CN103146647B - 一种体外培养间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞工程领域，公开了一种体外培养间充质干细胞的方法。本发明所述方法采用1.073g/cm³Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液中于37℃、5%CO₂浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。本发明所述培养方法无需加入马血清、I-肌醇、L-谷氨酰胺、巯基乙醇等成分，成本低廉、配置简便，且细胞活力更高，细胞扩增所需的周期缩短，优于现有Dexter-LTC培养体系，能够为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。

Description

一种体外培养间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体提供了一种体外培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最初在骨髓中发现，随着干细胞技术的不断发展，人们发现脐血、脐带中也富含间充质干细胞。间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，具有分泌造血生长因子、低免疫原性、易于外源基因转染和表达等优点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

目前，间充质干细胞采用Dexter-LTC培养体系（Dexter-type long-termcultures）培养：α-MEM+12.5%胎牛血清+12.5%马血清+0.2mmol/L I-肌醇+0.2mmol/L L-谷氨酰胺+10^-4mol/L巯基乙醇，在此体系下培养出来的细胞符合间充质干细胞国际标准，这种方法也是本领域公认的、普遍的培养方法。但是，这种培养方法的细胞扩增周期较长，而且其培养基中除α-MEM基础培养基外还需要加入了马血清等较为昂贵的组分，成本高，组分多，操作复杂。此外，这种传统的方法细胞生长较为缓慢，扩增效率较低，所培养的细胞活力无法满足临床和科研的需要。

因此，急需要建立一种低成本、操作简便、扩增效率高、细胞活力高的体外培养MSCs的方法，为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外培养间充质干细胞的方法，使得该制备方法制备的间充质干细胞成本更低、操作更简便、扩增效率高、细胞活力高。

为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案：

采用1.073g/cm³Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液中于37℃、5%CO₂浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。

优选地，所述α-MEM培养基由以下组分组成：

无水氯化钙200mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6800mg/L、磷酸二氢钠单水合物140mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸126.98mg/L、L-天门冬酰胺50mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-盐酸半胱氨酸100mg/L、L-盐酸胱氨酸31.28mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、甘氨酸50mg/L、L-盐酸组氨酸41.88mg/L、L-异亮氨酸52.5mg/L、L-亮氨酸52.4mg/L、L-盐酸赖氨酸72.47mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸32mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐51.9mg/L、L-缬氨酸46mg/L、L-抗坏血酸50mg/L、D-生物素0.1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、氯化胆碱1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺1mg/L、维生素B121.36mg/L、腺苷酸10mg/L、胞苷10mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、鸟苷mg/L、硫辛酸mg/L、苯酚红mg/L、丙酮酸钠mg/L、胸苷mg/L、脱氧腺苷10mg/L、脱氧胞苷盐酸11mg/L、脱氧鸟苷10mg/L、尿苷10mg/L、碳酸氢钠2200mg/L。

本发明采用的骨髓、脐血或脐带由第三军医大学第二附属医院提供，采集前经被采集者同意并签署知情同意书，且已经通过了伦理委员会批准，所有标本的来源合乎我国相关法律规定。本发明所述梯度密度离心法为本领域分离单个核细胞的常规方法，为本领域技术人员熟知。

现有培养间充质干细胞的Dexter-LTC培养体系需要加入马血清等成本昂贵的细胞因子且加入成分较多，操作复杂，同时细胞培养周期较长，扩增效率偏低，细胞活力不能满足带下临床和研究的需要，制约了间充质干细胞技术的应用发展。为此，经过本发明申请人深入研究，在原有Dexter-LTC培养体系基础上，剔除马血清等额外添加的组分，保留胎牛血清，优化培养条件，能够缩短细胞扩增周期，提高了其集落形成能力，在活力和扩增效率上明显优于现有培养方法培养的细胞。

同时，作为优选，贴壁培养期间，第3d将培养瓶内一半体积的上清液更换为含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液，第6d将培养瓶内全部的上清液更换为含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液。

此外，本发明还包括按1:2-1:4比例传代培养步骤。对贴壁细胞传代方法，属于本领域常规技术，在知晓原代培养方法的前提下，本领域技术人员能够进行传代培养，所述1:2-1:4比例是指贴壁细胞被消化下来后平均分成2～4份再重新接种培养扩增。

经过本发明方法培养的细胞具有塑料底物粘附性，不表达或低表达CD14、CD34、CD45，高表达CD73、CD90、CD105，且在体外可被诱导成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，具有间充质干细胞典型的形态、表面标志物和诱导分化特征，经鉴定符合国际细胞治疗学会提出的间充质干细胞的参考标准。

