CN109749991A - 干细胞的层分离培养及增殖方法 - Google Patents

干细胞的层分离培养及增殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞的层分离培养及通过其获取的单克隆干细胞的增殖方法。根据本发明的干细胞的层分离培养及增殖方法，除了可快速无污染地获取单克隆干细胞的层分离培养法的优点之外，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此可有效利用于干细胞治疗剂的制备。

Description

干细胞的层分离培养及增殖方法
技术领域
本发明涉及干细胞的层分离培养及通过其获取的单克隆干细胞的增殖方法。
背景技术
干细胞具有可成长为我们身体的210多个所有器官的组织的潜在能力，并且可无限分裂，并通过适当的操作而分化成所需的器官。由于这种干细胞的特性，干细胞作为新型治疗剂而备受瞩目，并且利用干细胞治疗难治性疾病的可能性非常高，预计可治疗许多疾病，如白血病，骨质疏松症，肝炎，帕金森病，老年性痴呆，烧伤等。
然而，在干细胞的情况下，在很难大量获取其的这一点上仍然具有很多限制。作为获取干细胞的方法，可以说从冷冻胚胎细胞获取的方法为有效，但在伦理方面还存在许多争议。为了解决这种问题，还研究了利用体细胞核移植方法或成体干细胞来获取干细胞的方法。比胚胎干细胞的研究更加活跃进行的领域为成体干细胞的研究。作为存在于中枢神经系统或骨髓等各种器官中而参与成长期的器官发育及损伤时的再生的细胞，成体干细胞存在于各种器官中，因此可在包括骨髓、脾脏、脂肪细胞等的各种部位获取，但从骨髓获取的方法为最常见的。但是，在从许多各种骨髓细胞中分离并培养多个间充质干细胞的方面上，难以获取始终呈均匀形态的细胞，因此正在进行用于完善这种问题的研究。
作为在分离初期利用所谓菲科帕克(Ficoll-paque)的方法来仅将多个单核细胞分离并将细胞附着于培养容器中的方法的Friedenstein等人所使用的分离方法仍然被广泛使用，但在使用这种方法的情况下，细胞的特性不恒定，间充质干细胞可与其他多个单核细胞共同存在，因此很难产生单一性细胞组。因此，已经设计出了用于取得更为相同的细胞的各种方法，但用于分离附着于培养容器的底部成长的所有细胞的Luria等人的方法存在可混合分离出不是间充质干细胞的其他干细胞的缺点(Luria et al.，Transfusion，11:345-349，1971)，Simmons等人的方法为利用在间充质干细胞的细胞表面抗原中的使用对Sca-1、STRO-1的特异性抗体的方法，因此成本较多且一直存在污染问题(Simmons et al.，Blood，78:55-62，2002)。作为利用细胞大小之差的间充质干细胞分离方法，Hung等人的方法存在间充质干细胞的纯度不恒定并有可能混入其他干细胞的缺点(Hung et al.，StemCells，20:249-258，2002)。
为了解决如上所述的问题，本发明人发明了新式的命名为层分离培养法(subfractionation culturing method，SCM)的干细胞的分离方法，通过韩国专利申请KR10-2006-0075676号申请了专利，并取得了授权。与其他方法相比，上述层分离培养法不仅能够以低成本进行，并且不存在污染问题，可不用顾虑混入其他干细胞而有效地获取单克隆间充质干细胞(MSC)的这一点上，与其他的干细胞获取方法相比，具有极好的优秀性。
由本发明人设计的新型层分离培养法(subfractionation culturingmethod，SCM)可从小鼠及人类细胞获取源自单细胞的单克隆间充质干细胞，并不需要离心分离或酶降解。上述层分离培养法的原理为基于细胞密度及孵育板附着来分离间充质干细胞。
但是，尽管上述方法具有优秀性，但为了大量生产单克隆间充质干细胞来用作最终产物，层分离培养法需要制造工作细胞库，并通过它来获取最终产物的工序才可取得充分量的单克隆间充质干细胞，并且需要约10次传代至12次传代的培养，因此从这一方面上，难以快速取得单克隆间充质干细胞集团。
发明内容
在通过如上所述的层分离培养法的改善来研究用于诱导单克隆干细胞的快速增殖的研究当中，本发明人发现将单克隆干细胞的培养细胞密度调低，并添加抗氧化剂来进行培养的情况下，可诱导出有效的细胞增殖率的增加，并且完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供得以改善的现有的层分离培养法的干细胞的层分离培养及增殖方法。
为了实现上述目的，本发明提供包括如下步骤的干细胞的层分离培养及增殖方法：步骤1)，培养的骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，仅分离出上述步骤2)的上清液，在培养容器中在37℃温度条件下培养1小时至3小时，然后在37℃下将上清液的培养重复2次至3次(每次12小时至36小时)，接着，在37℃温度条件下将上清液培养24小时至72小时，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
根据本发明的干细胞的层分离培养及增殖方法，除了可快速无污染地获取单克隆干细胞的层分离培养法的优点之外，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此可有效利用于干细胞治疗剂的制备。
附图说明
图1为示出从人的骨髓的分离间充质干细胞的层分离培养法的图。
图2为示出通过显微镜观察并确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的形态学变化的结果的图。
