CN115956556A - 一种脂肪组织运输保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂肪组织运输保存液。具体地，所述运输保存液包括：(a)DMEM,high glucose,no phenol red 60‑90重量份；(b)DMEM/F‑12,hepes,no phenol red 10‑30重量份；(c)杀菌剂50‑200ng/mL；和(d)L‑谷氨酰胺2‑10mmol/L。实验证明，本发明的保存液能够使得脂肪组织在2‑8℃的低温下运输保存72h以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于低温长时间保存脂肪组织的运输保存液。
背景技术
脂肪组织因其在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用已被认为是一个内分泌器官。此外，它还是具有多向分化潜能的多功能细胞的来源之一，而这种多功能细胞就存在于脂肪组织的血管基质部分中。脂肪组织中的血管基质部分(SVF,stromal vascularfraction)是脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到的。SVF易于从脂肪组织中提取并含有丰富的、可塑性极强的脂肪组织来源的间充质干细胞(Adiposetissue-derived mesenchymal stem cells,ASC)。
从人类乳房和内脏脂肪组织中得到的SVF已有报道其含有内皮细胞、非特征性的基质细胞、血液细胞和组织型巨噬细胞。此外，SVF还是造血祖细胞和中胚层干细胞(可以分化为成骨的、成软骨的以及肌源性、神经源细胞系)的来源之一。SVF可以促进血管再生、形成、诱导分化,通过SVF自体纯化活细胞的注射,能提高脂肪成活率。
新鲜的脂肪组织样本可保证提取的间充质干细胞具有良好的生物活性、细胞性状及增殖能力。但样本采集地点(如医院)与样本生产地点通常处于不同地点，因此需将脂肪组织样本在采集后保存于运输保存液中并于一定温度环境下运输转运至生产场地进行保存及生产。
关于脂肪组织样本的保存，在室温中保存一般不超过24h，或在低温冻存后再复温，但低温冷冻运输一般使用干冰或者液氮维持细胞冷冻，虽然细胞活性能长期得到保存，但对运输条件要求非常苛刻，并且运输成本高昂，在实际应用中难以广泛采用。而低温(0～10℃)处理可降低细胞正常生理过程中产生的氧自由基和脂质过氧化物，送到的样品无需特别处理(ready-to-use)。并且，低温运输与冷冻运输相比，非常廉价。
因此本领域迫切需要开发保存时间长、且保存效果好的脂肪组织低温运输保存液。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存时间长、且保存效果好的脂肪组织低温运输保存液。
本发明第一方面，一种脂肪组织运输保存液，包括：
(a)DMEM,high glucose,no phenol red 60-90重量份；
(b)DMEM/F-12,hepes,no phenol red 10-30重量份；
(c)杀菌剂50-200ng/mL；和
(d)L-谷氨酰胺2-10mmol/L。
在另一优选例中，所述运输保存液中，所述组分(a)-(d)占所述保存液总重量的80-100wt％，较佳地，85-99wt％，更佳地95-98.5wt％。
在另一优选例中，所述运输保存液中，组分(a)与组分(b)的重量比为3.5-4.5:1，较佳地，3.8-4.2:1。
在另一优选例中，组分(a)为70-85重量份，较佳地，75-82重量份。
在另一优选例中，组分(b)为15-25重量份，较佳地，18-22重量份。
在另一优选例中，组分(c)的浓度为80-120ng/mL，较佳地，90-110ng/mL，更佳地，95-105ng/mL。
在另一优选例中，组分(d)的浓度为3-6mmol/L，较佳地，3.5-4.5mmol/L。
在另一优选例中，所述杀菌剂为庆大霉素硫酸盐。
在另一优选例中，所述运输保存液中，组分(a)-(d)之外，余量为水。
在另一优选例中，所述运输保存液中水占所述保存液总重量的0-20wt％，较佳地1-5wt％。
本发明第二方面，提供了一种在运输过程中保存脂肪组织的方法，包括步骤：
在2-8℃下，将脂肪组织在如本发明第一方面所述的运输保存液中进行保存。
在另一优选例中，所述保存的温度为4-6℃进行保存。
在另一优选例中，所述保存是指在3.5-4.5℃进行保存。
在另一优选例中，所述保存的时间为0.1-84h。
在另一优选例中，所述保存的时间为24-75h。
