WO2013163959A1

WO2013163959A1 - 用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液

Info

Publication number: WO2013163959A1
Application number: PCT/CN2013/075111
Authority: WO
Inventors: 曹卫; 张丽; 张露亿; 王飞
Original assignee: 西比曼生物科技（香港）有限公司
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2013-11-07
Also published as: CN103380769A; CN103380769B

Abstract

本发明公开了一种用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液，包括以下组分：磷酸盐缓冲液、抗坏血酸。本发明还公开了保存液的制备方法和用途，以及包含该保存液和脂肪组织的脂肪组织混合物。采用本发明的保存液可以长时间保存离体的脂肪组织，对组织细胞没有毒性作用，且自保存的脂肪组织中分离提取的脂肪干细胞具有良好的生殖能力，较好地保持其性状和分化潜能。

Description

用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及用于分离培养干细胞的脂肪组织的长时间保存液。背景技术

再生医学的兴起激发了人们对各种干细胞、组织工程支架和细胞生长因子的研究热潮，选用合适的干细胞作为种子细胞的来源已成为研究的焦点。

脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便，通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞 (adipos tissue-derived stem cells, ADSCs)不仅在体内体外具有多化潜能，在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。最新的研究发现， ADSCs作为基因治疗的靶细胞具有抗炎、抗氧化的作用，有望成为临床上用来修复受损的组织和器官的理想干细胞来源，同时也为一系列疾病的治疗提供了新的思路。

自 2001年 Zuk等在脂肪组织中发现具有多向分化潜能的、成纤维细胞样的干细胞以来，相继在包括人类在内的多个物种的研究结果表明其具有多向分化能力。脂肪干细胞 (adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)有望成为组织工程的 "种子细胞"之一。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs) 是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。所谓干细胞，是一群可再生、多潜力及可分化的细胞，用之可使真皮皮下脂肪及真皮再生，合并自体脂肪治疗解决自体脂肪治疗再吸收的问题，而且脂肪干细胞也将消除来自胚胎干细胞的伦理争议；尤其重要的是，它的好处为来自自体，并无异体移植出现排斥的问题。

通常在医院可以通过抽脂手术来获得脂肪，而脂肪干细胞的获得需要在严格的 GMP中进行，对于不能立即进行的分离脂肪组织，为了保证分离的脂肪组织新鲜度，需要准备脂肪组织的保存液，以保证脂肪组织在运输途中保持其生物活性，可以更好的获得脂肪干细胞。发明内容

本发明的目的在于提供一种脂肪组织保存液，可以长时间保存离体的脂肪组织，从保存后的脂肪组织中分离提取得到的脂肪干细胞仍具有良好的生殖能力，能够保持其性状和分化潜能。本发明的第一方面，提供一种脂肪组织保存液，包括以下组分：磷酸盐缓冲液、抗坏血酸。

在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 l〜10 mg/ml。

在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 3〜7 mg/ml。

在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 4〜6 mg/ml。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠 /磷酸二氢钾缓冲液。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.0〜7.6。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.2〜7.4。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.4〜7.6。

在另一优选例中，所示脂肪组织保存液的 pH为 7.0〜7.6。

在另一优选例中，所述脂肪组织保存液的 pH为 7.2〜7.4。

在另一优选例中，所述脂肪组织保存液的 pH为 7.4〜7.6。本发明的第二方面，提供第一方面所述的脂肪组织保存液的配制方法，包括以下步骤：

(a)配制磷酸盐缓冲液；

(b)于步骤 (a)得到的磷酸盐缓冲液中加入抗坏血酸，混合均匀，得到所述脂肪组织保存液。

在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 l〜10 mg/ml。在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 3〜7 mg/ml。

在另一优选例中，所述抗坏血酸的浓度为 4〜6 mg/ml。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.0〜7.6。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.2〜7.4。本发明的第三方面，提供第一方面所述的脂肪组织保存液的用途，所述用途选自下组：

(a)用于保存脂肪组织；

(b)用于保持或提高脂肪组织中的脂肪干细胞的活力；

(c)用于保持或促进脂肪组织中的脂肪干细胞的分化潜能。

在另一优选例中，所述用途为用于长时间保存脂肪组织。本发明的第四方面，提供一种脂肪组织混合物，包括以下组分：

脂肪组织；和

(b)第一方面所述的脂肪组织保存液。

在另一优选例中，所述脂肪组织为哺乳动物脂肪组织，优选为人体脂肪组织,

在另一优选例中，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.2〜2: 1。较佳地，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.5〜1.5: 1，更佳地，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.8〜1.2: 1。本发明的第五方面，提供第四方面所述的脂肪组织混合物的用途，用于分离培养脂肪干细胞。本发明的第六方面，提供一种分离培养脂肪干细胞的方法，包括以下步骤： (i)对第四方面所述的脂肪组织混合物进行洗涤，从而获得去除了血细胞的组织混合物； (ii)对步骤 (i)得到的组织混合物进行消化，得到经消化的组织混合物；

