CN100554413C - 单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 - Google Patents
单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100554413C CN100554413C CNB2006100507609A CN200610050760A CN100554413C CN 100554413 C CN100554413 C CN 100554413C CN B2006100507609 A CNB2006100507609 A CN B2006100507609A CN 200610050760 A CN200610050760 A CN 200610050760A CN 100554413 C CN100554413 C CN 100554413C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- zub1
- sorting
- mesenchymal stem
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 104
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 6
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 6
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 5
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 34
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 21
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 3
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 3
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011892 Von Kossa's method Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 2
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002548 cytokinetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种单抗ZUB1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法，是从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，用单克隆抗体ZUB1为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUB1抗原阳性的人骨髓间充质干细胞。本发明方法获得的人骨髓间充质干细胞具有较好的生长活性及增殖潜能，且细胞传代过程中ZUB1抗原稳定表达，并可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。本发明提供的是一种较理想的人骨髓间充质干细胞分选纯化的方法，提高了原代间充质干细胞的纯度及分离培养的效率，有助于间充质干细胞生物学特性的研究及在临床检测和应用中的推广。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种人骨髓间充质干细胞原代细胞的分离纯化及体外培养的新方法，该方法应用一种新制备的抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体ZUB1，通过免疫分选的方法有效地从人骨髓单个核细胞中分离纯化间充质干细胞，并在体外培养扩增、诱导多向分化。
背景技术
人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，是组织工程和再生医学理想的种子细胞。在国内外有大量骨髓MSCs基础及临床研究的报道，其在干细胞治疗的临床应用中有广阔的前景。
正常人骨髓中MSCs的含量很低，约104～105个单个核细胞中含有一个MSCs，为得到足够数量MSCs应用于基础及临床研究，需要有效地分离、纯化、体外培养扩增MSCs。目前常用的从骨髓中分离MSCs的方案主要有三种：①根据骨髓MSCs的底物黏附特性来实现分离的贴壁筛选法；②根据MSCs与其他细胞的密度不同来分离的密度梯度离心法；③根据细胞表面的一些特殊标记，用各种单克隆抗体进行免疫分选，如正向免疫分选、负向免疫分选、以及联合分选。通过传统的贴壁培养的方法获得的人骨髓MSCs原代细胞耗时长、细胞的异质性大，这使MSCs的基础研究及临床应用的推广受到限制。以细胞特异性表面分子为标记通过免疫分选的方法，可有效地富集骨髓中含量极少的MSCs，提高原代培养所得MSCs纯度。
以往人骨髓MSCs公认的表型特征：不表达造血细胞的表面抗原，CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A(GlycophorinA )、T或B淋巴细胞的表面标志均为阴性；相对特异的表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。正向免疫分选的免疫标记多为SH2、STRO-1、低亲和力神经生长因子受体(low-affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)：SH2是以人骨髓MSCs免疫小鼠获得的单克隆抗体，研究证实SH2识别CD105分子，同时CD105也表达于骨髓单核细胞、有核红细胞、部分淋巴细胞；STRO-1是以骨髓CD34+细胞免疫小鼠获得的人骨髓基质细胞新的单克隆抗体，但是通过STRO-1分选的骨髓细胞中含有大量的有核红细胞和一小部分B淋巴细胞；LNGFR表达于大部分骨髓基质细胞，但LNGFR并非骨髓MSCs特异性标记，其表达于人体多种器官的血管外膜，在骨髓单个核细胞中LNGFR+细胞约为2.3％。骨髓单个核细胞中MSCs含量极低，通过负向免疫分选可以有效地提高分选后细胞中MSCs的含量，有研究者以CD45和Glycophorin A为标记筛选获得的CD45-Glycophorin A-细胞群成份复杂，仍需进一步纯化。因此，上述免疫标记均难以成为直接分选人骨髓MSCs的理想标记。
