CN104928238A - 用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，该试剂盒包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；脂肪保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；脂肪洗涤液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBS；脂肪分解液为含胶原酶I0.75～2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；细胞洗涤液为PBS、D-Hanks或HBSS；细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基；细胞消化液为含Trypsin-EDTA1.25～2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液；细胞冻存液为含DMSO60～200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。

Description

用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒

 

技术领域

    本发明属于干细胞技术领域，涉及一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。

背景技术

 2001年，Zuk等发现在脂肪组织存在一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。

脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为干细胞领域备受关注的热点。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。脂肪间充质干细胞具有广阔的临床应用前景。因此，开发简单、快速、高新、安全获得大量脂肪间充质干细胞方法成为当务之急，而目前现有技术中还未有用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，使得相关科研工作进展缓慢。

发明内容

    本发明目的是为了弥补现有技术中存在的不足，提供一种使用方便，成本低廉的用于制备获得大量脂肪间充质干细胞的试剂盒。

    为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；

    所述脂肪保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；

所述脂肪洗涤液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBS；

所述脂肪分解液为含胶原酶I 0.75～2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；

所述细胞洗涤液为PBS、D-Hanks或HBSS；

所述细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ml及其添加物50ml组成，化学成分限定，含L-谷氨酰胺，不含酚红和抗生素；

所述细胞消化液为含Trypsin-EDTA 1.25～2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液；

所述细胞冻存液为含DMSO 60～200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。

    本发明提供了一种制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。该试剂盒中，脂肪保存液的作用是保证脂肪标本在采集之后的运输过程中的活性，并消灭和预防细菌、真菌。脂肪洗涤液的作用是洗涤除去脂肪组织的血液细胞，同时消灭和预防细菌、真菌。脂肪分解液的作用是消化脂肪组织，获得单细胞悬液。细胞洗涤液的作用是洗涤获得的干细胞。细胞培养液为无血清生长培养基，且化学成分限定，减少动物来源的病原体感染风险，培养脂肪间充质干细胞相对于使用胎牛血清而言更安全。细胞消化液的作用是细胞传代时，消化贴壁的间充质干细胞。细胞冻存液的作用是冻存获得的脂肪间充质干细胞。

本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，可在较短时间（3周内）获得大量脂肪间充质干细胞（细胞数量可达10⁹数量级），并且具有使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体感染风险，更安全的特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极为广泛。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所需试剂耗材及实验仪器等均可通过商业途径购得。

实施例一  用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用

一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备

1、溶液配置

   本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：

（1）脂肪保存液配置方法：青霉素（品牌Amresco，货号0242）200mg、链霉素（品牌Amresco，货号0382）200mg、两性霉素（品牌Amresco，货号E437）5mg，溶于1000ml DMEM培养基中0.22um过滤除菌即可。

（2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于1000ml生理盐水中0.22um过滤除菌即可。

（3）脂肪分解液配置方法：胶原酶I（品牌sigma，货号C0130）1 g溶于1000ml DMEM培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。

（4）细胞洗涤液配置方法： PBS，配方为NaCl 8.50g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，加双蒸水至1000ml，调整pH 至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。

（5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基 (品牌Lonza，货号 00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125)50ml混匀即可。

（6）细胞消化液配置方法：Trypsin（胰蛋白酶）0.25g，EDTA-2Na 19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS 100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。

（7）细胞冻存液配置方法：10ml DMSO（品牌sigma，货号D2650）缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。

2、各组分的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。

按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。

二、脂肪间充质干细胞的制备

现用步骤一的试剂盒制备脂肪间充质干细胞，具体制备方法包括以下步骤，以20ml脂肪为例，所有操纵步骤均在洁净工作台完成：

1、脂肪运输：采集20ml脂肪，加入等体积的脂肪保存液， 2～8℃恒温保存在疫苗箱中，48h内送至实验室。

2、洗涤脂肪：吸弃脂肪保存液，加入等体积脂肪洗涤液，反复振荡几次，静置后脂肪与脂肪洗涤液自然分层，吸弃脂肪洗涤液，同上，再加入等体积脂肪洗涤液振荡洗涤2～3次，至下层脂肪洗涤液澄清即可，吸弃脂肪洗涤液，获得脂肪。

3、消化脂肪：获得的脂肪加入等体积的脂肪分解液（预热到37℃），置于恒温振荡培养箱中，37℃，200rpm，消化30～60min，至脂肪呈靡状即可。

4、分离SVF（基质血管部分）：将消化后的靡状脂肪组织，700g离心10min，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液（注意在SVF沉淀上方留下少量的溶液以免扰动沉淀细胞），加入细胞洗涤液混匀，100um滤网过滤，吸取1ml悬液计数，为2.1×10⁷个，400g离心8min，弃上清，获得SVF。

5、细胞种植：根据SVF细胞数，按照1.0×10⁶个／ml的密度加入细胞培养液20ml，接种1个T175培养瓶，置于二氧化碳培养箱，培养条件： 37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%，每隔3d换液一次。