(iii)对步骤 (ii)获得的经消化的组织混合物进行过滤，去除未消化的组织块，获得含脂肪干细胞的滤液；

(iv)对步骤 (iii)获得的滤液进行离心，弃去上层的脂肪，得到的沉淀为脂肪干细胞。

在另一优选例中，对步骤 (iv)得到的脂肪干细胞进行接种传代，可以得到脂肪间充质干细胞。本发明采用包含磷酸盐缓冲液和抗坏血酸的保存液保存离体的脂肪组织，经过长时间保存后，分离提取得到的脂肪干细胞仍具有良好的生殖能力，能够保持其性状和分化潜能。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

图 1为实验组和对照组在不同培养时间的细胞形态图。

图 2为流式细胞仪检测 SVF表面抗原的结果图。

图 3为流式细胞仪检测第 3代细胞表面抗原的结果图。具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次发现，采用包含磷酸盐缓冲液和抗坏血酸的保存液保存离体的脂肪组织，经过长时间保存后，分离提取得到的脂肪干细胞仍具有良好的生殖能力，能够保持其性状和分化潜能。在此基础上，完成了本发明。脂肪干细胞 (ADSCs) 如本文所用，术语 "脂肪干细胞"指分离自脂肪组织的干细胞，具体地，脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。 ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。脂肪组织保存液

本发明的脂肪组织保存液，包括以下组分：磷酸盐缓冲液 (PBS)、抗坏血酸。

所述抗坏血酸的浓度为 1〜10 mg/ml , 较佳地所述抗坏血酸的浓度为 3〜7 mg/ml, 更佳地，所述抗坏血酸的浓度为 4〜6 mg/ml。

所述磷酸盐缓冲液为本领域惯常使用的磷酸盐缓冲液。

所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.0〜7.6。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.2〜7.4。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7.4〜7.6。

较佳地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠 / 磷酸二氢钾缓冲液。

磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠 /磷酸二氢钾缓冲液的配制方法采用本领域常规方法，例如，采用但不限于以下配制方法配制磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液：

母液：

0.2M Na₂HPO₄: 称取 71.6g Na₂HPO₄-12H₂O，溶于 1000ml水；

0.2M NaH₂PO₄: 称取 31.2g NaH₂PO₄-2H₂O, 溶于 1000ml水。

0.2M PBS的配制：取 19ml 0.2mol/L的 NaH₂PO₄， 81ml 0.2mol/L的 Na₂HPO₄ 混合均匀即可得到 0.2M PBS (pH7.4, 100ml) 。

若需要其他浓度的 PBS，仅需按比例加入适量水稀释即可。本发明的脂肪组织保存液的 pH为 7.0〜7.6。

在另一优选例中，所述脂肪组织保存液的 pH为 7.2〜7.4。

在另一优选例中，所述脂肪组织保存液的 pH为 7.4〜7.6。

本发明的脂肪组织保存液可在 4°C或 -20°C贮放，较佳地，在 4°C贮放 15天内或在 -20°C贮放一年内使用。本发明的脂肪组织保存液的配制方法，包括以下步骤：

(a)配制磷酸盐缓冲液；

(b)于步骤 (a)得到的磷酸盐缓冲液中加入抗坏血酸，混合均匀，得到所述脂肪保存液。本发明的脂肪组织保存液的用途，所述用途选自下组：

(a)用于保存脂肪组织；

(b)用于保持或提高脂肪组织中的脂肪干细胞的活力；

(c)用于保持或促进脂肪组织中的脂肪干细胞的分化潜能。在进行脂肪保存时， PBS能保持脂肪组织细胞需要的 PH范围，其中所含的盐浓度与体内环境的相似，可以提供相对稳定的离子环境、 pH缓冲能力，保护蛋白（酶）的活性，且对组织细胞没有毒性作用。抗坏血酸（维生素 C Vitamin C, Ascorbic Acid) 是一种水溶性维生素，在人体中参与抗氧化作用、胶原蛋白的合成，在脂肪干细胞的培养基中加入抗坏血酸，可以增加脂肪干细胞的生长速率。本申请的发明人创造性地将抗坏血酸作为脂肪组织保存液的组分，意外发现用含有抗坏血酸的磷酸盐缓冲液长时间保存脂肪组织，可以保持脂肪干细胞的活性，分离提取的干细胞具有较佳的生长速率，传代后得到的脂肪间充质干细胞纯度高。脂肪组织混合物

