CN106754676A - 用于保护脂肪组织的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离体脂肪保护剂，它由如下组分组成：生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素，前述各个组分配比依次为：500ml：500ml：(146.1mg～584.4mg)：125000U：125000U。本发明还公开了前述保护剂的制备方法和用途。本发明的保护剂可以有效降低脂肪组织培养干细胞的污染率，同时与不使用保护液相比，脂肪组织培养过程中，干细胞的生长速度更快，能够缩短原代细胞的培养时间，提高培养效率，节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及用于保护脂肪组织的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
人体脂肪组织中含有大量的脂肪干细胞(adipose tissue-derived cells，ADSC)，它是一种间充质细胞，可以自我更新，自我复制，并具有多向分化潜能，在体内和体外不同诱导因素下能够分化为脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、胰岛细胞等多种组织的细胞，同时，ADSC可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子，具有巨大的应用潜力。
2001年，Zuk等通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪组织中第一次分离得到了多向分化的干细胞，即脂肪干细胞。ADSC的优点在于：①分离方法简单，可操作性强；②ADSC在脂肪组织中含量高，获取率高达1％-2％，而骨髓干细胞仅有0.001％-0.002％，脂肪干细胞是骨髓干细胞的1 000倍；③体外扩增能力强，易于传代培养；④具有跨胚层分化能力；⑤免疫排斥低；⑥ADSC的来源——脂肪组织分布广泛；⑦通过吸脂术可轻易获得脂肪，患者痛苦小，供区损伤低等。因此，近年来ADSC一直是干细胞研究的热点，应用范围也非常广泛，例如，ADSC可以用于皮肤创面愈合，软骨损伤修复，神经功能修复和皮肤美容整形等方面。
ADSC来源于人体脂肪组织，通过吸脂术采集到的脂肪组织在体外经过培养并扩增获得满足临床实验应用的大量ADSC。传统方法是将采集到的脂肪组织直接放入无菌容器内，运送到实验室进行ADSC培养操作。但是吸脂术采集脂肪组织本身存在一定的细菌污染风险，有细菌污染就会导致ADSC培养失败，造成脂肪组织的浪费。实验的失败也造成实验试剂耗材的损失。而即使能够重新吸脂术采集脂肪也增加了患者的痛苦和身体的损伤，造成了时间和经济上的损失。另外，同样采用脂肪组织自然贴壁培养法培养ADSC，没有使用保护剂的脂肪组织培养的细胞形态好，活性强，增殖能力强，但耗时较长，培养基消耗较大，时间和经济成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种离体脂肪的保护剂及其制备方法和用途。
本发明离体脂肪保护剂，它由如下组分组成：生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素，前述各个组分配比依次为：500ml：500ml：(146.1mg～584.4mg)：125000U：125000U。
优选地，所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U。
优选地，所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。
本发明制备前述的保护剂的方法，步骤如下：按照前述配比取各组分，混匀，即可。
本发明还提供了前述的保护剂在离体脂肪组织的保护中的用途。
其中，所述用途是保护剂用于抑菌的用途。
其中，所述用途是保护剂用于促进细胞增殖的用途。
本发明还提供了一种离体脂肪组织的保存方法，取离体脂肪组织，与前述的保护剂混合，保存即可。
其中，所述保存是在4℃条件下保存。
生理盐水：为医用0.9％氯化钠注射液。