分别采用本发明方法和Dexter-LTC培养体系的方法进行生长曲线和集落形成能力的试验对比，结果显示，在Dexter-LTC培养体系下，间充质干细胞第10天进入对数生长期，第19天进入平台期；本发明所培养的间充质干细胞在第4天进入对数生长期，第15天进入平台期。细胞扩增周期明显变短。而在单个集落的克隆试验中，本发明所述方法的集落个数为11.3±1.53，单个集落中细胞数为66.5±14.4，而在Dexter-LTC培养体系下集落个数8.0±1.0，单个集落中细胞数为59.2±8.2，两者相比均具有显著差异，表明本发明培养间充质干细胞活力更强。

由以上技术方案可知，本发明所述培养方法无需加入马血清、I-肌醇、L-谷氨酰胺、巯基乙醇等成分，成本低廉、配置简便，且细胞活力更高，细胞扩增所需的周期缩短，优于现有Dexter-LTC培养体系，能够为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。

附图说明

图1所示为间充质干细胞CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105免疫表型检测的流式细胞结果图；

其中，图1-A为空白对照；图1-B为CD45免疫表型检测的流式细胞结果图；1-C为CD90免疫表型检测的流式细胞结果图；1-D为CD73、CD14免疫表型检测的流式细胞结果图；1-E为CD34、CD105免疫表型检测的流式细胞结果图；

图2所示为间充质干细胞镜检图；

其中，图2-A为原代细胞培养第3d 100倍镜检图；图2-B为第三代细胞培养第3d50倍镜检图；图2-C为第三代细胞培养第3d 100倍镜检图；

图3所示为间充质干细胞诱导分化镜检图；

其中，图3-A为成骨诱导分化茜素红染色镜检图，图3-B为成脂肪诱导分化油红染色镜检图，图3-C为成软骨诱导分化阿利辛蓝染色镜检图；

图4所示为间充质干细胞集落克隆图；

其中，图4-A为Dexter-LTC体系单个集落克隆苏木素染色，图4-B为本发明单个集落克隆苏木素染色；

图5所示为间质干细胞生长曲线折线图；

其中，折线A代表本发明间充质干细胞生长曲线；折线B代表Dexter-LTC培养体系间充质干细胞生长曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种体外培养间充质干细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：利用本发明所述方法制备间充质干细胞

原代培养：

采用1.073g/cm³Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养基中于37℃、5%CO₂浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得原代间充质干细胞。

α-MEM培养液：无水氯化钙200mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6800mg/L、磷酸二氢钠单水合物140mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸126.98mg/L、L-天门冬酰胺50mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-盐酸半胱氨酸100mg/L、L-盐酸胱氨酸31.28mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、甘氨酸50mg/L、L-盐酸组氨酸41.88mg/L、L-异亮氨酸52.5mg/L、L-亮氨酸52.4mg/L、L-盐酸赖氨酸72.47mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸32mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐51.9mg/L、L-缬氨酸46mg/L、L-抗坏血酸50mg/L、D-生物素0.1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、氯化胆碱1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺1mg/L、维生素B121.36mg/L、腺苷酸10mg/L、胞苷10mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、鸟苷mg/L、硫辛酸mg/L、苯酚红mg/L、丙酮酸钠mg/L、胸苷mg/L、脱氧腺苷10mg/L、脱氧胞苷盐酸11mg/L、脱氧鸟苷10mg/L、尿苷10mg/L、碳酸氢钠2200mg/L。

传代培养：

吸除原代间充质干细胞培养瓶中的上清液，加入PBS溶液洗涤细胞1～2次后弃去PBS溶液，然后用0.5-1ml0.25%胰酶，置37℃孵箱中消化2-8分钟，不时晃动瓶底以加速细胞脱落。待间充质干细胞细胞突触消失，胞质回缩，细胞间隙增大，快脱离瓶底时，接着立即加入含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液3ml，终止消化，用吸管反复吹打贴壁的间充质干细胞，使之形成细胞悬液；然后1000转离心5min后弃上清，加入含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液5ml并混悬细胞，按1:2-1:4比例接种于含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液中，37℃、5%CO₂浓度条件下继续培养至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得第一代间充质干细胞。

实施例2：本发明间充质干细胞的鉴定

1、免疫表型检测

制备原代间充质干细胞，分别取1×10⁴个以上的细胞并将其加入到不同的EP管中，每管分别加入PE或FITC标记的抗CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105单克隆抗体并上流式细胞仪检测，结果见图1。由图1可知，本发明培养的间充质干细胞不表达或低表达CD14、CD34、CD45，高表达CD73、CD90、CD105，符合国际细胞治疗学会提出的间充质干细胞的参考标准。