在另一优选例中，所述保存的时间为48-72h。
在另一优选例中，所述保存的时间为64-72h。
在另一优选例中，保存时所述脂肪组织与运输保存液的体积比为1～2:1～2；较佳地，1～1.5:1。
本发明第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的组织运输保存液的制备方法，包括步骤：按比例混合组分(a)、(b)、(c)和(d)，混合均匀，从而制得所述组织保存液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种脂肪组织运输保存液。本发明通过特定组分的复配，使得样本可在运输液中2～8℃运输保存72h以上，且不影响基质血管组分(Stromal Vascular Fraction，SVF)细胞的提取率。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
运输保存液
与静置保存相比，在脂肪组织的运输过程中，由于晃动，脂肪组织与运输液的混合更充分，脂肪组织部分浸没于保存液内；而长期静置保存过程中脂肪组织由于密度小会逐渐漂浮浸润于保存液上层，因此，脂肪组织在运输过程面临的环境条件(如晃动对温度、氧气、撞击等因素的影响)与静置时不同，对运输过程中使用的保存液提出了更高的要求。
此外，在保存和运输脂肪组织的另一障碍在于，脂肪细胞在体外以后，为了后续培养以及应用，其组织在制备培养的全过程中都需要处于无菌状态。而且，在保持脂肪组织在处于无菌状态的同时，还要保证组织的细胞活性。
本发明提供了一种脂肪组织运输保存液，包括：
(a)DMEM,high glucose,no phenol red 60-90重量份；
(b)DMEM/F-12,hepes,no phenol red 10-30重量份；
(c)杀菌剂50-200ng/mL；和
(d)L-谷氨酰胺2-10mmol/L。
其中，组分(c)、(d)的浓度为在所述运输保存液中的终浓度，即以所述运输保存液的总体积(量)计。
优选地，所述运输保存液中，所述组分(a)-(d)占所述保存液总重量的80-100wt％，较佳地，85-99wt％，更佳地95-98.5wt％。
优选地，所述杀菌剂为庆大霉素硫酸盐。
此外，所述运输保存液还可以包含一定量的水，如1-5wt的水。所述水可能为配置过程中溶解L-谷氨酰胺和/或杀菌剂是引入，但不会显著影响本发明保存液的性能。
其中，对于组分(a)“DMEM,high glucose,no phenol red”，本领域技术人员能够知晓其组成，可通过商业购买或配制获得。例如，DMEM指Dulbecco'sModified Eagle'sMedium，“high glucose”指葡萄糖浓度为约4500mg/L，“no phenol red”指无酚红。
类似地，对于组分(b)“DMEM/F-12,hepes,no phenol red”，本领域技术人员能够知晓其组成，可通过商业购买或配制获得。
制备方法
本发明的组织运输保存液的制备方法，可包括步骤：按比例混合组分(a)、(b)、(c)和(d)，混合均匀，从而制得所述组织保存液。
典型地，先混合组分(a)和(b)，然后在加入(c)(如水溶液)和(d)混合。
在运输过程中保存脂肪组织的方法
进一步地，本发明还提供了一种在运输过程中保存脂肪组织的方法，包括步骤：将脂肪组织在如上所述的运输保存液中，在2-8℃下进行保存。
在另一优选例中，所述保存的温度为4-6℃进行保存。
在另一优选例中，所述保存是指在3.5-4.5℃进行保存。
在另一优选例中，所述保存的时间为0.1-84h。
在另一优选例中，所述保存的时间为24-72h。
在另一优选例中，所述保存的时间为48-72h。
在另一优选例中，所述保存的时间为64-72h。
在另一优选例中，保存时所述脂肪组织与运输保存液的体积比为1～2:1～2；较佳地，1～1.5:1，更佳地，1:1。
本发明的主要优点包括：
本发明的运输液能够在保证运输保存过程的无菌环境的同时，将脂肪样本的低温(2～8℃)运输保存时间延长至72h以上，使得运输过程不会影响基质血管组分细胞的活性和数量，从而保证了脂肪组织的运输保存的安全和效率。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
试剂
DMEM,high glucose，no phenol red(厂家：GIBCO；货号：11960-069)
DMEM/F-12,hepes，no phenol red(厂家：Life；货号：11039-021)
实施例1