DMEM溶液：是美国HyClone公司生产商品化培养基，成分为：无水氯化钙116.6mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、亚油酸0.042mg/L、五水硫酸铜0.0013mg/L、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L、硫辛酸0.105mg/L、九水硝酸铁0.05mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚红8.1mg/L、七水硫酸亚铁0.417mg/L、L-苯丙氨酸35.48mg/L、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg/L、氯化钾311.8mg/L、L-丝氨酸26.25mg/L、丙酮酸钠55mg/L、氯化镁28.64mg/L、L-苏氨酸53.45mg/L、维生素H 0.0035mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、L-丙氨酸4.45mg/L、D-泛酸钙2.24mg/L、氯化钠6999.5mg/L、L-天门冬酰胺7.5mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、氯化胆碱8.98mg/L、无水磷酸二氢钠54.35mg/L、L-天门冬氨酸6.65mg/L、叶酸2.65mg/L、磷酸氢二钠71.02mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg/L、i-肌醇12.6mg/L、七水硫酸锌0.432mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、烟酰胺2.02mg/L、L-精氨酸盐酸盐147.5mg/L、L-脯氨酸17.25mg/L、盐酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、盐酸吡哆醇0.031mg/L、L-酪氨酸38.4mg/L、核黄素0.219mg/L、甘氨酸18.75mg/L、L-缬氨酸52.85mg/L、盐酸硫胺2.17mg/L、L-组氨酸盐酸盐31.48mg/L、D-葡萄糖3151mg/L、胸苷0.365mg/L、L-异亮氨酸54.47mg/L、次黄嘌呤2mg/L、维生素B12 0.68mg/L。
L－谷氨酰胺：左旋谷氨酰胺，化学名2-氨基-4-甲酰胺基丁酸。
本发明的保护剂可以长时间保护离体的脂肪组织，不仅可以有效的降低脂肪组织在培养干细胞初期的细菌污染率，而且用保护液中的脂肪组织分离提取的脂肪干细胞具有良好的活性，较好地保持其性状和分化潜能，增殖能力强，脂肪组织培养初期细胞生长速度快，缩短了脂肪干细胞培养的时间，节约了成本，具有良好的市场应用价值。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1本发明的保护剂配方组1培养中观察到的细胞生长形态
图2本发明的保护剂配方组2培养中观察到的细胞生长形态
图3本发明的保护剂配方组3培养中观察到的细胞生长形态
图4对照组培养中观察到的细胞生长形态
图5本发明的保护剂配方组1-组3以及对照组细胞生长曲线图
图6本发明的保护剂和对照组储存4h脂肪组织培养的细胞生长曲线图
图7本发明的保护剂和对照组储存8h脂肪组织培养的细胞生长曲线图
图8本发明的保护剂和对照组储存12h脂肪组织培养的细胞生长曲线图
图9本发明的保护剂和对照组储存24h脂肪组织培养的细胞生长曲线图
图10本发明的保护剂储存的脂肪组织培养的细胞生长形态
图11对照组的脂肪组织培养的细胞生长形态
图12本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CD90检测结果
图13本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CD105检测结果
图14本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CDHLA-DR检测结果
图15本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CD45检测结果
图16本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CD14/34/79a检测结果
图17本发明的保护剂储存的脂肪组织和对照组培养的细胞表面标志CD73检测结果
图18本发明的保护剂储存的脂肪组织培养的细胞成脂分化能力
图19本发明的保护剂储存的脂肪组织培养的细胞成脂分化能力
图20本发明的保护剂储存的脂肪组织培养的细胞成骨分化能力
图21本发明的保护剂储存的脂肪组织培养的细胞成骨分化能力
具体实施方式
主要仪器及试剂：
仪器：离心机Eppendorf 5810R、流式细胞仪Beckman FC500、细胞计数仪罗氏CASYModel77、倒置相差显微镜奥林巴斯CKX41、CO2培养箱Thermo8000、生物安全柜ESCO classⅡBSC、全自动微生物培养监测系统梅里埃BACT/ALERT 3D；
试剂：
0.9％氯化钠注射液(生理盐水)购自四川科伦药业股份有限公司生产
DMEM溶液购自HyClone公司
L－谷氨酰胺购自Sigam公司