图3的A部分为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以前向散射(FSC)的平均值来进行确认的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图3的B部分为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以SSC的平均值来进行确认的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图4为示出通过β-gal-染色法来对细胞培养密度及细胞培养传代不同的间充质干细胞进行染色之后确认细胞是否老化的结果的图。
图5为示出以不同的细胞培养密度来培养传代15次的间充质干细胞之后利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来确认作为老化相关基因的P15、P16及作为增殖标记的增殖细胞核抗原(PCNA)的结果的图。
图6为示出通过群体倍增时间(PDT，Population doubling time)及群体倍增水平(PDL，Population doubling level)来确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的增殖能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图7示出确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的分化能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图7的A部分为通过油红O组织学染色法来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的间充质干细胞的脂肪细胞的分化能力的图。图7的B部分为示出对A部分的组织学染色程度进行定量化的图。图7的C部分为通过茜素红S(Alizarin red S)组织学染色来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的间充质干细胞的骨化细胞的分化能力的结果。图7的D部分为示出对C部分的组织学染色程度进行定量化的图。
图8的A部分为示出由根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞生产的总活性氧(ROS)生产的图。图8的B部分为示出通过彗星试验(comet assay)来确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代的总活性氧生产引起的脱氧核糖核酸(DNA)损伤的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图9为示出为了确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代生产的活性氧引起的脱氧核糖核酸损伤程度而测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG，8-hydroxy-deoxyguanosine)浓度的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图10为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸追加(HD+AA)来培养传代11次至传代15次的间充质干细胞之后确认细胞增殖能力的变化的结果图。
图11为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸追加(HD+AA)来培养传代15次的间充质干细胞之后对所生产的活性氧水平进行比较的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图12为示意性地示出用于改善层分离培养法的试验方法的图。
图13为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM01单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基(LG-DMEM)、α-伊格尔极限必需培养基(α-MEM)来培养的细胞的增殖率的结果的图。图13的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图13的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图14为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM02单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图14的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图14的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图15为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM03单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图15的A部分为示出各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图15的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图16为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM04单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图16的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图16的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图17为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM05单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图17的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图17的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图18为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM06单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图18的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图18的B为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图19为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM07单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图19的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图19的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图20为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度接种通过层分离培养法取得的SCM08单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基、α-伊格尔极限必需培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。图20的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，图20的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图21为示出确认利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图22为示出确认利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
图23为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图24为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
图25为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm2的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图26为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm2的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
具体实施方式
本发明提供间充质干细胞的层分离培养及增殖方法。
本发明的方法为对现有的层分离培养法进行改善的方法，除了可快速无污染地获取将单克隆干细胞，优选地，将单克隆间充质干细胞的层分离培养法的优点之外，通过单克隆干细胞的快速增殖，优选地，可通过单克隆间充质干细胞的快速增殖来在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞。
以下，详细说明本发明。
本发明提供包括如下步骤的干细胞的层分离培养及增殖方法：步骤1)，培养骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，仅分理处上述步骤2)的上清液，在培养容器中在37℃温度条件下培养1小时至3小时，然后在37℃下将上清液的培养重复2次至3次(每次12小时至36小时)，接着，在37℃温度条件下将上清液培养24小时至72小时，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及步骤5)，50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将单克隆干细胞接种于培养基来进行培养。
上述步骤1)至步骤3)可与韩国KR 10-2006-0075676号中所记载的层分离培养方法相同地进行，韩国KR 10-2006-0075676号可全文并入本发明中。
本发明的“层分离培养”是指根据比重分离干细胞的方法，首先，将人的骨髓在细胞培养液中进行培养之后，仅获取上清液，并将其移入经涂层剂的处理或未经涂层剂的处理的培养容器中进行培养之后，重复数次相同过程的工序。像这种层分离培养的特征在于，重复不经离心分离过程且反复取得上清液来进行培养的工序，并且具有最后可无其他细胞的污染而取得单克隆干细胞，优选地，可取得单克隆间充质干细胞的优点。