本发明的脂肪组织混合物，包含以下组分:

脂肪组织；以及 (b)本发明的脂肪组织保存液。

所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.2〜2: 1。

较佳地，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.5〜1.5:1。

更佳地，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为 0.8〜1.2:1。从本发明的脂肪组织混合物中分离提取脂肪干细胞，包括以下步骤：

(i)对脂肪组织混合物进行洗涤，从而获得去除了血细胞的组织混合物；

(ii)对步骤 (i)得到的组织混合物进行消化，得到经消化的组织混合物；

对步骤 (iv)得到的脂肪干细胞进行接种传代，通过细胞表面抗原的检测，确定得到脂肪间充质干细胞。干细胞抗原检测

脂肪干细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有 CD3、 CD13、 CD14、 CD29、 CD34、 CD45、 CD49d、 CD59、 CD73、 CD90、 CD105、 HLA-ABC等。

CD34抗原是一种高度糖基化 I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞 (HSC)，祖细胞 (PC)和血管内皮细胞 (EC)表面，带有 CD34的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤5%，更佳地， ≤3%。

CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有 CD45 的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1%。

CD14是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原，带有 CD14 的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤5%，较佳地， ≤3%；更佳地，

CD29、 CD73、 CD90、 CD49d等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。带有 CD29 的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥95%，更佳地≥97%，最佳地≥98%。

带有 CD73 的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥80%，更佳地≥90%，最佳地≥93%。

带有 CD90 的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥85%，更佳地≥95%，最佳地≥97%。

带有 CD49d的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%。

本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如 Fab'或 (Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链 Fv分子 (Ladner等人，美国专利 No.4,946,778); 或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。本发明的保存液主要优点包括：

(1)保存液成分清晰，不含对细胞有害的成分；

(2)可以长时间保存脂肪组织，保持干细胞的活性;

(3)分离得到的干细胞成活率高，增殖能力强；

(4)传代后干细胞抗原特征保持稳定，纯度高。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例 1

脂肪保存液的配制

在磷酸盐缓冲液 (pH7.4)中加入抗坏血酸，使其终浓度为 5mg/ml。实施例 2

脂肪组织混合物

将经抽脂获得的脂肪组织 40ml置于离心管中，共 4管，每管 10ml，加入实施例 1 制备的保存液，其中脂肪组织与保存液的体积比为 1 : 1，获得脂肪组织混合物，作为实验组。

此外，将经抽脂获得的相同部位的 40ml脂肪组织也置于离心管中，共 4 管，每管 10ml，加入实施例 1 中采用的磷酸盐缓冲液 (pH7.4)，其中脂肪组织与磷酸盐缓冲液的体积比为 1 : 1，作为对照组。

实验组和对照组均放置在 4°C冰箱内保存待用。实施例 3

SVF (脂肪组织基质血管成分）的制备

实验材料

1 . 胶原酶、生理盐水、完全培养基 DMEM、 PBS、保存液、酒精等

2. 冰盒、冻存管、程序降温盒等 3. 储液瓶、培养瓶、离心管、移液器等

4. ΙΟΟ μιη细胞过滤器、记号笔、标签、无尘布等

实验方法

实施例 2制备的每份标本在当天（也即 Oh后）、 24 h后、 48 h后、 72 h后各取一支制备 SVF，具体步骤如下：

(1)用生理盐水充分洗涤标本 3〜4次，以去除多余的杂细胞；

(2) 吸弃生理盐水后，加预热的与脂肪组织等体积的含 0.1%胶原酶 I 的 DMEM, 按体积比为 1 :1的量加入到标本中，置 37 恒温振荡仪中， 200 rpm，消化 30 min〜 60 min;

(3)消化完毕，于 2000rpm离心 10min，弃去上清和上层消化后的废弃脂肪；

(4)加 50 ml DMEM重悬细胞，并用 100 μιη的滤器过滤细胞，加 DMEM至 50ml, 吸取 lml采用细胞计数仪对细胞进行计数。实施例 4

脂肪干细胞的培养

接种培养：将实施例 3中分离的脂肪干细胞 1000rpm离心 8min，洗涤一次，接种至 T175培养瓶，细胞密度为 5 X 10⁶, 置 37°C、 5%CO₂培养。