青霉素购自辽宁科泰生物基因制药股份有限公司
链霉素购自四川省长征药业股份有限公司
人脂肪干细胞无血清培养基购自GIBCO公司
细胞培养皿和培养瓶购自Corning公司
0.25％胰酶-0.38g/L EDTA溶液购自GIBCO公司
0.04％台盼蓝染色液购自GIBCO公司
细菌培养瓶购自梅里埃公司
流式抗体CD90、CD73、CD105、CD14、CD34、CD79a、HLA-DR、CD45购自BD公司
人脂肪干细胞成骨分化试剂盒购自GIBCO公司
人脂肪干细胞成脂分化试剂盒购自GIBCO公司
茜素红S购自Sigam公司
油红O购自Sigam公司
实施例1本发明保护剂的制备及其用于离体脂肪的保护作用
一、制备本发明保护剂保存脂肪组织
如下表所示的配方，在无菌条件下将青霉素和链霉素溶解在氯化钠注射液中，然后加入L－谷氨酰胺使之溶解，再加入DMEM溶液，将混合液混匀，然后无菌分装至已灭菌的采集瓶内，每瓶30ml，加入采集的脂肪组织30ml。
本发明保护剂的配方
对照组不加保护剂保存脂肪组织30ml。
二、保护剂的抑菌实验
抑菌效果测定采用微量肉汤法，试验药物浓度最大为50μg(U)/ml，为实际药物浓度的一半。
微量肉汤稀释法步骤：根据计数结果，用常规的MH肉汤(营养肉汤)将增菌液稀释至105-106个/ml；
将混匀的菌液加至96孔板，每孔100μl；
在第一列分别加入保护液100μl，每批保护液两个，充分吹打混匀后吸取100μl至第二列，一直倍比稀释至第11列，37℃培养12-16h。
结果记录以无菌生长的最后一列对应的列数作为结果记录，以高浓度和低浓度都长菌为耐药，高浓度不长菌、低浓度长菌表示为中度抑菌，高浓度和低浓度都不长为高度抑菌。保护剂存储0天、15天和30天的抑菌效果的实验结果，如表1所示。3组保护剂配方的试验样本。
表1保护剂存放不同时间后的抑菌结果
备注：表中数字为0代表无抑菌性；数字<3为低度抑菌性；3≤数字<6为中度抑菌性；数字≥6为高度抑菌性。
上述实验结果显示，本发明的保护剂体存储存0天是均有高度抑菌性，；在4℃和20℃储存15天后，抑菌性较0天时虽都有所下降但仍然表现为高度抑菌性。在4℃和20℃储存30天后，抑菌性大都幅下降表现为中度抑菌，但仍均有抑菌性。
实验结果表明，本发明的3种配方配制的保护剂都具有较好地抑菌性，并且储存30天仍然具有中度及以上的抑菌性，能够起到减少细菌生长的较好效果。
三、保护剂对离体脂肪的保护作用
取装有本发明上述实施例1的3组配方保护剂30ml的无菌采集瓶和无保护剂的对照组，各10瓶分别通过吸脂术采集并装入30ml脂肪组织。4℃保存，分别在采集后4h、8h、12h和24h这4个保存时间段，每个时间段取出6ml脂肪组织用于培养脂肪干细胞。
培养方法：
1、将采集瓶中下层液体用吸管吸出，留下黄色脂肪组织，注意不要吸到黄色脂肪颗粒；
2、加入30ml生理盐水，震荡采集瓶，清洗脂肪组织，然后静置3分钟，待分层后用吸管吸出下层液体。反复重复此步骤，清洗3次；
3、将采集瓶中清洗后的脂肪组织取出，每3ml放入一个100mm2的培养皿中，用手术剪将脂肪组织剪成1mm3大小的碎块，均匀的铺在培养皿底部；
4、每个培养皿加入10ml人脂肪干细胞无血清培养基，然后将培养皿放置在37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养；
5、培养过程中，每3天用倒置显微镜观察细胞生长情况，并将培养上清液吸出，添加10ml新鲜的培养基。
细菌污染率检测：在培养第10天，将吸出的培养上清液加入细菌培养瓶中，然后将细菌培养瓶置于全自动微生物培养监测系统中培养。监测系统中培养7天后如果系统没有报告阳性结果，则将细菌培养瓶从系统中取出废弃。记录检测结果，并统计细菌污染率，如表2所示。
表2使用和未使用保护剂保护脂肪组织不同时间后的细菌污染结果
上述实验结果显示，存放在未装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织，细菌污染率高于存放在装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织。随着存放时间延长，细胞培养过程中细菌污染率增加，存放在未装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织培养的细胞24h细菌污染率达到了25％，而使用了保护剂后1-3组，只有组1的脂肪组织培养的细胞在24h细菌污染率为5％，大幅度降低了细菌污染率，提高了脂肪干细胞的培养成功率。
本发明保护剂用于离体脂肪保存时，随着保护剂中的L－谷氨酰胺用量的增加，抑菌效果增加，其中，L－谷氨酰胺用量为365.3mg时，在保存24h内就可以保证无细菌污染。
因此，本发明保护剂的配方有选为生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U；进一步有选为所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。
四、细胞生长实验
⑴实验方法：
取装有本发明上述实施例1的1-3组配方保护剂30ml的无菌采集瓶和无保护剂的对照组，分别通过吸脂术采集并装入30ml脂肪组织。4℃保存，在采集后4h开始制备培养脂肪干细胞。
①培养方法：
1、将采集瓶中下层液体用吸管吸出，留下黄色脂肪组织，注意不要吸到黄色脂肪颗粒；
2、加入30ml生理盐水，震荡采集瓶，清洗脂肪组织，然后静置3分钟，待分层后用吸管吸出下层液体。反复重复此步骤，清洗3次；
3、将采集瓶中清洗后的脂肪组织取出，每3ml放入一个100mm2的培养皿中，用手术剪将脂肪组织剪成1mm3大小的碎块，均匀的铺在培养皿底部；
4、每个培养皿加入10ml人脂肪干细胞无血清培养基，然后将培养皿放置在37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养；
5、培养过程中，每3天用倒置显微镜观察细胞生长情况，并将培养上清液吸出，添加10ml新鲜的培养基。
6、用倒置显微镜观察细胞生长情况，当观察到培养皿中细胞生长出来且汇合度达40％，将培养皿中上清液和脂肪组织吸出，注意不要吸到细胞。
7、加入1ml的0.25％胰酶-0.38g/L EDTA溶液消化细胞。
8、在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5ml培养基终止消化。
9、用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散。将细胞转移到15ml离心管中，1000rpm离心5min。
10、弃上清，加入10ml培养基重悬细胞。此时获得的细胞为P0代脂肪干细胞。
②细胞活率比较：
取将上述组1-组3以及对照组培养收获到的各3个皿的P0代细胞，用0.04％台盼蓝染色液染色，计数死细胞的数量，分别取平均值。计算得到收获的脂肪干细胞中活细胞的百分率，进行比较。
③细胞生长形态：
将上述收获到的组1-组3以及对照组的P0代细胞，按照1×104cells/cm2的细胞密度接种在T-75细胞培养瓶中，加入10ml培养基。将细胞培养瓶置于37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养。取生长到第3天的细胞进行显微镜下观察不同组别细胞生长的异同，并拍照。
④生长曲线对比：
组1-组3以及对照组，每组48个培养皿按上述培养方法操作。培养过程中，每天每组各取出3个培养皿按照步骤7-10收获每天生长出来的细胞，用细胞计数仪计数3个培养皿中细胞数量，取其平均值，进行生长曲线的绘制。没有计数的培养皿每3天更换一次培养基，当观察到培养皿中细胞生长汇合度达40％，进行步骤6-10收获P0代细胞。如果在第16天培养皿中细胞生长汇合度未达40％，仍然进行步骤6-10收获P0代细胞，并计数。
⑵实验结果：
①细胞活率比较
细胞活率结果如表3所示。
表3细胞活率比较
| 组1 | 组2 | 组3 | 对照组 | |
| 细胞活率 | 98.8％±0.4％(n＝3) | 99.0％±0.5％(n＝3) | 99.1％±0.6％(n＝3) | 99.0％±0.2％(n＝3) |
从表3中可以看出，上述组1-组3以及对照组中的脂肪组织培养出的脂肪干细胞的细胞活率没有明显差异。
②细胞生长形态
如图1～4所示，本发明的保护剂保护的脂肪组织在体外细胞培养过程中观察到的细胞形态，与对照组的细胞形态没有明显差异。细胞均呈梭形或纺锤形，细胞分布均一，折光度高，贴壁生长。
③生长曲线对比
组1-组3以及对照组，细胞培养过程中，每天每组各取出3个培养皿收获生长出来的细胞，用细胞计数仪计数3个培养皿中细胞数量，取其平均值，进行生长曲线的绘制。结果如表4和图5所示。
表4细胞计数生长曲线数据统计表
从表4和图5可以看出，对照组在细胞培养初期，细胞生长较慢，在培养第9天开始进入高速生长期，到第13天生长速度减慢，进入平台期。组1在细胞培养初期，细胞生长较快，细胞增值能力较强。在培养第8天开始进入高速生长期，到第13天生长速度减慢，进入平台期。组2-组3在细胞培养初期，细胞的适应性最好，生长最快，增值能力最强。在培养第6天开始进入高速生长期，到第10天生长速度减慢，进入平台期。
可以看出，从本发明保护剂处理的离体脂肪中得到的细胞，随着保护剂中L－谷氨酰胺用量的增加，生长速度加快，当L－谷氨酰胺用量达到365.3mg时，速度不再增加。
因此，本发明保护剂的配方有选为生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U；进一步有选为所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。
综上，采用本发明保护剂保存离体脂肪组织，可以有效抑菌，同时从本发明保护剂处理的离体脂肪中得到的细胞生长快，用于离体脂肪组织的保护效果优良。
实施例2本发明保护剂保护的脂肪组织用于培养细胞后的各性能检测
一、制备本发明的保护剂
按照实施例1组2的制备方法，在无菌条件下将青霉素和链霉素溶解在氯化钠注射液中，然后加入L－谷氨酰胺使之溶解，再加入DMEM溶液。将混合液混匀，配制成为每升中含有青霉素125000U、链霉素125000U、L－谷氨酰胺365.3mg、DMEM溶液500ml和氯化钠注射液500ml的混合溶液，然后无菌分装至已灭菌的采集瓶内，每瓶30ml。
二、脂肪干细胞生长实验
⑴实验方法：
以装有保护剂无菌采集瓶保存的脂肪组织为A组，没有装保护剂的无菌采集瓶保存的脂肪组织为对照组B组。分别通过吸脂术采集并装入30ml脂肪组织。4℃保存，分别在采集后4h、8h、12h和24h这4个保存时间段，开始制备培养脂肪干细胞。
①培养方法：
1、将采集瓶中下层液体用吸管吸出，留下黄色脂肪组织，注意不要吸到黄色脂肪颗粒；
2、加入30ml生理盐水，震荡采集瓶，清洗脂肪组织，然后静置3分钟，待分层后用吸管吸出下层液体。反复重复此步骤，清洗3次；
3、将采集瓶中清洗后的脂肪组织取出，每3ml放入一个100mm2的培养皿中，用手术剪将脂肪组织剪成1mm3大小的碎块，均匀的铺在培养皿底部；
4、每个培养皿加入10ml人脂肪干细胞无血清培养基，然后将培养皿放置在37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养；
5、培养过程中，每3天用倒置显微镜观察细胞生长情况，并将培养上清液吸出，添加10ml新鲜的培养基。
6、用倒置显微镜观察细胞生长情况，当观察到培养皿中细胞生长出来且汇合度达40％，将培养皿中上清液和脂肪组织吸出，注意不要吸到细胞。
7、加入1ml的0.25％胰酶-0.38g/L EDTA溶液消化细胞。
8、在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5ml培养基终止消化。
9、用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散。将细胞转移到15ml离心管中，1000rpm离心5min。
10、弃上清，加入10ml培养基重悬细胞。此时获得的细胞为P0代脂肪干细胞。
11、将P0代脂肪干细胞，按照1×104cells/cm2的细胞密度接种在T-75细胞培养瓶中，加入10ml培养基。将细胞培养瓶置于37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养。
12、每天用倒置显微镜观察细胞的生长情况，每3天更换10ml培养基。当培养瓶中细胞汇合度达80％，重复上述7-10步操作。此时获得的细胞为P1代脂肪干细胞。
②生长曲线对比：
在脂肪采集后4h、8h、12h和24h这4个保存时间段分为A1-A4组和B1-B4组，每组48个培养皿按上述培养方法1-10步操作培养。培养过程中，每天每组各取出3个培养皿按照步骤7-10收获每天生长出来的细胞，用细胞计数仪计数3个培养皿中细胞数量，取其平均值，进行生长曲线的绘制。没有计数的培养皿每3天更换一次培养基，当观察到培养皿中细胞生长汇合度达40％，进行步骤6-10收获P0代细胞。如果在第16天培养皿中细胞生长汇合度未达40％，仍然进行步骤7-10收获P0代细胞，并计数。
③细胞活率比较：
取将上述A组和B组收获到的P0代细胞，用0.04％台盼蓝染色液染色，计数死细胞的数量，采集后4h、8h、12h和24h这4个保存时间段各3皿，分别取平均值。计算得到收获的脂肪干细胞中活细胞的百分率，进行比较。
④细胞生长形态：
将上述收获到的A组和B组的P0代细胞，按照步骤11-12进行传代培养。取生长到第3天的细胞进行显微镜下观察不同组别细胞生长的异同，并拍照。
⑤表面标志检测：
取A组和B组的P0代细胞传代培养后，收获的P1代细胞，以FITC标记的CD90、CD73，PE标记的CD105、CD14、CD34、CD79a，PC5标记的HLA-DR以及PC7标记的CD45进行流式检测。
⑥细胞分化能力测试：
取A组和B组的P0代细胞传代培养后，收获的P1代细胞，分别以5000个/cm2的密度接种到6孔板中，待长至70％汇合度时，在培养基中加入成骨分化诱导培养基和成脂分化诱导培养基，每4天更换一次培养基，14天时分别用油红O染色对成脂分化细胞染色，大于21天用茜素红S对成骨分化细胞进行染色。
⑵实验结果：
①生长曲线对比
A1-A4组和B1-B4组，细胞培养过程中，每天每组各取出3个培养皿收获生长出来的细胞，用细胞计数仪计数3个培养皿中细胞数量，取其平均值，进行生长曲线的绘制。结果如表5和图6-9所示。
表5细胞计数生长曲线数据统计表
