CN109609457A

CN109609457A - 小鼠脑中神经细胞的提取分离方法

Info

Publication number: CN109609457A
Application number: CN201811580964.2A
Authority: CN
Inventors: 张媛; 冶泽青; 李星; 杨婷
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-04-12

Abstract

本发明公开了一种小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，将离体小鼠脑部用酒精消毒后置于预冷无菌平衡盐溶液D‑hanks中；用手术刀将脑切碎，用0.15％(m/v)的木瓜蛋白酶液消化后，用含脱氧核糖核酸酶I的D‑hanks缓冲盐溶液吹打细胞后，过100μm滤网；然后用细胞分离液percoll差速离心去除髓鞘蛋白，得到单细胞悬液；用红细胞裂解液去除其中血红细胞；利用美天旎miltenyi的磁珠beads纯化得到各种类型的神经细胞。

Description

小鼠脑中神经细胞的提取分离方法

技术领域

本发明属于细胞生物领域，具体涉及一种小鼠脑中神经细胞的提取分离方法。

背景技术

中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的神经元和神经胶质起源于神经干细胞(neural stemcells,NSCs)。了解NSCs的神经/胶质细胞生成机制是理解复杂大脑结构和功能发展的基础。NSCs不仅存在于发育中的大脑中，而且存在于成人的成熟脑中。成人神经发生可能为成熟大脑提供显著的可塑性。最近精神障碍基础研究的进展表明，特别是大脑区域的神经/胶质细胞生成受损的病因学联系。

此外，来自NSCs的神经元和神经胶质可用于治疗退行性疾病和CNS创伤的发现引起了神经科学家和临床医生对干细胞生物学的广泛兴趣。胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)的最新进展为这些治疗方法提供了可能。此外，人们对神经/神经胶质细胞受损与精神疾病(包括情绪障碍和慢性压力综合征)之间的相关性以及最近在这些疾病状态的基础研究方面取得的进展表现出了进一步的兴趣。因此，更深入地了解神经干细胞和神经/神经胶质细胞的性质对于神经科学的各个方面包括脑结构和功能的发育，重塑和恢复至关重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种效率高、存活率高和纯度高的小鼠脑中神经细胞的提取分离方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将离体小鼠脑部用酒精消毒后置于预冷无菌平衡盐溶液D-hanks中；

(b)用手术刀将脑切碎，用0.15％(m/v)的木瓜蛋白酶液消化后，用含脱氧核糖核酸酶I的D-hanks缓冲盐溶液吹打细胞后，过100μm滤网；

(c)用细胞分离液percoll差速离心去除髓鞘蛋白，得到单细胞悬液；

(d)用红细胞裂解液去除其中血红细胞；

(e)利用美天旎miltenyi的磁珠beads纯化得到各种类型的神经细胞。

根据本发明，所述的小鼠为各个年龄段的小鼠，雌雄不限。

优选的，步骤(b)中所述木瓜蛋白酶消化酶液为预先在37℃预热5分钟，其浓度为0.15％(m/v)，消化时间为10-15分钟。

进一步优选的：

步骤(b)中所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为1-3％(m/v)，吹打时间为5-10分钟。

步骤(c)中所述细胞分离液percoll的密度为70％和30％两种，其中，30％密度的细胞分离液percoll配方为含有浓度为30％含酚红的D-Hanks，且在差速离心时，升降速要求为1。

步骤(c)中所述的差速离心条件为2000rpm，时间20分钟，且在差速离心时，升降速要求为1。

步骤(d)中所述红细胞裂解液(Red Blood Cell,RBC)的体积为2ml/脑，裂解时间为1分钟。

本发明的小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，缓冲盐溶液选择不含钙镁离子、且含酚红的D-hanks，一方面是防止消化酶与金属离子螯合从而影响消化效果，为了更好的消化组织，消化酶要提前在37℃的水浴锅中预热。另一方面，在去除髓鞘蛋白所用的差速离心，可以更好的判断脑中神经细胞所在位置；此外，所选的Dnasel的作用为终止消化。

附图说明

图1为换瓶传代后，加脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)实验组与对照组的小胶质细胞分别培养18h后收上清，做酶联免疫吸附法检测的结果对比图。

图2为换瓶传代后，增殖的少突胶质细胞前体细胞在倒置相差显微镜下的细胞形态与特征；

图3为换瓶传代后，分化的少突胶质细胞在倒置相差显微镜下的细胞形态与特征；

图4为侧脑室注射OPC(实验组)与未处理组的sheiver小鼠颤抖频率的统计对比图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

为了达到能更好的对神经元细胞进行研究的目的，申请人制定了小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，该方法从小鼠脑中分离足够的神经细胞，以便在体外进行生物学和药理学测定，以期增强小鼠脑组织的利用程度，降低神经细胞提取成本。

在目前的工作中，申请人已经将该方法应用于各个年龄段的小鼠大脑，且雌雄不限，以获得小鼠的大脑皮层功能性的OPCs，并且它们能够在体外分化成少突胶质细胞。已成功应用于本实验室的相关实验中。

本实施例给出一种小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，包括以下步骤：

1、将离体的小鼠脑部酒精消毒置于预冷无菌D-Hanks平衡盐溶液中；

2、组织消化至单细胞：

倒掉平衡盐溶液D-Hanks，将组织倒入无菌培养皿中，将脑用刀片划碎(每个脑切50下为准)，转移到离心管中，300xg离心2min，轻倒去上清。

在管中加入用平衡盐溶液D-Hanks配的0.15％(m/v)木瓜蛋白酶，37℃摇床，15min，70rpm。再将1-3％(m/v)的DnaseI(脱氧核糖核酸酶I)加入管中，上下颠倒混匀，置于37℃摇床，以70rpm速度摇15min。

而后过100微米滤网，用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)冲洗滤网，离心300xg，10min，同时配制percoll。

3、Percoll去除髓鞘蛋白：

Percoll工作液配制：percoll原液：10×PBS＝1：9。

30％percoll配制：percoll：1×PBS：D-Hanks＝3：3：4；

70％percoll配制：percoll：1×PBS＝7：3。配好的percoll放于冰上。

吸去上清，余下一点用枪吹，先加一半体积的70％percoll，然后滴加另一半体积的30％percoll，2000rpm，离心20min，注意离心机升速和降速为1。

吸去液面上漂浮的髓鞘蛋白，然后将滴管插入两液面中间吸液体，绕圈吸10次(约30mL)，转移到离心管中，300xg离心10min，得到单核细胞细胞沉淀。

4、红细胞裂解液去除血红细胞：

加入2mL1×RBC/每个脑(配好的红细胞裂解液用前先冰浴)，1min后，加入10mLPBS/每个脑。

准备新的50mL离心管和100μm滤网，倾斜离心管，将上步30ml液体过滤到到新的离心管中,计数，1500rpm离心5min；

将离心后的上清弃去，利用miltenyi的磁珠beads纯化得到各种类型的神经细胞；

接下来用含10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的培养基培养神经细胞。

以下是发明人给出的实施例。

实施例1：

1、实验方法

CD11b+beads得到microglia，体外进行小胶质细胞激活炎症反应的测试

将离体的小鼠脑部酒精消毒置于置于预冷无菌D-Hanks平衡盐溶液(Hyclone，SH30031.02)中；

倒掉D-Hanks，将组织倒入无菌皿中，将皿倾斜，使组织聚集在一边，将脑用刀划碎(每个脑切50下为准)，转移到50mL离心管中，300xg离心2min，轻倒去上清。

在管中加入2ml/脑的0.15％(m/v)木瓜蛋白酶papain(solarbio，9001734)，37℃摇床，15min，70rpm：

再将100微升/脑的1-3％(m/v)DnaseⅠ(Solarbio，D8070)加入管中，上下颠倒混匀，用一毫升枪头吹打数次，37℃摇床，15min，70rpm，再吹打数次，37℃摇床，10min，70rpm。过100微米滤网(Fisher)，用PBS冲洗滤网，加PBS到一定体积，离心300xg，10min，同时配制percoll(GE healthcare)(以下以三只脑为例)。

Percoll工作液配制：45mLpercoll原液+5mL10×PBS。

30％percoll配制：15mL percoll+15mL 1×PBS+20mLD-Hanks；

70％percoll配制：35mL percoll+15mL1×PBS。配好的percoll放于冰上。

吸去上清，残余液体用枪轻柔吹匀，先加25mL的70％percoll(以三只脑为例)，然后滴加30％percoll到50mL，2000rpm，20min，注意离心机升速和降速为1。

用滴管吸去液面的髓鞘蛋白，然后将滴管插入两液面中间吸液体，绕圈吸10次(约20mL)，转移到50mL离心管中，直接计数，300xg，10min，得到单核细胞沉淀。

加入2mL 1×RBC/每个脑(配好的红细胞裂解液用前先室温放置片刻)，1min后，加入10mL PBS/每个脑。

将离心后的上清弃去，利用miltenyi的CD11b(Microglia，130105634)MicroBeads，分选出小胶质细胞，接下来用含10％FBS1％L-谷氨酰胺1％青霉素/链霉素的培养基培养。

按每孔1×10⁶个细胞/1mL的密度在24孔板中种细胞，设置未处理对照组(不加LPS)与LPS组,实验组每孔用含50ng/mlLPS的培养基激活小胶质细胞。18小时后收细胞上清，做酶联免疫吸附法检测不同组细胞分泌因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-23、IL-12和IL-10的量。

2、实验结果

如图1所示，与未处理组组相比，LPS处理组，IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-23和IL-10的释放量显著提高，这与小胶质细胞受到刺激会分泌促炎因子的特性一致，表明用该方法得到的神经细胞状态良好，符合实验要求。

实施例2：

A2B5+beads得到OPC，体外进行OPC分化的测试

1、实验方法

如实施例1中处理小鼠脑组织，得到单细胞悬液，根据ANTI-A2B5磁珠分选试剂盒(130093388,Miltenyi Biotec)说明，得到少突胶质细胞前体细胞OPC，用增殖培养基培养。

在细胞生长到一定密度时，消化细胞，换分化培养基培养细胞。观察细胞分化状态。

2、实验结果

结果如附图2、3所示。所分离培养的OPC的增殖情况良好，成球明显。且在分化培养基中细胞分支增多，具有典型的少突胶质细胞形态，可用作后续的实验。

实施例3：

A2B5+beads得到OPC，侧脑室注射颤动shiverer小鼠，观察髓鞘修复的现象

1、实验方法

如实施例3中所述，得到OPC细胞后按照1x10⁶/皿，用OPC增殖培养基进行扩增。收集细胞，对2周龄shiverer小鼠进行侧脑室注射2.0×10⁵个细胞，四周后观察对照PBS组及OPC治疗组小鼠的颤抖情况，统计结果。

2、实验结果

如图4所示，侧脑室注射OPC的小鼠(实验组)与未处理组的sheiver小鼠(对照组)颤抖频率相比，在相同时间内颤动次数显著下降，说明提取的少突胶质细胞有明显促进shiverer小鼠的髓鞘修复的作用。

Claims

1.一种小鼠脑中神经细胞的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(d)用红细胞裂解液去除其中血红细胞；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小鼠为各个年龄段的小鼠，雌雄不限。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述木瓜蛋白酶消化酶液为预先在37℃预热5分钟，其浓度为0.15％(m/v)，消化时间为10-15分钟。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为1-3％(m/v)，吹打时间为5-10分钟。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述细胞分离液percoll的密度为70％和30％两种，其中，30％密度的细胞分离液percoll配方为含有浓度为30％含酚红的D-hanks，且在差速离心时，升降速要求为1。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的差速离心条件为2000rpm，时间20分钟，且在差速离心时，升降速要求为1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中所述红细胞裂解液的体积为2ml/脑，裂解时间为1分钟。