标本运输液配方如表1所述：
表1
标本运输液简要配制过程：
1)提前将L-谷氨酰胺-200mM(100X)从-20℃冰箱中取出，置于2-8℃冰箱下融化；
2)取一个离心管于离心管架上，放置于天平上，去皮，称量相应量庆大霉素硫酸盐；
3)吸取相应体积DMEM,high glucose,no phenol red于储液瓶内；
4)吸取相应体积DMEM/F-12,hepes,no phenol red于上述储液瓶内；
5)吸取相应体积谷氨酰胺-200mM(100X)于上述储液瓶内，共获得约混合液；
6)取部分上述混合液至装有庆大霉素硫酸盐的离心管中，吹打完全溶解后，转入上述储液瓶内，拧紧瓶盖上下颠倒混匀，使用瓶顶式过滤器过滤后分装。
实施例2
脂肪组织样本保存时间对比测试
实验研究所用样本与分组信息为：细胞编号：ALAM0317样本：脂肪组织。
分组：
A组(对照组)：75mL脂肪样品在实施例1的运输保存液(保存液体积75ml，脂肪与运输液比例1:1)中2～8℃保存48h；
B组(实验组)：15mL脂肪样品在实施例1的运输保存液(保存液体积15ml，脂肪与运输液比例1:1)中2～8℃保存72h；
其中所述保存模拟了运输条件，在上海和无锡之间汽运运输。
保存后的A和B两组脂肪按照标准操作规程分别经洗涤、胶原酶消化、细胞分离过滤，提取出质血管成分细胞(SVF)，血细胞分析仪计数。
计数结果如下：
A组脂肪体积75mL，细胞悬液体积37ml，计数结果为1.8×109/L；
B组脂肪体积15mL，细胞悬液体积27ml，计数结果为0.6×109/L；
表2
| 组别 | SVF细胞量/mL脂肪 |
| A组 | <![CDATA[8.88×10<sup>5</sup>]]> |
| B组 | <![CDATA[1.08×10<sup>6</sup>]]> |
B组脂肪并未因存放时间(72h)延长而导致SVF细胞提取量减少(通常情况下，SVF细胞提取量为约5×105-1.2×106/ml脂肪)。
由表2可以看出，脂肪组织在本发明的运输液中2-8℃下运输保存长达72h而不影响基质血管成分细胞(SVF)的提取，这说明本发明将脂肪样本运输保存时间延长72h以上，同时保持细胞活性，控制了微生物污染，非常有利于脂肪组织的安全、高效运输保存，效果优异。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脂肪组织运输保存液，其特征在于，包括：
(a)DMEM,high glucose,no phenolred 60-90重量份；
(b)DMEM/F-12,hepes,no phenolred 10-30重量份；
(c)杀菌剂50-200ng/mL；和
(d)L-谷氨酰胺2-10mmol/L。
2.如权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，所述运输保存液中，所述组分(a)-(d)占所述保存液总重量的80-100wt％，较佳地，85-99wt％，更佳地95-98.5wt％。
3.如权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，组分(a)为70-85重量份，较佳地，75-82重量份。
4.如权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，组分(b)为15-25重量份，较佳地，18-22重量份。
5.如权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，组分(c)的浓度为80-120ng/mL，较佳地，90-110ng/mL，更佳地，95-105ng/mL。
6.如权利要求1所述的运输保存液，其特征在于，所述杀菌剂为庆大霉素硫酸盐。
7.一种在运输过程中保存脂肪组织的方法，包括步骤：
在2-8℃下，将脂肪组织在如权利要求1所述的运输保存液中进行保存。
8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于，所述保存的时间为0.1-84h。
9.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于，保存时所述脂肪组织与运输保存液的体积比为1～2:1～2；较佳地，1～1.5:1。
10.一种如权利要求1所述的组织运输保存液的制备方法，包括步骤：按比例混合组分(a)、(b)、(c)和(d)，混合均匀，从而制得所述组织保存液。
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