迄今为止，国内外研究者一直通过多个表面分子联合标记，并结合细胞的自我更新和多向分化潜能的特性来鉴定人骨髓MSCs，MSCs单一的特异性表面分子仍在探寻中，这给MSCs的分离、纯化的实际应用带来了一定的困难。深入研究人骨髓MSCs的表型特征，将有助于有效地分离纯化人骨髓MSCs并进一步培养扩增，以促进其在干细胞治疗领域的临床应用。采用杂交瘤技术研究制备的新的抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUB1，通过免疫细胞化学及免疫荧光染色检测证实ZUB1与人骨髓MSCs结合的阳性率均大于99％，传代培养的MSCs稳定表达ZUB1抗原；ZUB1与人骨髓来源的细胞系无交叉反应；除骨髓组织外，ZUB1与人间充质组织和非间充质组织均无交叉反应。ZUB1是针对人骨髓MSCs的新的特异性单克隆抗体，与人骨髓MSCs反应具有高度的特异性和敏感性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种人骨髓MSCs原代细胞的分离纯化及体外培养的新方法，ZUB1抗原稳定表达于人骨髓MSCs原代细胞及体外传代培养的早期、晚期MSCs，是人骨髓MSCs一种新的理想的标记。本发明通过以下技术方案实现：人骨髓MSCs原代细胞的分离纯化，即从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，用专利申请号为200510061034.2所公开的单克隆抗体ZUB1为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs，ZUB1抗原阳性的细胞在体外培养体系中贴壁生长、呈梭形，培养5天左右细胞开始明显扩增，扩增传代后细胞表型检测显示：CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)阳性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达均为阴性，是均一的人骨髓MSCs。
所述方法中，采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度离心分离获得骨髓单个核细胞，用专利申请号为200510061034.2所公开的单克隆抗体ZUB1，抗体亚型为IgG1，与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离获得ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs，分别将ZUB1抗原阳性细胞和ZUB1抗原阴性细胞接种于培养皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
所述方法中，ZUB1抗原阳性细胞和阴性细胞，经培养3天后接种阳性细胞的培养皿中开始出现梭形贴壁细胞，仅见少量的悬浮细胞，5天后细胞扩增明显，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养19～22天贴壁细胞80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的ZUB1抗原阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养21天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则。
本发明方法获得的人骨髓MSCs具有较好的生长活性及增殖潜能，且细胞传代过程中ZUB1抗原稳定表达，并可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。
本发明的有益效果在于：
(1)以单一的抗人骨髓MSCs特异性单克隆抗体ZUB1为标记，通过正向免疫分选可以直接、快速地从人骨髓单个核细胞中分离纯化原代MSCs，缩短了原代细胞培养的时间，提高了人骨髓MSCs的分离培养的效率，有效地改善了采用传统的贴壁筛选法培养原代MSCs耗时长、细胞异质性大的缺陷，并保持原代MSCs的生物学特性，为研究和应用骨髓原代MSCs提供了一个有效的方法。
(2)MSCs在骨髓中的含量极低，以ZUB1为标记通过正向免疫分选可以获得纯度较高的原代MSCs，且具有较高的增殖和多向分化潜能，可在体外传代扩增，并可定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞，有助于人骨髓MSCs在组织工程、再生医学中的推广应用。
(3)ZUB1是一种新研制开发的抗人骨髓MSCs单克隆抗体，以单一的ZUB1为标记通过正向免疫分选可以获得表型均一的MSCs，单克隆抗体ZUB1相应的膜表面抗原在人骨髓MSCs体外培养传代扩增过程中稳定表达，为研究该表面分子在MSCs增殖及分化过程中的生物学意义并进一步完善对MSCs特性的认识提供了平台。
附图说明：
图1是以抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞和阴性细胞的原代培养。
图2是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养扩增第一代和第五代的生长曲线。
图3是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR及ZUB1抗原表达的流式细胞术分析图。
图4是诱导成骨分化后Von Kossa法染色图。
图5是诱导脂肪分化后油红O染色图。
图6是向神经元样细胞定向诱导分化后免疫细胞化学染色图。
具体实施方式：
本发明结合实施例和附图作进一步说明。
实施例1
单克隆抗体ZUB1免疫磁珠法分选原代人骨髓MSCs
采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度离心分离获得骨髓单个核细胞，用专利申请号为200510061034.2所公开的单克隆抗体ZUB1(抗体亚型为IgG1)与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗(Miltenyi Biotec Inc.)孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离获得ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs，分别将ZUB1抗原阳性细胞和ZUB1抗原阴性细胞接种于培养皿，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
培养3天后接种阳性细胞的培养皿中开始出现梭形贴壁细胞，仅见少量的悬浮细胞，5天后细胞扩增明显，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养21天左右贴壁细胞约80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养21天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则，参见图1，其中A、B、C分别为阳性细胞培养5天、14天、21天的形态学特征(×100)，D、E、F分别为阴性细胞养5天、14天、21天的形态学特征(×100)。
通过单克隆抗体ZUB1标记的正向免疫分选可以直接地从人骨髓单个核细胞中分离纯化原代MSCs，有效地改善了采用传统的贴壁筛选法培养原代MSCs耗时长、细胞异质性大的缺陷，同时为研究和应用原代MSCs提供了一个有效的方法。
实施例2
以ZUB1为标记通过正向免疫分选获得的阳性细胞增殖能力分析
取体外培养传代的ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs第一代和第五代细胞，按2×104个细胞/孔的密度接种于24孔培养板内，分别培养1、2、3、4、5、6、7、8天，进行细胞动力学分析。培养具有以下共性特征：细胞经传代培养后，10小时左右细胞完全贴壁，细胞形态重新变成梭形细胞；传代培养潜伏期约为24～36小时；传代培养对数增殖期约为4～5天；对数增殖期结束后进入平台期；第五代与第一代细胞的生长没有显著差异，参见图2。以ZUB1为标记通过正向免疫分选获得的阳性细胞具有很好的增殖活性，在体外培养传至第十代仍保持梭形的细胞形态。