上述步骤2)及步骤3)的培养是在37℃温度条件下，培养4小时以下，优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟，重复培养是在37℃温度条件下培养4小时以下之后(优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟)，重复2次至3次在37℃温度条件下的12小时至36小时的培养(优选地，培养18小时至30小时)，接着，在37℃温度条件下培养24小时至72小时(优选地，培养36小时至60小时)，每次将上清液移入新的培养容器。简单综述本发明的实施例中所分离的方法为如下。
经培养的多个细胞形成单克隆细胞组，分离该多个单克隆细胞组之后可进行传代培养，本发明的特征在于，为了快速获取大量的通过层分离培养获取的单克隆干细胞而包括步骤5)的培养步骤。
上述步骤5)为以1000细胞/cm2以下的细胞密度，优选地，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将单克隆干细胞接种于培养基中来进行培养的步骤。
上述培养能够以优选为传代1次至传代5次的培养来作为特征。根据本发明，可诱导快速的单克隆干细胞的增殖，因此可快速取得最终产物，并且可通过传代1次至传代5次的培养来制备原始细胞库(MCB，Master Cell Bank)。
如超过1000细胞/cm2的现有的工序，当本发明的单克隆干细胞以4000细胞/cm2的高密度来进行培养时，细胞增殖能力显著降低，间充质干细胞的标记产生变化，并且可丧失干细胞的分化能力。因此，通过层分离培养法取得的单克隆干细胞能够以低密度至中等程度的密度，即，以1000细胞/cm2以下的细胞密度培养，优选地，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度，更优选地，以1000细胞/cm2的细胞密度培养。
与以如4000细胞/cm2的高密度培养的间充质干细胞相比，当以1000细胞/cm2以下的细胞密度培养单克隆间充质干细胞时存在如下的优点，即，细胞的增殖能力在整个长时间的培养期间保持显著的高水平，因此无需重复多次的传代也可快速取得所需的量的大量单克隆细胞。并且，当以上述细胞密度培养单克隆间充质干细胞时，该细胞存在脱氧核糖核酸损伤少，老化受到抑制，可有效保持干细胞的分化能力的优点，并且可快速获取具有优秀的干细胞特性的单克隆间充质干细胞。
用于本发明的培养基均可包含不包含抗氧化剂的培养基、上述培养基中添加有抗氧化剂的培养基或包含抗氧化剂的培养基。
作为不包含抗氧化剂的培养基，并不限于此，但可使用达尔伯克改良伊格尔培养基，根据需要，可向上述培养基中额外地添加抗氧化剂来进行培养。并且，根据需要，可利用包含有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基来进行培养。
本发明的抗氧化剂可无限制地包含可用于细胞培养中的抗氧化剂，并且可以为选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、泛醇、β-巯基乙醇及抗坏血酸组成的组中的一种以上。当培养基中添加有抗氧化剂时，上述抗氧化剂能够以10μg/mL至50μg/mL的浓度，优选地，以10μg/mL至30μg/mL的浓度，更优选地，以25μg/mL的浓度添加。
在本发明的一例中，作为不包含抗氧化剂的培养基，使用达尔伯克改良伊格尔培养基，更优选地，使用LG-达尔伯克改良伊格尔培养基，作为包含抗坏血酸来作为抗氧化剂的培养基，使用α-伊格尔极限必需培养基。
另一方面，可根据本发明的方法，非常有效地增殖单克隆干细胞，因此可省略利用原始细胞库来制备工作细胞库(WCB，Working CellBank)的工序。与现有的层分离培养法的制备原始细胞库之后需要伴随制备工作细胞库的工序的方法相比，该方法使工序单纯化。
本发明的上述步骤5)的培养的特征可以为当传代1次至传代5次培养时以1000细胞/cm2以下的细胞密度培养，并且可具有如下特征，即，优选地，传代1次培养时以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将单克隆干细胞接种于培养基中来进行培养，使其增殖之后，传代2次至传代5次培养时，以1000细胞/cm2以下的细胞，更优选地，以700细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞，进一步优选地，以1000细胞/cm2的细胞密度来将单克隆干细胞接种于培养基中培养。
当利用包含抗氧化剂的培养基来作为本发明的培养基时，上述培养基中还可添加庆大霉素来作为抗生素。
在本发明中，术语“上清液”和术语“上层培养液”可互换使用。
通过本发明的方法取得的间充质干细胞可以为最终以传代5次至传代10次的间充质干细胞，优选地，可以为传代6次至传代8次的间充质干细胞。与现有的最少传代10次至传代12次的间充质干细胞以作为最终产物来被取得的工序相比，该方法为更少的传代数，并且可通过细胞接种密度的调节来容易且大量取得在低的传代中快速得以增殖的间充质干细胞。
以如上所述的方法所取得的间充质干细胞不仅可以为通过层分离培养法取得的单克隆干细胞，还可以为有效地保持有干细胞分化能力的间充质干细胞。尤其，可具有如下的特征，即，与以超过1000细胞/cm2的高密度的细胞密度培养的单克隆干细胞相比，以1000细胞/cm2以下的细胞密度培养的单克隆干细胞更有效地保持骨细胞分化能力。
以下，根据实施例来详细说明本发明。
下述实施例仅用于例示本发明，而本发明的内容不由下述实施例来被限定。
实施例1：根据细胞密度的间充质干细胞分析
为了提供进一步改善韩国国内专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的间充质干细胞的层分离培养法及增殖方法，在培养条件中改变了细胞密度及培养基，并且比较分析了由此所具有的间充质干细胞的特性。
