CN1699557A - 一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，与以往的方法相比，本法操作更为简便，同时由于采用了部分换液的方法，从而使培养细胞所需时间缩短，分离得到的间充质干细胞纯度较高，增殖较快。本发明方法所得细胞形态均一，呈长梭形，传代后，在8代以内的细胞贴壁能力较强，生长速度较快。间充质干细胞来源有限，本方明方法为间充质干细胞的研究和应用提供了丰富的材料来源。

Description

一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞的分离和培养，属生物技术领域。

背景技术

干细胞(stem cells)是指具有自我更新及多向分化潜能的原始细胞。在造血组织中存在两种不同的干细胞，即造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(Mesenchymalstem cells，MSCs)。MSCs能为造血干细胞定居、增殖和分化提供有利的微环境。70年代Friedenstein等首次成功地分离培养出MSCs，并发现MSCs具有多向分化潜能。MSCs存在于人类、鸟类、啮齿类等生物的骨髓中，最近也有人从肌肉、骨组织中获得。目前的研究已得知：在一定的诱导条件下，MSCs可分化形成多种组织，如软骨、骨和肌腱等；将MSCs注入脑，它还可分化为神经细胞。此外，MSCs易于被外源性基因转染且稳定表达。因此，MSCs被认为是组织工程及基因治疗较为理想的靶细胞。

间充质干细胞分化的组织类型广泛，在理论上它能分化为所有的间质组织类型。因此若将它分化为骨、软骨或肌肉、肌腱，则在治疗创伤性疾病中具有极大应用价值；若将它分化为真皮组织，则在烧伤中有不可限量的应用前景。

虽然间充质干细胞有着如此独特的性能和广泛的用途，但因其来源有限，大大限制了其在组织工程方面及基因治疗方面的广泛应用。

从骨髓中分离MSCs的方法主要有下列几种：

①贴壁筛选法：利用MSCs贴壁的特性将其分离。

②密度梯度离心法：用Ficoll法或Percoll法能有效的将MSCs与其他不同密度的细胞分离，是现在广泛采用的用于分离纯化MSCs的方法，其中用Percoll方法分离与培养出的MSCs大小均匀，纯度较高。

③流式细胞分选法或免疫磁珠法：根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离MSCs，该方法分选的细胞纯度高，但对细胞的损伤较大，分选后细胞活力较低。

发明内容

本发明成功建立了一种骨髓间充质干细胞的分离及其培养方法，与上述方法相比本发明方法具有以下突出优点和特点：

1)与密度梯度离心法相比，本法所获得的MSCs纯度高，活力较强。

2)与一般贴壁法相比，本法培养细胞所需时间短，原代细胞培养7天后细胞即可生长至对数生长期。

3)对分离的细胞无损伤。

本发明骨髓间充质干细胞的分离方法属于细胞贴壁法，与以往不同的是，本发明方法在原代细胞培养48小时后进行换液时，采用部分换液的方法，即弃去原培养基的一半再加入新鲜的混合培养液，在去除未贴壁的细胞的同时又保留了存在于原代培养液中的造血干细胞，利用造血干细胞的旁分泌作用，使传代培养的间充质干细胞生长的形态均一，增殖良好。本发明方法与以往的贴壁法相比，操作更简单，培养细胞所需时间短，分离得到的间充质干细胞贴壁更快，成长状况更良好。

通过本发明方法获得的细胞能够在体外长期生长和短期内稳定传代，并具有典型的短梭状形态，生长速度快、活力较强，特别适合用作组织工程原料或基因治疗原料，同时也为干细胞的研究提供了丰富的、新的实验材料。

本发明骨髓间充质干细胞的分离及培养方法包括：

1)原代培养：

a)取经水囊法引产后死亡的四个月胎儿股骨组织，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心7-8分钟；离心后弃上清，用混和培养液I吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液I按细胞培养密度1～1.5×10⁶个细胞/瓶接种于细胞培养瓶中，并用混合培养液I补足至培养液总量为8-10ml，培养两天；

b)弃去培养液的一半，再加入4～5ml新鲜的混和培养液I，置于二氧化碳孵箱继续培养使细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，

2)传代培养：

待细胞生长至对数生长期后，移去原代培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞2～3次，然后向培养瓶中加入1～2ml 0.125％(质量体积百分比)的胰蛋白酶酶溶液(含0.1％EDTA)，在二氧化碳孵箱中放置2～3分钟，观察，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培养液II，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心7～8分钟，弃上清，加入8～10ml混和培养液II，计数；将含有细胞的混和培养液II按接种密度1～1.5×10⁶个细胞/瓶接种于新培养瓶中，并用混合培养液II补足至培养液总量为8～10ml，培养至细胞生长良好，形态均一，即完成传代培养。

所述混合培养液I的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，15％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。

所述混合培养液II的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，10％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。

本发明方法在细胞培养条件方面没有特殊要求，按常规保证细胞生长所需条件即能保证细胞生长良好，形态逐渐均一。

本方法最终获得的细胞形态细长，细胞颜色致密，聚簇生长。发明人将这种源于人胎儿骨髓间充质干细胞、通过本发明方法分离、培养最终获得的间充质干细胞命名为BMMS-03细胞。

本发明方法获得的BMMS-03细胞的生物学特征是：

1)能够在体外长期生长和短期内稳定传代；

2)具有典型的短梭状形态，生长旺盛；

附图说明

图1 BMMS-03细胞形态学观察图

BMMS-03细胞形态学观察：细胞伸出突起，呈短梭状，并开始分裂增殖(图1A)。4天后，贴壁分裂增殖的细胞形成大小不同、分散的细胞集落，细胞内可见有1～2个细胞核，核居中，核中有1～2个核仁(图1B)。7天后，细胞生长汇合达90％以上，呈旋涡状或平行状排列(图1C)。图中A.培养后第2天；B.培养后第4天；C.培养后第7天。(图示为100倍镜下观察的细胞形态)

图2流式细胞仪对BMMS-03细胞检测结果图。

A.CD105阳性率为97.2％；    B.CD106阳性率为66.0％；

C.CD34阳性率为9.2％；      D.阴性对照组阳性率为0.5％.