实施例3
以ZUB1为标记通过正向免疫分选获得的阳性细胞表型特征
取体外培养传代的ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs第一代和第五代细胞，以CD14-FITC、CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC单克隆抗体为探针，用流式细胞仪分析MSCs表面分子的表达。结果显示：CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)阳性标记出现单峰，造血细胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达均为阴性，参见图3，图3是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养扩增至第五代的免疫表型分析。用ZUB1正向免疫分选后阳性细胞表型特征为人骨髓MSCs的表型特征，经体外培养、传代扩增后第一代和第五代MSCs表面标记表达无明显差异，参见表1，表明用ZUB1正向免疫分选后阳性细胞为MSCs，是一均质的细胞群。
表1单克隆抗体ZUB1免疫磁珠法分选获得人骨髓间充质干细胞的免疫表型(％)
实施例4
以ZUB1为标记通过正向免疫分选获得的阳性细胞多向分化潜能
体外培养传代的ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs接近70％融合时，更换培养液，加入成骨诱导培养液(Stem Cell Technologies Inc.)、脂肪诱导培养液(Stem Cell Technologies Inc.)、神经分化预诱导液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
经成骨诱导培养6天左右，约50％细胞形态发生变化，由原来的纺锤型变为立方型或多角型，9天后出现钙化斑点，随着诱导时间的延长，立方型或多角型细胞以及钙化斑明显增加，约12～21天细胞形成广泛均一的矿化结节样结构。培养21天后，Von Kossa法染色，可以见到染成棕黑色的细胞外基质钙盐沉积，结果参见图4，是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向成骨定向诱导分化，图为诱导成骨分化后Von Kossa法染色(×100)。
经成脂肪诱导培养1周后，细胞形态开始变成圆形或多角性，细胞排列无序，可观察到胞浆中出现高折光性的小脂滴，随着诱导时间的延长逐渐聚集成大的脂滴。培养21天后，油红O染色，脂滴为橙红色，结果参见图5，是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向脂肪定向诱导分化后油红O染色(×100)。
经神经分化预诱导24小时后细胞形态未见明显变化，更换含5mM硫代甘油的无血清LG-DMEM，在诱导后3～5小时中，大多数梭形细胞变为典型的神经元样细胞，简单的双级细胞和复杂的多级细胞均有出现，多个神经元样细胞突起可相互延伸并形成网状。免疫组化染色分析，神经元样细胞的胞体及部分突起神经干细胞标志物Nestin、神经元标志物NSE、神经元标志物NF-M表达阳性、星形胶质细胞标志物GFAP表达阴性，结果参见图6，是以ZUB1为标记的正向免疫分选后获得的阳性细胞体外培养，向神经元样细胞定向诱导分化，其中A、B、C、D分别为诱导神经分化后用免疫细胞化学染色法检测神经干细胞标志物Nestin、神经元标志物NSE、神经元标志物NF-M、星形胶质细胞标志物GFAP的表达(×100)。
综上，以单一的抗人骨髓MSCs特异性单克隆抗体ZUB1为标记，通过正向免疫分选获得的ZUB1抗原阳性的人骨髓MSCs可在体外定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元样细胞。
Claims (3)
1.单抗ZUB1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：(1)从骨髓悬液中分离得到单个核细胞，(2)用保藏号为CCTCC No.C200510的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体ZUB1为标记，通过间接免疫磁珠分选系统正向分选获得ZUB1抗原阳性的人骨髓间充质干细胞，(3)将(2)步所得的ZUB1抗原阳性的细胞在体外培养体系中贴壁生长、呈梭形，培养5天左右细胞开始明显扩增，扩增传代后细胞表型检测显示：CD29、CD44、CD166、CD105阳性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达均为阴性，是均一的人骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)是用保藏号为CCTCC No.C200510的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体ZUB1，抗体亚型为IgG1，与骨髓单个核细胞孵育，离心洗涤后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离ZUB1抗原阳性的人骨髓间充质干细胞，分别将ZUB1抗原阳性细胞和ZUB1抗原阴性细胞接种于培养皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱培养，之后每隔3天换液1次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)分选获得的ZUB1抗原阳性细胞培养3天后，培养皿中细胞贴壁呈梭形，开始明显扩增，梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布，培养19～22天贴壁细胞80％～90％融合，细胞形态均一，与成纤维细胞形态相似，排列成漩涡状、网状、辐射状；分选获得的ZUB1抗原阴性细胞，培养3天后见大量的圆形悬浮细胞，其中有极少量细胞贴壁呈梭形细胞，培养21天后仍见圆形细胞，少量贴壁的细胞较宽大，形态不均一，排列无规则。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100507609A CN100554413C (zh) | 2006-05-12 | 2006-05-12 | 单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006100507609A CN100554413C (zh) | 2006-05-12 | 2006-05-12 | 单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1865437A CN1865437A (zh) | 2006-11-22 |
| CN100554413C true CN100554413C (zh) | 2009-10-28 |
Family
ID=37424584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2006100507609A Expired - Fee Related CN100554413C (zh) | 2006-05-12 | 2006-05-12 | 单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100554413C (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609457A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-12 | 陕西师范大学 | 小鼠脑中神经细胞的提取分离方法 |