在以下实验中，使通过层分离培养法取得的单克隆间充质干细胞(MSC)的细胞培养密度分别为50细胞/cm2(低密度)、1000细胞/cm2(中等密度)、4000细胞/cm2(高密度)，并分析了由此所具有的细胞的特性。
1.1根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的确认
首先，进行了用于确认长期培养中的根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的实验。为了赋予长期培养条件，利用了传代5次(P5)、传代10次(P10)、传代15次(P15)的间充质干细胞，分别以低密度、中等密度、高密度的条件接种于达尔伯克改良伊格尔培养基中。接着，通过显微镜观察细胞的形态学变化，并判断了干细胞的老化与否，将其结果在图2中示出。
如图2所示，在P5及P10中，根据细胞密度，在细胞大小与形态学图案中呈现出差异，尤其，在P15的情况下，高密度培养条件中观察到了平坦且放大形态的间充质干细胞。像这种形态呈现典型的间充质干细胞的老化，并且确认了在长期培养中细胞的密度调节可调节间充质干细胞的老化。
1.2根据细胞密度的间充质干细胞细胞大小及粒度的确认
为了额外地确认根据细胞密度的干细胞的变化，通过流式细胞荧光分选技术分析来对周知为在经老化的细胞中增加的细胞大小及细胞的粒度(granularity)进行了定量分析，并将其结果在图3中示出。
如图3所示，虽然在P5中细胞的大小为呈现出显著的差异，但在P10及P15的情况下，确认了根据细胞密度而呈现出显著的差异。尤其，在P10及P15中可确认到在高细胞密度的培养条件下，细胞的大小显著增加，并且细胞老化进一步得以促进。与此相同地，在所有传代中呈现出了细胞的粒度也随着细胞的密度增加而显著增加的结果。因此，可确认到在间充质干细胞的长期培养中，细胞的密度的调节可成为调节细胞老化的因素，可通过降低细胞培养密度，来改善在后期传代中呈现的形态学变化。
1.3根据培养细胞密度的间充质干细胞的老化的确认
为了确认实施例1.1及1.2中所确认的形态学变化是否实际上为间充质干细胞的年龄依赖性(age-dependent)现象，进行可选择性地染色老化细胞的β-gal-染色分析法，并且通过逆转录-聚合酶链反应来比较了作为老化相关基因的P15、P16及作为增殖标记的增殖细胞核抗原基因的表达。并将其结果分别在图4及图5中示出。
如图4所示，在P5及P10中，在所有细胞密度中均未能确认老化的细胞的染色，但在P15中，随着细胞密度增大，老化的细胞的染色明显增加。并且，如图5所示，在P15中，随着细胞的培养密度增大，作为老化相关基因的CDK抑制剂P15及P16的基因表达增加，并且作为增殖标记的增殖细胞核抗原减少。
这种结果为表示间充质干细胞的形态学变化与间充质干细胞的老化存在关联的结果，并且为表示细胞培养密度的调节可调节间充质干细胞的老化的结果。
1.4根据培养细胞密度的间充质干细胞的增殖能力变化的确认
众所周知，间充质干细胞的增殖能力随着传代、细胞的老化而逐渐减少。因此，增殖能力可用于确认间充质干细胞的老化的标准，并且进行了长期细胞培养时的根据细胞培养密度的间充质干细胞的增殖能力比较。各个细胞的增殖能力通过初始接种细胞数与培养结束后取得的细胞的数量来计算各个传代的增殖率，并进行了确认，将其结果在表1及图6中示出。
表1
如表1中所示，在以低密度培养的间充质干细胞的情况下，P5、p10、p 15中倍增(fold increase)88.4、34.3、16.4，反之，以中等密度培养的间充质干细胞为8.5、4.9、3.1，以高密度培养的间充质干细胞为3.0、1.9、1.1。并且，如图6所示，确认了群体倍增时间与群体倍增水平也呈现出了类似于倍增的图案。这种结果为表示在长期的间充质干细胞培养中可通过降低细胞密度来使间充质干细胞的增殖能力保持的结果，并且表示即使进行相同的传代培养，也可使间充质干细胞的老化受到抑制，可使间充质干细胞的寿命延长。
1.5根据培养细胞密度的间充质干细胞的分化能力变化的确认
为了确认细胞培养密度是否影响干细胞功能，比较了根据P5至P15培养的分化能力。作为干细胞功能，确认了脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力，在各个传代及密度中进行了定性及定量分析。具体地，脂肪细胞分化培养液通过向高糖(High Glusose)达尔伯克改良伊格尔培养基培养液中添加新生小牛血清(NCS，Newborn Calf Serum，美国吉布科(Gibco)公司产品)、10-7mol的地塞米松(dexamethasone)(美国西格玛(Sigma)公司产品)、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10μg/mL的胰岛素(insulin，美国西格玛(Sigma)公司产品)、100μM的吲哚美辛(indomethacin，美国西格玛(Sigma)公司产品)来制备的培养基并进行了实验，7天分化之后，通过油红O组织学染色来进行了确认。并且，油红O组织学染色之后，利用异丙醇进行洗脱，并在500nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。