备注：A组为存放在装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织；B组为存放在未装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织，1-4分别为采集后4h、8h、12h和24h这4个脂肪组织保存时间段。
从表5和图6-9可以看出，有保护剂保护的脂肪组织在细胞培养初期，细胞生长更快，细胞增值能力更强，在培养第6天开始进入高速生长期，到第10天生长速度减慢，进入平台期。而没有保护剂的脂肪组织在细胞培养初期，细胞生长较慢，在培养第9天开始进入高速生长期，到第13天生长速度减慢，进入平台期。
②细胞活率比较
细胞活率结果如表6所示。
表6细胞活率比较
备注：A组为存放在装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织；B组为存放在未装有保护剂的采集瓶中的脂肪组织
从表6中可以看出，脂肪组织无论是否储存在保护剂中，其培养出的脂肪干细胞的细胞活率没有明显差异。
③细胞生长形态
如图10～11所示，A组和B组细胞传代培养后，显微镜下观察不同组别细胞的生长情况，观察到A组和B组细胞形态没有明显差异。细胞均呈梭形或纺锤形，细胞分布均一，折光度高，贴壁生长。
④表面标志检测
如图12～17所示，A组和B组细胞体外培养获得的脂肪干细胞通过流式细胞仪检测结果显示，细胞高表达CD90、CD105、CD73，而不表达CD14、CD34、CD79a、CD45、HLA-DR，两组检测结果一致，并且符合脂肪干细胞表面标志的特征。
⑤细胞分化能力测试
如图18～21所示，本发明的保护剂保护的脂肪组织体外培养获得的脂肪干细胞，经成脂分化诱导培养后出现大量的脂肪滴，油红O染色，表明细胞具有成脂分化能力。细胞经成骨分化诱导培养后出现钙堆积，茜素红S染色，表明细胞具有成骨分化能力。对照组细胞也出现相同结果，表明两组细胞具有相同的成脂、成骨分化能力。
实验结果说明，从本发明保护剂处理的离体脂肪中得到的脂肪干细胞，较好地保持其性状和分化潜能，同时增殖能力强，在细胞培养初期细胞能较快适应培养环境，细胞生长的速度更快，缩短了脂肪干细胞培养的时间，减少了培养基的消耗，节约资金。
综上所述，本发明的保护剂可以长时间保护离体的脂肪组织，不仅可以有效的降低脂肪组织在培养干细胞初期的细菌污染率，减少被采集者再次采集的痛苦，减少因污染造成的脂肪干细胞培养的损失，节约成本，而且用保护剂中的脂肪组织分离提取的脂肪干细胞具有良好的活性，较好地保持其性状和分化潜能，增殖能力强，在细胞培养初期细胞能较快适应培养环境，细胞生长的速度更快，缩短了脂肪干细胞培养的时间，减少了培养基的消耗，节约资金。因此，本发明的保护剂安全有效，配制成本较低，使用效果很好，节约成本，提高效率，使用非常方便，具有良好的推广应用前景。
Claims (9)
1.一种离体脂肪保护剂，其特征在于：它由如下组分组成：生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素，前述各个组分配比依次为：500ml：500ml：(146.1mg～584.4mg)：125000U：125000U。
2.根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于：所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U。
3.根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于：所述生理盐水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和链霉素的配比为：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。
4.一种制备权利要求1～3任意一项所述的保护剂的方法，其特征在于：步骤如下：按照权利要求1～3任意一项所述配比取各组分，混匀，即可。
5.权利要求1～3任意一项所述的保护剂在离体脂肪组织的保护中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述用途是保护剂用于抑菌的用途。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述用途是保护剂用于促进细胞增殖的用途。
8.一种离体脂肪组织的保存方法，其特征在于：取离体脂肪组织，与权利要求1～3任意一项所述的保护剂混合，保存即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述保存是在4℃条件下保存。
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