2、形态特征

将本发明培养的原代间充质干细胞以及第三代间充质干细胞进行显微镜观察，结果见图2，由图2-A可看出本发明间充质干细胞原代培养第3天，可见少量“小岛”集落，集落下可见少量贴壁的细长形细胞。传至第三代后，见图2-B和图2-C，镜下可见具有塑料底物粘附性细胞贴壁生长，细胞呈成纤维细胞状，多呈梭形、纺锤形或多角形、星芒形，接近汇合时呈鱼群状、旋涡状排列。符合间充质干细胞的形态特征。

3、诱导分化特征

将原代间充质干细胞分别按照成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞的诱导分化条件进行诱导分化，结果见图3。

成骨诱导分化采用茜素红染色镜检（图3-A）：14d后，镜下可见细胞融合，形成白色矿化结节、结晶颗粒，茜素红染色形成一堆堆红色、沙粒型颗粒状物质，符合骨细胞形态结构；

成脂肪诱导分化采用油红染色镜检（图3-B）：21d后油红O染色，光镜下可见部分细胞内含脂丰富的小泡，形成红色脂滴，聚集成葡萄串样。细胞核被挤向外周，甚至整个细胞内核周均被大脂滴填充，细胞呈气球样，折光性强，细胞分化为成熟脂肪；

成软骨诱导分化采用阿利辛蓝染色镜检（图3-C）：可见聚集形成的结节呈浅蓝色，相互融合，成不规则区域；未诱导的无着色。

实施例3：间充质干细胞集落克隆试验

将经过本发明所述方法和Dexter-LTC培养体系培养的间充质干细胞进行集落克隆苏木素染色（培养环境一致），并进行统计和显著性差异分析（≥50个细胞的记做一个集落），结果见表1和图4。

表1间充质干细胞集落克隆试验计数

分组	集落个数	当个集落平均细胞数目
			Dexter-LTC培养体系	8.0±1.0	59.2±8.2
本发明方法	11.3±1.53*	66.5±14.4*

注：*表示和Dexter-LTC体系比较具有显著差异（P<0.05）

由表1可知，按照本发明所述方法培养的间充质干细胞集落个数以及单个集落平均细胞数目都高于现有培养体系，且具有显著差异性，表明经本发明培养的间充质干细胞细胞活力得到很大提高。

实施例4：间充质干细胞生长曲线试验

按照本发明所述方法和Dexter-LTC培养体系培养的培养间充质干细胞，通过MTT法检测每组细胞增殖，用酶标仪检测各组细胞吸光度值，绘制细胞生长曲线，结果见图5。由图5可知，Dexter-LTC体系下，间充质干细胞第10天进入对数生长期，细胞增殖加速，第19天进入平台期；而本发明培养体系下，间充质干细胞第4天进入对数生长期，第15天进入平台期。在整个细胞生长周期上，本发明方法所培养的间充质干细胞能够比现有培养体系提前5-6天，缩短了间充质干细胞的培养时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种体外培养间充质干细胞的方法，其特征在于，采用1.073g/cm³Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10％胎牛血清的α-MEM培养液中于37℃、5％CO₂浓度条件下进行贴壁培养，贴壁培养期间，第3d将培养瓶内一半体积的上清液更换为含体积百分比为10％胎牛血清的α-MEM培养液，第6d将培养瓶内全部的上清液更换为含体积百分比为10％胎牛血清的α-MEM培养液，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞；

其中，所述α-MEM培养液由以下组分组成：

无水氯化钙200mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6800mg/L、磷酸二氢钠单水合物140mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸126.98mg/L、L-天门冬酰胺50mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-盐酸半胱氨酸100mg/L、L-盐酸胱氨酸31.28mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、甘氨酸50mg/L、L-盐酸组氨酸41.88mg/L、L-异亮氨酸52.5mg/L、L-亮氨酸52.4mg/L、L-盐酸赖氨酸72.47mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸32mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐51.9mg/L、L-缬氨酸46mg/L、L-抗坏血酸50mg/L、D-生物素0.1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、氯化胆碱1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺1mg/L、维生素B121.36mg/L、腺苷酸10mg/L、胞苷10mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、鸟苷mg/L、硫辛酸mg/L、苯酚红mg/L、丙酮酸钠mg/L、胸苷mg/L、脱氧腺苷10mg/L、脱氧胞苷盐酸11mg/L、脱氧鸟苷10mg/L、尿苷10mg/L、碳酸氢钠2200mg/L。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括按1:2-1:4比例传代培养步骤。