骨细胞分化培养液使用了向α-伊格尔极限必需培养基培养液中添加有胎牛血清(FBS，美国吉布科(Gibco)公司产品)、50μg/mL的抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbic 2-phosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10-8mol的地塞米松(美国西格玛(Sigma)公司产品)、10mM的β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)的培养基，21天分化之后，通过茜素红S组织学染色进行了确认。并且，茜素红S组织学染色之后，利用10％的乙酸进行了洗脱，并在405nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。将通过如上所述的方法来确认脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力的结果在图7中示出。
如图7所示，脂肪细胞分化能力随着传代整体上电位(potential)减少，但因密度导致的差异未明显呈现，反之，在骨细胞分化能力的情况下，确认了高密度条件的P15培养组中显著减少的现象。通过这种结果，确认了间充质干细胞的骨细胞分化能力在以低细胞密度培养的情况下，能够更好保持。
1.6根据培养细胞密度的间充质干细胞的抗原谱分析
进行了用于确认细胞培养密度是否还影响干细胞的抗原表达的实验，利用流式细胞分析来确认根据各个传代及培养密度的阳性及阴性抗原表达的变化，并将其结果在表2中示出。
表2
表示2次独立实验的代表值
如表2所示，阴性标记表达的变化未明显地确认出，但一部分阳性标记的情况在传代中也根据细胞培养密度呈现出表达量的变化。尤其，在CD105、CD146的情况下，随着细胞培养密度增加表达量明显减少了。此外，CD73也在P10以上的传代中呈现出了随着培养密度增加表达显著减少的倾向。尤其，在P15中，以高密度培养细胞的情况下，大部分的阳性标记的表达量显著减少了，不仅如此，CD73、CD105、CD105呈现出阴性表达，因此确认到了保持低细胞密度来进行细胞培养可成为非常重要的因素。
1.7根据培养细胞密度的活性氧生产及脱氧核糖核酸损伤的比较
据悉，间充质干细胞的功能的减少及脱氧核糖核酸损伤存在关联，尤其，由作为活性氧的活性氧诱导的脱氧核糖核酸损伤促进间充质干细胞的老化。因此，为了确认根据培养密度总活性氧生产及根据其的脱氧核糖核酸损伤是否不同，通过荧光强度分析来比较根据传代及细胞培养密度的总细胞性活性氧量，并通过彗星试验分析来确认脱氧核糖核酸损伤程度，将其结果在图8中示出。
如图8所示，确认到了总活性氧生产在所有传代中随着细胞培养密度增加而增加的倾向，尤其，在P10、P15中活性氧生产显著增加(A)。彗星试验分析中分类为从脱氧核糖核酸损伤最弱的CC1至损伤最严重的CC5来进行了数据分析，在损伤最严重的CC5的情况下，确认到了随着细胞培养密度增大而显著增加的情况。反之，CC1呈现出了随着细胞密度增大而显著降低的倾向(B)。
额外地，为了确认脱氧核糖核酸损伤是否为由活性氧诱发的，进行了用于确认因活性氧的脱氧核糖核酸损伤的8-羟基脱氧鸟苷的浓度的实验。8-羟基脱氧鸟苷分析方法如下。将从各个细胞取得的脱氧核糖核酸试样50μl放入8-羟基脱氧鸟苷共轭涂层板(conjugate coated plate)之后，在常温下培养了10分钟。之后，额外地放入anti-8-OHdG抗体来在常温下培养了1小时，清洗3次之后，将二级抗体酶偶联物(secondary antibodyenzyme conjugate)放入各个孔板(well)之后，重新在常温下培养了1小时。接着，重新清洗3次之后，放入基质溶液(substrate solution)在常温下培养了30分钟。最后，放入停止液(Stop solution)之后，在450nm下测定吸光度来进行了确认，将其结果在图9中示出。
如图9所示，在脱氧核糖核酸损伤出现最严重的P15组中，随着细胞培养密度增大，8-羟基脱氧鸟苷的浓度显著增加。通过这种结果，因在高密度培养条件下所生产的活性氧而使脱氧核糖核酸损伤增加，由此促进了间充质干细胞的老化。
这种结果为表示将细胞培养密度调低可起到从因间充质干细胞的活性氧生产增加所导致的脱氧核糖核酸损伤保护间充质干细胞的作用的结果。
1.8根据抗氧化剂处理的间充质干细胞增殖及活性氧生产能力的确认
为了确认间充质干细胞的增殖是否受到因在高密度培养条件所生产的活性氧而带来的影响，进行了活性氧消除实验。在P11至P15中，高密度培养条件及在高密度培养条件下添加作为抗氧化剂的抗坏血酸25μg/ml至培养基中进行培养之后，比较两组之间的增殖倍数(Fold)增加，将其结果在图10中示出。
如图10所示，在高密度培养条件下，倍增(Fold increase)在P11至P15中分别为2.6、1.9、1.6，随着传代数增加而增殖能力减少，并开始呈现老化，但经抗氧化剂处理的情况下，在所有传代中增殖能力保持50％左右的高水平。并且，在抗氧化剂处理组中，增殖倍数(growth fold increase)在P11至P15中分别为3.8、2.9、2.5，直到P15增殖能力也保持高水平。
将确认了在作为端点(Endpoint)的P15中，高密度培养条件单独及高密度培养条件+抗氧化剂处理的两组之间的活性氧水平的结果在图11中示出。
如图11所示，通过处理作为抗氧化剂的抗坏血酸，增殖增加的条件中活性氧的水平也减少。因此，优选地，间充质干细胞培养在低细胞密度下进行，而不是高密度，当从高密度的细胞培养诱导的活性氧生产利用抗氧化剂来进行消除的情况下，可使间充质干细胞的增殖能力增加。即，因高密度条件的活性氧而抑制间充质干细胞的增殖能力，随着细胞密度降低而活性氧减少，因此间充质干细胞增殖能力可得以促进。
综上所述，为了保持通过层分离培养来获取的单克隆间充质干细胞的增殖、培养及干细胞功能，在培养条件中将细胞密度调节为1000细胞/cm2以下的密度为重要，在添加抗氧化剂来进行培养的情况下，抑制可从细胞培养诱发的氧化应激，从而可有效地促进间充质干细胞增殖。
实施例2：得以改善的层分离培养法的鉴定