-
2006
- 2006-05-12 CN CNB2006100507609A patent/CN100554413C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| New Monoclonal Antibodies reactive with HumanBoneMarrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Xiaoyu Lai等.Blood(ASH Annual Meeting Abstracts),Vol.106 . 2005 |
| New Monoclonal Antibodies reactive with HumanBoneMarrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Xiaoyu Lai等.Blood(ASH Annual Meeting Abstracts),Vol.106 . 2005 * |
| 人骨髓间充质干细胞的鉴定：抗SH2和SH3单克隆抗体的制备与应用. 刘培光等.中国实验血液学杂志，第13卷第4期. 2005 |
| 人骨髓间充质干细胞的鉴定：抗SH2和SH3单克隆抗体的制备与应用. 刘培光等.中国实验血液学杂志，第13卷第4期. 2005 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1865437A (zh) | 2006-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Seshi et al. | Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages | |
| Mabuchi et al. | LNGFR+ THY-1+ VCAM-1hi+ cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells | |
| CN101270349A (zh) | 胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法 | |
| CN102191217A (zh) | 一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法 | |
| CN106282108A (zh) | 一种具有免疫调节功能的脾脏间充质干细胞及其制备方法与应用 | |
| CN1778905B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| Loubière et al. | Impact of the type of microcarrier and agitation modes on the expansion performances of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord | |
| CN109988746A (zh) | 一种间充质干细胞成脂诱导分化方法 | |
| CN101531996B (zh) | 源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法 | |
| CN107287156A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| CN102399745A (zh) | 一种软骨干细胞分离培养方法 | |
| CN103013912A (zh) | 密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| Park et al. | Stem cell enrichment approaches | |
| Esposito et al. | Culture conditions allow selection of different mesenchymal progenitors from adult mouse bone marrow | |
| CN100554413C (zh) | 单抗zub1免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN100554415C (zh) | 单抗zub4免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| Boiret et al. | CD34+ CDw90 (Thy-1)+ subset colocated with mesenchymal progenitors in human normal bone marrow hematon units is enriched in colony-forming unit megakaryocytes and long-term culture-initiating cells | |
| CN1920010A (zh) | 一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法 | |
| CN100562569C (zh) | 单抗zuf10免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN100554414C (zh) | 单抗zuc3免疫磁珠分选原代人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN100554412C (zh) | 单抗zue12免疫磁珠分选人骨髓间充质干细胞的方法 | |
| CN101486992B (zh) | 抑制破骨细胞生成的间充质干细胞及其制备方法与应用 | |
| CN101451123A (zh) | 一种诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方法 | |
| CN100398560C (zh) | 抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体zue12及应用 | |
| Mahboudi et al. | Comparison between high cell-density culture systems for chondrogenic differentiation and articular cartilage reconstruction of human mesenchymal stem cells: a literature review |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20091028 Termination date: 20160512 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |