请中证实的。

本申请示出了一种新颖方法，用来从具有更新和多种系分化成外胚层、中胚层和内胚层种系细胞的能力的任何其他体样(尤其是骨髓样品)的来源于单细胞MLSC系的高度同源种群。通过消除密度梯度离心和单核细胞分级步骤以及无需使用抗体来分离干细胞，本发明的细分级培养方法以简单、有效和经济的过程产生更多的MLSC的同源种群以及对于治疗情形更安全的应用。

用于内胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂

用于内胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂包括以下试剂：干细胞生长因子、制瘤素-M(oncostatin-M)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、转铁蛋白(transferrin)、硒酸(selenius acid)、BSA、亚油酸、抗坏血酸2-磷酸酯(盐)(ascorbate 2-phosphate)、VEGF和地塞米松(dexamethasone)，用于以下细胞型：肝细胞、肺细胞、胰腺细胞、甲状腺细胞和肠细胞。

用于中胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂

用于中胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂包括以下试剂：胰岛素、转铁蛋白、硒酸、BSA、亚油酸、TGF-β1、TGF-β3、抗坏血酸2-磷酸酯(盐)、地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗坏血酸2-磷酸酯(盐)、BMP。以及茚甲新(indomethacine)，用于以下细胞型：软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和血细胞。

用于内胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂

用于内胚层细胞种系的诱导、分化/转化剂包括以下试剂：联丁酰基细胞周期蛋白AMP、异丁基甲基黄嘌呤、人类表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-8、脑来源的神经营养因子、和/或其他神经营养生长因子，用于以下细胞型：神经细胞、皮肤细胞、脑细胞、和眼细胞。

本发明不局限于通过本文描述的特定实施方式的范围。事实上，除了本文描述的那些实施方式之外，对于本领域的技术人员来说，根据前述和附图，本发明的各种变形将变得显而易见。这样的变形落入所附权利要求的范围内。以下实施例通过举例说明本发明的方式提供，不用于限制本发明。

实施例

实施例1-MLSC和细胞培养物的分离

在Inha大学医学院IRB的知会同意和批准之后，将取自经历骨髓检查的患者的髂嵴(iliac crest)的1ml丢弃的人骨髓抽吸物与15ml的完全生长介质进行混合物，该完全生长介质为含有高或低葡萄糖(GIBCOBRL，life-technologies，MD USA)的Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM)，具有20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素，然后在100mm培养皿中孵育。如图1所示，在37℃、5％CO₂孵育2小时后，仅将细胞培养物上清液转移到未涂覆的、骨胶原或多熔素涂覆的培养皿并孵育2小时(D1)。在将该上清液再次转移到新的培养皿之后(D2)，将上清液转移到新的培养皿，然后孵育1天(D3)。用1天和2天孵育(分别为D4和D5)重复两次或更多次。将在D4或D5培养皿中生长的单个集落首先转移到100mm板，然后在更大培养瓶中保持扩展。在100mm板中通常10～14天之后，用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA(GIBCO-BRL)收获细胞，以1x10⁶个细胞/ml悬浮在10％二甲基亚砜(DMSO)和40％FBS中，并在液氮中冷冻1ml等分样品(第1代)。对于单个集落的分开和分离，利用无菌注射器使用胰蛋白酶/EDTA达1-2分钟。一旦细胞达到约80～90％铺满(confluence)，则将它们利用胰蛋白酶/EDTA回收并以50-100个细胞/cm²重新铺放(replate)。

实施例2-流式细胞仪分析

从单细胞源集落分离和扩展的细胞通过流式细胞仪分析对一板细胞表面蛋白在第3代或第4代进行表征。通过胰蛋白酶/EDTA处理从75cm烧瓶收获细胞并用PBS洗涤两次。将细胞在具有0.1％羊血清的PBS孵育用于封闭，然后用洗涤缓冲液(具有0.4％BSA的PBS)洗涤两次。在4℃下，用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)-结合的抗体孵育该细胞40min。测试的抗原包括基质受体(CD13，CD14，CD105)、整联蛋白(CD29)、PECAM(CD31)、ALCAM(CD166)、SH3和SH4(CD73)、Thy-1(CD90)和造血种系标记物(CD34，HLA-DR，HLA-I类)(BD BiosciencePharmingen，San Diego，CA，USA)。然后将细胞混合物用洗涤缓冲液洗涤两次，并利用荧光活化的细胞分选仪(FACS)(具有用于绿色FITC荧光的525nm过滤器并具有用于红色PE荧光的575nm过滤器)进行分析。作为对照，使用人类的间充质干细胞(HMSC 8292，Cambrex Bio Science，Walkersville，MD USA)。

实施例3-多种系分化的诱导

利用第3代或第4代细胞，将团块培养物分析用于成软骨、成骨、成脂肪的分化实验。将在0.5ml培养基中的2×10⁵个细胞旋降以形成团块。将在含有高葡萄糖和20％FBS的DMEM中以下上清液用于每一个种系，成软骨分化介质：6.25μg/ml胰岛素(SigmaChemical Co，St Louis，MO，USA)、转铁蛋白(Sigma)、6.25ng/ml硒酸(Sigma)/1.25mg/ml BSA(Sigma)、5.35μg/ml亚油酸(Sigma)、TGF-β1 10ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)和TGF-β310ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)；成骨分化介质：50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、10^-8M地塞米松(Sigma)、和10mM β-甘油磷酸酯(Sigma)；成脂肪分化介质：抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、10^-8M地塞米松(Sigma)和50μg/ml茚甲新(Sigma)。团块培养物在37℃、5％CO₂下进行孵育并每3天更换介质。

对于神经原性分化，在第3代的分离和扩展细胞利用基础介质以1×10⁴个细胞的浓度接种到6孔培养板中。在24小时之后，抛弃基础介质并用神经元分化介质替换。细胞用1mM联丁酰基细胞周期蛋白AMP(dbcAMP；Sigma，St.Louis，MO)、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMC；Sigma，St.Louis，MO)、20ng/ml人类表皮生长因子(hEGF；Sigma，St.Louis，MO)、40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Sigma，St.Louis，MO)、10ng/ml成纤维细胞生长因子-8(FGF-8；PEPROTECHINC，Rocky Hill，NJ)、10ng/ml脑源神经营养因子(BDNF；R&D Systems，Minneapolis，MN)进行培养。具有1×B27上清液(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)的NEUROBASAL^TM介质(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)是用于中枢神经系统的海马和其他神经元的长期存活性的无血清基础介质。

对于干细胞分化，在第4代的分离和扩展细胞以浓度1×10⁴个细胞铺入(接种于)60mm培养皿中。在24小时之后，细胞用分化介质处理，该分化介质含有20mg/ml干细胞生长因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生长因子(Sigma)、20ng/ml成纤维细胞生长因子-4(R&D)、10ng/ml碱性表皮生长因子(Sigma)、50mg/ml ITS+预混物(Becton Dickinson；6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25ng/ml硒酸、1.25mg/ml BSA、5.35mg/ml亚油酸)、0.1μM抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、10^-8M地塞米松(Sigma)。每3天更换介质。

实施例4-组织化学染色和免疫组织化学染色

组织化学染色和免疫组织化学研究在开始分化培养之后14天或21天进行。在移出分化介质之后，团块用PBS洗涤两次。将团块嵌入OCT化合物(Sakura Finetek，Torrance，CA，USA)并将6μm切片染色。组织用甲苯胺蓝、冯·科萨染剂以及红油-O染色，以分别显示成软骨分化、成骨分化和成脂肪分化。还对II型人类骨胶原实施免疫组织化学染色以证实该组织的成软骨分化。

为了神经元细胞的免疫细胞化学染色，接着将所有的孔都用99.9％乙醇固定并用小鼠抗-神经元细胞核抗原(NeuN，10μg/ml)IgG单克隆抗体(Chemicon，Temecula，CA)、小鼠抗-巢蛋白(nestin)(5μg/ml)IgG单克隆抗体(Chemicon，Temecula，CA)和单克隆抗-胶质纤维酸性蛋白(GFAP，1：400；Sigma，St.Louis，MO)在室温下标记1小时。细胞用PBS漂洗，并利用Histostain-Plus试剂盒(Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，CA)检测免疫染色。DAB用作色原体(chromogen)。细胞用数码相机拍照以评价神经元特异性标记物的阳性表达。

实施例5-RNA提取和RT-PCR分析

利用TRIZOL(Invitrogen Co，Carlsbad，CA，USA)试剂，从未分化的和分化的细胞提取总RNA。利用反转录系统试剂盒(Promega)，互补DNA用总RNA(1μg)进行合成。PCR利用设计用于以下每个种系的特异性引物来实施：col-2(500bp)，正义(有义)：5’-AAGATGGTCCCAAAGGTGCTCG-3′(SS101-F SEQ ID NO：1)和反义：5’-AGCTTCTCCTCTGTCTCCTTGC-3′(SS101-R SEQ ID NO：2)；骨桥蛋白(330bp)，正义：5-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3′(SS102-F SEQ ID NO：3)和反义：5′-CGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3′(SS102-R SEQ ID NO：4)；PPAR-γ2(352bp)，正义：-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3′(SS103-F SEQ ID NO：5)和反义：5’-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3′(SS103-R SEQ ID NO：6)；GAPDH(350bp)，正义：5‘-AACTCCCTCAAGATTGTCAGCA-3’(SS104-F SEQ ID NO：7)和反义：5’-TCCACCACCCTGTTGCTTGTA-3′(SS104-R SEQ ID NO：8)；NF-M(430bp)，正义：5’-GAG CGCAAAGACTACCTGAAGA-3′(SS105-F SEQ ID NO：9)和反义：5’-CAGCGATTTCTATATCCAGAGCC-3’(SS105-R SEQ ID NO：10)；以及αFP(216bp)，正义：5’-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3’(SS106-F SEQ ID NO：11)和反义：5’-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3’(SS106-R SEQ ID NO：12)。PCR实施35个循环，其中每一个循环为在95℃变性1min，在56℃退火1min，以及在72℃伸长1min。扩增的DNA产物在1％琼脂糖凝胶上运行。

实施例6-结果

实施例6.1-骨髓细胞集落的分离和扩展

为了考察是否可能通过细分级培养方法分离人类骨髓干细胞或祖细胞，如图1所描述的，将骨髓与培养介质混合并通过仅转移细胞培养物上清液到新的培养皿而保持分级。这种分级的原理是基于如下假设：骨髓干细胞或祖细胞可能具有低的细胞密度。通常在D1和D2培养皿中不可能获得良好分离的单个集落。在D1和D2培养皿中观察到存在至少少数几种具有不同形态和尺寸的不同细胞型，表明在骨髓源粘附单层培养物中的细胞异源性。D1或D2培养皿中的粘附细胞分别在从前一培养皿转移上清液后7～14天或14～21天达到铺满。有可能在D3、D4和D5培养皿中获得良好分离的单细胞源集落。最初粘附性纺锤形细胞在从前一培养皿转移上清液后的14～21天之间呈现为单个集落。在D3、D4和D5培养皿中分别出现10个、3个和3个单细胞源集落。

图2示出了在骨髓细胞最终细分级后3天从骨髓分离的多种系干细胞的形态学特性。细胞具有成纤维细胞状形态。细胞在第7天达到具有稠密和同源(均匀)形态的铺满。在分离MLSC的六次传代之后，相比于较早传代的细胞，少部分(少于2～3％)的MLSC的形态变为更宽和更大形状。分离和扩展的MLSC的形态是纺锤形，这类似于已知的髓间质干细胞。一旦大约200～300个细胞的集落形成，则将细胞以如正常成纤维细胞的细胞一样快速进行增殖。在从D4和D5培养皿中的单个集落产生的6个细胞系之中，4个细胞系通过FACS分析表现出不同表现型并进一步加以表征。在培养皿中处于70-80％铺满的这些细胞系示于图3中。

实施例6.2-骨髓细胞系的表现型表征

为了表征单细胞源骨髓细胞系的表现型，通过FACS分析对一板细胞表面蛋白进行分析，总结在表1中。

表1：通过FACS分析测定的分离MLSC系的细胞表面蛋白表达的总结

细胞表面蛋白	D4(#1)	D4(#3)	D5(#1)	D5(#2)	D5(#2，FGF)
细胞表面蛋白	D4(#1)	D4(#3)	D5(#1)	D5(#2)	D5(#2，FGF)	CD13	L	L	N	L	L
CD29	H	H	I	H	H	CD13	L	L	N	L	L
CD29	H	H	I	H	H	CD31	L	L	N	N	I
CD34	L	L	N	L	L	CD31	L	L	N	N	I
CD34	L	L	N	L	L	CD44	H	H	H	H	H
CD73	L	L	N	L	I	CD44	H	H	H	H	H
CD73	L	L	N	L	I	CD90	H	H	H	H	I
CD105	H	H	I	H	H	CD90	H	H	H	H	I
CD105	H	H	I	H	H	CD166	H	H	I	H	H
HLA-DR	N	L	N	N	L	CD166	H	H	I	H	H
HLA-DR	N	L	N	N	L	HLA-I类	H	H	I	H	H

(N-阴性，L-低，I-中，H-高)

结果表明，表面表达的总分布外形相似，例如，所有分离的细胞系都对CD29、CD44、CD73(SH3，SH4)、CD90、CD105(SH2)、CD166和HLA-I类是明显阳性的。然而，在测试的11个细胞表面蛋白中，在9个细胞表面蛋白表达和在CD44和CD90的类似水平的表达中，每一个细胞系具有相对独特的表达外形。而且，D5(#1)细胞系对于CD31、CD34和HLA-DR是阴性的，并且D5(#2)对CD31、HLA-DR是阴性的，但对CD34是微弱阳性的，而D5(#3)对于CD31、CD34和HLA-DR是阳性的(图4)。这些结果表明在人类骨髓中存在若干不同类型的干细胞。

图5显示出在通过本发明的细分级培养方法从骨髓分离的MLSC上没有观察到造血干细胞表面蛋白。流式细胞仪分析表明，MLSC对于用于早期造血干细胞的HLA-DR和CD34标记蛋白是阴性的。HMSC8292(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD，USA)细胞用作对照。这些结果表明分离的MLSC不具有造血干细胞表现型。

至于在分离细胞种系上的若干代表性表面蛋白标记物CD31、CD105、CD73和CD34的表达，图6-9示出了它们的对比结果。图6示出了在通过本发明细分级培养方法从骨髓分离的MLSC系上观察到的细胞表面蛋白CD31(PECAM)表达。D4(#1)、D4(#3)、D5(#1)、D5(#2)和具有FGF的D5(#2)的CD31的表达通过FACS分析进行检测。建立的MLSC系D4(#3)对于CD31是微弱阳性的，而其他MLSC系是阴性的。在生长介质中的FGF增加D5(#2)的CD31的表达。这些结果表明，D4(#3)在分化能力和/或细胞功能上具有不同的细胞特性。

图7示出了细胞表面蛋白CD105(SH2)表达的对比结果。建立的MLSC系D5(#1)表现出中等水平的CD105表达，而其他干细胞系表现出高水平的CD105。

图8示出了细胞表面蛋白CD73(SH3，SH4)表达的对比结果。建立的MLSC系D4(#3)表现出非常低水平的CD73表达，并且D4(#3)和D5(#2)表现出中等水平，而D5(#1)根本不表达。

图9示出了细胞表面蛋白CD34表达的对比结果。建立的MLSC系D4(#3)、D4(#3)和D5(#2)表现出低水平的CD34表达，而D5(#1)没有表现出CD34表达。以上结果表明，每一个干细胞系在其分化能力和/或细胞功能上具有独特的细胞特性。

实施例6.3-骨髓细胞系的多种系分化

为了确定单细胞源骨髓细胞系的分化能力，在各个细胞特异性诱导介质中，通过团块培养系统测试成软骨、成骨和成脂肪分化并通过标准细胞培养基测试肝原性分化。所有分离的细胞系能够分化成成软骨种系、成骨种系、成脂肪种系、神经原性和肝原性种系(表2)。4个分离的MLSC系表现出不同水平的分化能力。例如，D5(#2)干细胞系能够分化成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和神经细胞，而其他在成软骨、神经原性或肝原性种系上具有不同水平的分化能力。