具体实施方式

下面通过实施例来说明本发明方法，但并不限制本发明。

实施例中所述引产胎儿股骨组织由天津医科大学第二附属医院妇产科提供。

实施例中所使用混合培养液I的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，15％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素。混合培养液II的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素。

实施例1

(1)原代培养：

取经水囊法引产后死亡的四个月胎儿股骨组织，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心8分钟；离心后弃上清，用混和培养液I吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液I，按细胞培养密度1×10⁶个细胞/瓶接种于100ml的细胞培养瓶中，用混合培养液I补足至培养液总量为8-10ml，按常规培养两天，弃去原培养基的一半，再加入5ml新鲜的混和培养液I，置于二氧化碳孵箱继续培养。

(2)传代培养：

待细胞进入对数生长期后，移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞2次，然后向培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.125％的胰酶(含0.1％EDTA)，置37℃二氧化碳孵箱中2分钟，当观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入6ml混和培养液II，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心8分钟，弃上清，加入8ml混和培养液II，吸取10ul细胞重悬液置于血球计数板上进行常规的细胞计数。取100ml标准培养瓶一个，将含有细胞的混和培养液II，按接种密度1×10⁶个细胞/瓶，接种于新的培养瓶中，并用混和培养液H补足至培养液总量为8-10ml继续培养至细胞生长良好，形态均一。

在培养期间，需按常规保证细胞生长所需的各种条件，例如温度(37℃)，二氧化碳浓度(5％)，稳定的PH值及适宜的湿度等。

在倒置显微镜下观察，所得细胞呈短梭状，细胞形态均一，无接触抑制，并且生长迅速。

目前对间充质干细胞的研究已表明，它不表达血细胞及内皮细胞的抗原，而只表达基质细胞和间质细胞特异性表面标志，即一般而言，间充质干细胞的表面抗原以CD105、CD106、CD44和CD29为阳性，而CD34、CD45、CD31和HLADR为阴性。

发明人对本发明获得的BMMS-03进行了细胞周期检测鉴定，结果如下：

经流式细胞仪检测，第3代细胞(原代细胞传代三次获得的细胞)表面标志物CD105的阳性率为97.2％；CD106的阳性率为66.0％；CD34的阴性阳性率为9.2％；阴性对照组为0.5％。见图2。

本发明方法培养的BMMS-03细胞，能够体外长期生长和短期内稳定传代。经实验观察与验证，体外生长的BMMS-03细胞具有典型的短梭状形态，且生长旺盛。

实施例2

(1)原代培养：

取经水囊法引产后死亡的四个月胎儿股骨组织，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心7分钟；离心后弃上清，用混和培养液I吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液I，按细胞培养密度1.5×10⁶个细胞/瓶，接种于100ml的细胞培养瓶中，用混合培养液I补足至培养液总量为8-10ml，按常规培养两天，弃去原培养基的一半，再加入4ml新鲜的混和培养液I，置于二氧化碳孵箱继续培养。

(2)传代培养：

待细胞进入对数生长期后，移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞3次，然后向培养瓶中加入1.5ml质量体积百分比为0.125％的胰酶(含0.1％EDTA)，置37℃二氧化碳孵箱中3分钟，当观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入7ml混和培养液II，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心8分钟，弃上清，加入9ml混和培养液II，吸取10ul细胞重悬液置于血球计数板上进行常规细胞计数。取100ml标准培养瓶一个，将含有细胞的混和培养液II，按接种密度1.5×10⁶个细胞/瓶，接种于新的培养瓶中，并用混和培养液II补足至培养液总量为8-10ml，按常规培养至细胞细胞生长良好，形态均一。

在倒置显微镜下观察，所得细胞呈短梭状，细胞形态均一，无接触抑制，并且生长迅速。

Claims (1)

1、一种骨髓间充质干细胞分离、培养方法，其特征在于它包括：

1)原代培养；

a)取经水囊法引产后死亡的四个月胎儿股骨组织，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心7～8分钟；离心后弃上清，用混和培养液I吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液I按细胞培养密度1～1.5×10⁶个细胞/瓶接种于细胞培养瓶中，并用混合培养液I补足至培养液总量为8～10ml，培养两天；

b)弃去培养液的一半，再加入4～5ml新鲜的混和培养液I，置于二氧化碳孵箱继续培养使细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养；

2)传代培养；

待细胞生长至对数生长期后，移去原代培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞2～3次，然后向培养瓶中加入1～2ml 0.125％(质量体积百分比)的胰蛋白酶酶溶液(含0.1％EDTA)，在二氧化碳孵箱中放置2～3分钟，观察，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培养液II，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心7～8分钟，弃上清，加入8～10ml混和培养液II，计数；将含有细胞的混和培养液II按接种密度1～1.5×10⁶个细胞/瓶接种于新培养瓶中，并用混合培养液II补足至培养液总量为8～10ml，培养至细胞生长良好，形态均一，即完成传代培养。

所述混合培养液I的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，15％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。

所述混合培养液II的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，10％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。

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