显微观察实验组和对照组细胞生长情况，结果如图 1和表 1所示。表 1 实验组和对照组细胞生长情况

图 1为在不同预定时间，显微观察培养实施例 2制备的标本保存 48 h后制备的 SVF，得到的细胞形态。由图 1可见，各组细胞形态良好。

由表 1 的细胞计数结果可知，脂肪组织在经过实验组和对照组两种保存液中保存 0h、 24 h、 48 h、 72 h后所制备的细胞均能很好的生长，但是由实验结果可见，实验组保存液明显优于对照组保存液，同样量的脂肪组织，同样培养条件下、采用实验组保存液保存的脂肪组织中分离的干细胞生长速度明显比对照组保存液保存的脂肪组织中分离的干细胞生长速度快，细胞增殖的数量多。实施例 5

表面抗原检测

采用实施例 4的方法，细胞接种后约 1-2天贴壁， 3天左右出现少量贴壁间充质干细胞，培养 5-7天贴壁细胞呈集落时，用 0.125%胰蛋白酶 -0.01%EDTA溶液消化传代，每个 T175培养瓶加入 5ml消化液，消化时间为 1.5-2.5min，收集并计数细胞，按 5xl0³/cm²(即根据原代贴壁情况 1 :1-2的比例)传代，传代后细胞生长变快，一般三天即可再次传代，根据细胞生长情况，按照 1 : 2-3的比例传代，收集每份组织制得的第 3代 (P3)干细胞，以检测间充质干细胞的纯度。

脂肪干细胞的流式检测方法如下：

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为 l xlO⁵ !!!! ¹ , 于 800r/min(120g), 离心 5 min，弃掉上清，用 4°C的冷 D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以 800 r/min, 离心 5 min，之后弃去上清。然后用 D-Hanks将细胞重悬至 1 mL，加入抗体 5〜10 L，避光，冰上放置 30 min。用 D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程 2〜3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约 200 至 300 μL的 D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。加入的抗体分别为：人抗 CD29、 CD73、 CD34、 CD49d、 CD14、、 CD45、 CD90、 Actin和 HLA-DR。

结果如图 2、图 3和表 2所示。

其中，图 2为 SVF的流式检测结果，图 3为培养的 P3代干细胞表面抗原流式鉴定结果。流式结果分析

如表 1所示，通过流式细胞仪对脂肪干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析，新鲜分离的干细胞中脂肪干细胞比例较低（不到 60% ) ，且造血干细胞含量达到 70%以上，混合细胞较多。培养后脂肪干细胞细胞表面的 CD34(—种典型的造血干细胞表面抗原)、 CD45(—种已知位于白细胞表面的典型抗原)、 CD14含量很少，甚至为 0，而 CD90、 CD72、 CD49d、 CD29 (公认的脂肪干细胞特异性抗原)的含量≥97%，甚至≥99%。结果表明，采用本发明的保存液长时间保存脂肪组织后，分离的脂肪干细胞培养传代后纯度高，绝大部分为脂肪间充质干细胞。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1.一种脂肪组织保存液，其特征在于，包括以下组分：磷酸盐缓冲液、抗坏血酸。

2.如权利要求 1所述的脂肪组织保存液，其特征在于，所述抗坏血酸的浓度为 1〜10 mg/ml。

3.如权利要求 1所述的脂肪组织保存液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠 /磷酸二氢钾缓冲液。

4.如权利要求 1所述的脂肪组织保存液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的 pH为 7·0〜7·6。

5.如权利要求 1所述的脂肪组织保存液的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)配制磷酸盐缓冲液；

6.如权利要求 5所述的配制方法，其特征在于，所述抗坏血酸的浓度为 1〜10 mg/ml; 禾口 /或

所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠 /磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠 /磷酸二氢钾缓冲液。

7.如权利要求 1所述的脂肪组织保存液的用途，其特征在于，所述用途选自下组：

(a)用于保存脂肪组织；

(b)用于保持或提高脂肪组织中的脂肪干细胞的活力；

(c)用于保持或促进脂肪组织中的脂肪干细胞的分化潜能。

8.—种脂肪组织混合物，其特征在于，包括以下组分：

(a)脂肪组织；和

(b)如权利要求 1所述的脂肪组织保存液。

9.如权利要求 8所述的脂肪组织混合物的用途，其特征在于，用于分离培养脂肪干细胞。

10.—种分离培养脂肪干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(i)对权利要求 8所述的脂肪组织混合物进行洗涤，从而获得去除血细胞的组织混合物；