表2：分离MLSC系的分化能力的总结

	D4(#1)	D4(#3)	D4(#1)	D5(#2)	D2(#2，FGF)
	D4(#1)	D4(#3)	D4(#1)	D5(#2)	D2(#2，FGF)	成软骨	H	H	H	H	I
骨形成	N	L	I	H	H	成软骨	H	H	H	H	I
骨形成	N	L	I	H	H	成脂肪	H	H	H	H	H
神经原	I	H	L	H	H	成脂肪	H	H	H	H	H
神经原	I	H	L	H	H	肝原	L	L	N	H	H

(N-阴性，L-低，I-中，H-高)

实施例6.4-骨髓细胞系的成软骨分化

处于第3代或第4代的4个单细胞源骨髓细胞系在成软骨分化介质(6.25μg/ml胰岛素、转铁蛋白、6.25ng/ml硒酸、1.25mg/mlBSA、5.35μg/ml亚油酸、TGF-β1 10ng/ml、和TGF-β3 10ng/ml)中进行团块培养。成软骨分化在处理后14～21天实现。通过免疫组织化学染色的阳性甲苯胺蓝组织化学染色和富II型骨胶原胞外基质是明显的(图10)。相反在标准培养基中培养的细胞系表现出阴性染色。

实施例6.5-骨髓细胞系的成骨分化

处于第3代或第4代的4个单细胞源骨髓细胞系在成骨分化介质(50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯，10^-8M地塞米松，和10mM β-甘油磷酸酯)中进行团块培养。成骨分化在处理后14～21天实现。在成骨分化介质中生长的细胞中的阳性冯·科萨染剂染色是明显的，而在标准培养基中生长的对照细胞是不明显的(图11)。

实施例6.6-骨髓细胞系的成脂肪分化

处于第3代或第4代的4个单细胞源骨髓细胞系在成骨分化介质(50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯，10^-7M地塞米松，和50μg/ml茚甲新)中进行团块培养。成脂肪分化在处理后14～21天实现。在成脂肪分化介质中的阳性红油-O染色是明显的，而在标准培养基中生长的对照细胞没有检测到染色(图12)。

实施例6.7-骨髓细胞系的神经原性分化

处于第3代或第4代的4个单细胞源骨髓细胞系在神经原性分化介质(1mM联丁酰基细胞周期蛋白AMP，0.5mM异丁基假黄嘌呤，20ng/ml人类表皮生长因子，40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子-8，10ng/ml成纤维细胞生长因子-8、10ng/ml脑源神经营养因子)中进行团块培养。神经原性分化在处理后14～21天实现。在神经原性分化的细胞中的阳性GAFP、NeuN和巢蛋白染色是明显的，而在标准培养基中生长的对照细胞没有检测到染色(图13)。

此外，图14示出了用FGF生长的分离MLSC的神经原性分化。用GFAP、巢蛋白、和NeuN抗体的免疫组织学染色表明，在神经原性诱导后7天和14天进行检测，用FGF生长的神经原性分化的MLSC对于该染色是高度阳性的。在具有FGF的神经原性诱导介质中生长的MLSC也可分别合成神经胶质细胞特异性蛋白(GFAP)早期和晚期神经细胞标记蛋白、巢蛋白和NeuN，并且可分化成神经细胞。这表明用FGF培养分离的细胞不改变神经原性分化能力。

实施例6.8-骨髓细胞系的肝原性分化

处于第3代或第4代的4个单细胞源骨髓细胞系在肝原性分化介质中进行培养，该分化介质含有20mg/ml干细胞生长因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生长因子(Sigma)、20ng/ml成纤维细胞生长因子-4(R&D)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长(Sigma)、50mg/ml ITS+预混物(Becon Dickinson；6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，6.25ng/ml硒酸，1.25mg/mlBSA，5.35mg/ml亚油酸))、1.0μM抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、10^-8M地塞米松(Sigma)。每3天更换介质(图15)。

实施例6.9-骨髓细胞系的软骨、骨、脂肪、神经元和干细胞特异性基因表达

为了检测分化的单细胞源骨髓细胞系中的软骨、骨、脂肪、神经元和干细胞特异性基因的表达，利用第4代或第5代细胞来实施RT-PCR分析。软骨(II型骨胶原)、骨(骨桥蛋白)、脂肪(PPARγ2)、神经元(NF-M)和干细胞(αFP)的种系特异性基因表达在分化的细胞中进行检测(图16)。相反，这些基因在未分化的对照细胞中不表达。GAPDH的表达用作内部对照。这些结果有力地表明，分离的MLSC可表达在各个特异性分化条件中的细胞特异性基因，并且可分化成多种系。