通过上述实施例1，在以层分离培养法取得的间充质干细胞培养中，细胞密度的调节及抗氧化剂的添加可成为重要的因素，因此，通过韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的现有工序获取的单克隆间充质干细胞以不同的细胞培养密度且改变成添加有作为抗氧化剂的抗坏血酸的培养基，由此来比较了单菌落间充质干细胞的增殖能力及由此的细胞获取效果。此前，韩国专利申请10-2006-0075676号中，将作为单一性细胞组的多个菌落以每孔100至600的细胞数进行了移动，在此后的传代培养中，以每cm24000个的细胞进行了培养。
具体地，在本改善方法中，通过将传代1次(P1)的细胞数调节为每cm21000的方法，来诱导细胞的有效增殖，传代2次(P2)之后，在传代培养中，分注作为低密度的1000个以下的细胞，并将其与4000个细胞培养的效果进行了比较。并且，将细胞培养基以不同的两种包含有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基及未包含抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基来比较了由此带来的细胞增殖效果。
在下列表3中示出用于确认得以改善的层分离培养法的效果的实验组，在图12中示意性地示出工序改善部分。
表3
多个细胞系为由层分离培养方法分离的细胞系，分别以SCM01至SCM08命名。
2.1根据细胞系密度及培养基的增殖效果的确认
利用上述SCM01至08细胞系来进行培养，分别利用细胞数、群体倍增时间(Population Doubling Time)、群体倍增水平(Population Doubling Level)来比较根据直至传代5次(P5)的传代培养的细胞增殖效果，并在图13至图20中示出。
如图13至图20中所确认，在以每cm21000个的细胞密度接种并进行培养的所有实验组中呈现出比以每cm24000个的细胞密度接种并培养的实验组更优秀的细胞增殖效果。并且，尽管为相同的1000个细胞密度组，但在包含有作为抗氧化剂的抗坏血酸的α-伊格尔极限必需培养基中所培养的1000α(alpha)实验组中确认到了更为显著的细胞增殖效果。
2.2根据细胞系密度的增殖效果比较
为了进一步准确的根据培养细胞数的增殖率的比较，将培养基分别固定位LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基，并比较了根据1000个或4000个细胞接种密度的细胞增殖效果，并将其结果在图21至图24中示出。
如图21所示，当在LG达尔伯克改良伊格尔培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以1000个细胞数接种并培养时，确认到P5/P2增殖率显著高于4000个细胞接种组，与由传代5(P5)中所确认的4000个细胞接种相比，1000个细胞接种组的增殖率为最小3.08至最大48.50倍。并且，如图22所示，在所有细胞系中，群体倍增时间值也低于或接近4000个细胞接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与4000个细胞接种相比高。
并且如图23所示，当在α-伊格尔极限必需培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以1000个细胞数接种并培养时，呈现出与达尔伯克改良伊格尔培养基实验组相同的倾向，与传代5次中所确认的4000个细胞接种相比，1000个细胞接种组的增殖率为最小6.32至最大85.63倍。并且，如图24所示，在所有细胞系中，群体倍增时间值也低于或接近于4000个细胞接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与4000个细胞接种相比高。
这种结果为表示与每cm24000个的高密度细胞接种培养相比，可通过1000个以下的细胞接种来诱导快速单克隆间充质干细胞的增殖的结果。
2.3根据培养基的增殖效果比较
在上文中个，通过实施例2.2确认到了与4000细胞/cm2培养相比，1000细胞/cm2培养可呈现优秀的增殖效果，因此将细胞数固定为1000个，随着将培养基以变数进行改变来比较细胞增殖效果，从而额外地鉴定了根据培养基条件的增殖效果，并将其结果在图25及图26中示出。
如图25所示，将培养基改变为α-伊格尔极限必需培养基及达尔伯克改良伊格尔培养基来比较细胞增殖率的结果，与LG-达尔伯克改良伊格尔培养基相比，在利用α-伊格尔极限必需培养基的实验组中确认到了最小1.77至6.39的高细胞增殖率。并且如图26所示，群体倍增时间在所有α-伊格尔极限必需培养基实验组中较低，而群体倍增水平增加。
像这种实验结果表示，利用每cm21000个以下的细胞来调节细胞接种密度，除了以传代2(P2)至传代5次(P5)进行培养之外，在利用添加有抗氧化剂的培养基来培养的情况下，细胞增殖效率极大化。
实施例3：改善工序的建立
通过多个上述实施例确认到，就间充质干细胞培养而言，细胞密度的调节及抗氧化剂的添加成为重要的因素，除了韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的现有工序之外，建立了利用不同的细胞培养密度及培养基条件来有效地获取单菌落的间充质干细胞的得以改善的工序，综上所述，在下列表4(利用达尔伯克改良伊格尔培养基的培养条件)及表5(利用α-伊格尔极限必需培养基的培养条件)中示出。
表4
表5
更具体地，如下进行了本发明的来源于骨髓的间充质干细胞的层分离培养的工序及增殖培养。