实施例6.10-骨髓细胞系的细胞因子的表达

图17示出了分离MLSC系的细胞因子分泌。利用Quantikine

HumanTGF-β1、b-NGF、LIF、IL10、HGF、IL2、TGF-α和IL12对MLSC培养物上清液的等分试样(50～100μl)通过ELISA进行分析。TGF-β1、LIF、TGF-α和IL10表现出高水平的分泌，而其他表现出低的或没有分泌。通过分离MLSC的高水平TGF-β1分泌表明，这些干细胞可在抑制T细胞活化中起作用。而且，相对高水平的其他细胞因子如LIF、TGF-α和IL10表明这些细胞可以具有免疫调节活性。

本文述及的所有参考文献通过引用将其全部内容结合于此作为参考。

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本领域的技术人员仅利用常规实验将认知或者能够理解本文中具体描述的本发明特定实施方式的许多等同替换。这样的等同替换也涵盖在本发明权利要求的范围内。

序列表

<110>宋淳旭(Song，Sun Uk)

<120>多种系干细胞的分离

<130>P17175JHKL

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>1

aagatggtcc caaaggtgct cg 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>2

agcttctcct ctgtctcctt gc 22

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>3

ctaggcatca cctgtgccat acc 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>4

cgtgaccagt tcatcagatt catc 24

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>5

gctgttatgg gtgaaactct g 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>6

ataaggtgga gatgcaggct c 21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>7

aactccctca agattgtcag ca 22

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>8

tccaccaccc tgttgcttgt a 21

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>9

gagcgcaaag actacctgaa ga 22

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>10

cagcgatttc tatatccaga gcc 23

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>11

tgcagccaaa gtgaagaggg aaga 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物

<400>12

catagcgagc agcccaaaga agaa 24

Claims

1.一种处理细胞的生物学样品的方法，包括：

(i)使所述细胞的样品沉积在一个容器中；

(ii)将上清液从所述容器转移到另一个容器中；以及

(iii)从所述上清液中分离细胞，其在所述样品中具有相对较低的密度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述细胞的样品与生长介质混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，实施所述步骤(i)和(ii)至少三次。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，将从所述上清液分离出的所述分离细胞进行扩展。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述容器具有平底。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述容器涂覆有细胞粘附剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述细胞粘附剂包括任何带电荷氨基酸的聚合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞粘附剂是骨胶原、多熔素、聚精氨酸、聚天冬氨酸酯(盐)、聚谷氨酸酯(盐)、或者它们的组合。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞的样品从骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织样品、或细胞因子活化的外周血获得。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，多种系干细胞或祖细胞的单个集落被分离。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞的生物学样品在进行任何离心之前获得。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞的生物学样品在进行任何离心之后获得。

13.根据权利要求1所述的方法，其不包括离心所述细胞的样品。

14.根据权利要求1所述的方法，包括使步骤(iii)中的所述分离细胞与结缔组织细胞转化/分化介质相接触，从而形成中胚层种系细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述中胚层种系细胞是结缔组织细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述结缔组织细胞是软骨细胞，而所述转化/分化介质是软骨细胞转化/分化介质。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述结缔组织细胞是脂肪细胞，而所述转化/分化介质是脂肪细胞转化/分化介质。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述结缔组织细胞是骨细胞，而所述转化/分化介质是骨细胞转化/分化介质。

19.根据权利要求1所述的方法，包括使步骤(iii)中所述分离的细胞与外胚层组织细胞转化/分化介质相接触，从而形成外胚层种系细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述外胚层种系细胞是神经组织细胞，而所述转化/分化介质是神经组织转化/分化介质。

21.根据权利要求1所述的方法，包括使步骤(iii)中所述分离的细胞与内胚层组织细胞转化/分化介质相接触，从而形成内胚层种系细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述内胚层种系细胞是肝原性组织细胞，而所述转化/分化介质是肝原性组织细胞转化/分化介质。