利用局部麻醉剂麻醉骨髓提供人的臀部之后，向坐骨扎入注射针来提取了骨髓。100mm的培养容器中放入20％的胎牛血清、1％的包含青霉素/链霉素的14mL的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco`s modified Eagle`s Medium，美国吉布科(GIBCO-BRL)产品，美国生命技术公司(Life-technologies)，马里兰州(MD)，美国(USA))、1ml的人的骨髓，在37℃温度条件下，5％的CO2细胞培养仪中培养了2小时。培养之后，将培养容器稍微向一侧倾斜，以尽量使附着于底部的细胞不脱落方式仅将培养容器的上层培养液最大限度的移入新的容器。
再重复一次相同的过程之后，将所取得的培养液移入底部涂敷有胶原蛋白(collagen)的培养容器(Becton Dickinson)中之后，在37℃温度条件下培养了2小时。将培养液重新移入新的涂敷有胶原蛋白的容器中，24小时之后再移入新的容器中，24小时之后再移入新的容器中。最终，48小时之后用肉眼确认到了移入新的容器之后残留的细胞附着于培养容器底部的情况。可推测出能够经过前部分的多个层分离步骤直至该步骤的细胞为细胞的比重显著小于其他细胞的小细胞。当经过约10日至14日的时间时，多个细胞形成单菌落(single colony)，将该单克隆细胞组用胰蛋白酶进行处理并分离之后，以50～200细胞/cm2的细胞数移入6-孔培养容器中。在37℃温度条件下，5％的CO2细胞培养仪中培养了4日至5日之后，成长了约80％时，将多个细胞用0.25％的胰蛋白酶/1mM的乙二胺四乙酸(EDTA，美国吉布科(GIB CO-BRL)公司产品)进行处理之后，移入75cm2的培养容器并进行了传代培养。
像这样，当将初始传代2至传代5中的细胞密度降低为1000细胞/cm2水平来进行培养时，尽管其他工序也以相同的方式进行了调节，但间充质干细胞的增殖能力及干细胞特性优秀地保持，从而在相同的传代中也有效地诱导增殖。尤其，当像这样降低细胞密度来进行培养时，可省略曾在现有工序中所需的在间充质干细胞中制备工作细胞库(WCB，WorkingCell Bank)的过程，并且可有效地缩短细胞制备期间。尤其，减少传代，可取得大量的未完成老化的细胞，并且当将这种细胞用作治疗剂时，有待其治疗效果优秀。
并且，当利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基来作为培养基时，由高密度的细胞培养所诱导的氧化应激因抗氧化剂处理而得以有效改善，并且可恢复间充质干细胞的细胞增殖能力，因此与现有的工序相比，显著缩短细胞的传代，可快速稳定地取得保持间充质干细胞的特性的且未进行老化的新鲜状态的单菌落间充质干细胞。
综上所述可知，低密度细胞培养可短时间内取得大量细胞，因此可简化制备工序，不仅如此，在长期培养(long-term culture)当中也可取得完整保持着间充质干细胞的特性的且未进行老化的状态的细胞，因此可实现优质的干细胞生产。因此，有待于在用于开发细胞治疗剂的大规模生产(large-scale production)的技术开发方面上的高利用率。

Claims (11)

1.一种干细胞的层分离培养及增殖方法，所述方法包括：
步骤1)，培养骨髓；
步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的器皿并进行培养；
步骤3)，仅分离出上述步骤2)的上清液，在37℃下将上清液在培养容器中培养1小时至3小时；然后，在37℃下将上清液的培养重复2次至3次，每次12小时至36小时；接着，在37℃下将上清液培养24小时至72小时，其中，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；
步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将所述单克隆干细胞接种于培养基中并对所述细胞进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养为传代1次至传代5次的培养。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm2的细胞密度将所述单克隆干细胞接种于培养基中来进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养基添加有抗氧化剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上述抗氧化剂以10μg/ml至30μg/ml的浓度进行添加。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在传代1次时，上述步骤5)的培养通过将所述单克隆干细胞以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中来进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在传代2次至传代5次时，上述步骤5)的培养通过将所述单克隆干细胞以700细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中来进行。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养基添加有庆大霉素。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过上述方法获取的干细胞为5次传代至10次传代的干细胞。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过上述方法获取的干细胞具有骨细胞分化能力。
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