6、细胞传代：7d左右，原代培养细胞达70%～80%融合时，吸弃旧细胞培养液，加细胞洗涤液，静置1min，吸弃细胞洗涤液，加入细胞消化液，消化时间为1.5～2.5min，然后加入细胞培养液2～3ml中止消化，反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，细胞计数，为4.6×10⁷ 个，400g离心8min，弃上清，获得4.6×10⁷ 个P0代脂肪间充质干细胞。按照5.0×10⁵个/ml加入细胞培养液，接种到5个T175培养瓶，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代。待3d左右，P1代细胞达80%～90%融合时，同上操作，收获细胞，计数获得1.9×10⁸个P1代脂肪间充质干细胞，同上继续传代（每3～5天可传代一次），以此类推，直至收获P3代，经细胞计数为3.9×10⁹个脂肪间充质干细胞。

7、细胞冻存：将上述获得P3代细胞悬液，400g离心8min，弃上清，缓慢加入细胞冻存液，轻轻混匀，然后在冻存管上标明细胞名称、代数及冻存日期；放入冻存盒，-80℃冰箱过夜，次日转移到液氮长期保持，待使用时复苏即可。

可以看出，用本发明的试剂盒，在较短时间（3周内）内，由仅仅20ml脂肪，获得大量的脂肪间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。

实施例二  用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用

一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备

1、溶液配置

    本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：

（1）脂肪保存液配置方法：青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg，溶于1000ml DMEM/F12培养基0.22um过滤除菌分装即可。

（2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg，溶于1000ml 生理盐水0.22um过滤除菌分装即可。

（3）脂肪分解液配置方法：胶原酶I  2 g溶于1000ml DMEM/F12培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。

（4）细胞洗涤液配置方法：PBS，配方为NaCl 8.50g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，加双蒸水至1000ml，调整pH 至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。

（5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基 (品牌Lonza，货号 00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125)50ml混匀即可。

（6）细胞消化液配置方法：Trypsin 125mg，EDTA-2Na 9.864mg溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS 100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。

（7）细胞冻存液配置方法：10ml DMSO缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。

2、各组分的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。

按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。

二、脂肪间充质干细胞的制备

用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到3.8×10⁹个脂肪间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。

实施例三  用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用

一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备

1、溶液配置

    本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：

（1）脂肪保存液配置方法：青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素2.5mg，溶于1000ml DMEM培养基0.22um过滤除菌分装即可。

（2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素2.5mg，溶于1000ml 生理盐水0.22um过滤除菌即可。

（3）脂肪分解液配置方法：胶原酶I 2 g溶于1000ml DMEM培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。

（4）细胞洗涤液配置方法： PBS，配方为NaCl 8.50g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，加双蒸水至1000ml，调整pH 至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。

（5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基 (品牌Lonza，货号 00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125)50ml混匀即可。

（6）细胞消化液配置方法：Trypsin 0.25g，EDTA-2Na 19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS 100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。

（7）细胞冻存液配置方法：15ml DMSO缓慢加入到85ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。

2、各组分的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。

按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。

二、脂肪间充质干细胞的制备

用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.1×10⁹个脂肪间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。

实施例四  用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用

一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备

1、溶液配置

    本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：

（1）脂肪保存液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于1000ml RPMI-1640培养基中0.22um过滤除菌分装即可。

（2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于1000ml 生理盐水0.22um过滤除菌分装即可。

（3）脂肪分解液配置方法：胶原酶I 1.5g溶于1000ml RPMI-1640培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。

（4）细胞洗涤液配置方法：HBSS，配方NaCl 8.0 g、KCl 0.4 g、葡萄糖1 g、KH₂PO₄ 60 mg、Na₂HPO₄ 47.5 mg、NaHCO₃ 0.35g，加双蒸水至1000ml，调节PH至中性7.2-7.4之间，高压灭菌即可。

（5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基 (品牌Lonza，货号 00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125)50ml混匀即可。

（6）细胞消化液配置方法：Trypsin 0.25g，EDTA-2Na 19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液即HBSS 100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。

（7）细胞冻存液配置方法：10ml DMSO 缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。

2、各组分的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。

按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。

二、脂肪间充质干细胞的制备

用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.2×10⁹个脂肪间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。

实施例五  用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用

一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备

1、溶液配置

    本发明的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂

（1）脂肪保存液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于1000ml DMEM培养基中， 0.22um过滤除菌，分装即可。

（2）脂肪洗涤液配置方法：青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于1000ml生理盐水中，0.22um过滤除菌，分装即可。

（3）脂肪分解液配置方法：胶原酶I 1.5 g溶于1000ml DMEM培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。

（4）细胞洗涤液配置方法：D-Hanks，配方KCl 0.40g，KH₂PO₄ 0.06g，NaCl 8.00g，NaHCO₃ 0.35g，Na₂HPO₄·12H₂O              0.12g，加三蒸水至1000ml，调整pH 至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。

（5）细胞培养液配置方法：无血清基础培养基 (品牌Lonza，货号 00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125)50ml混匀即可。

（6）细胞消化液配置方法：Trypsin 0.25g，EDTA-2Na 19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液即D-Hanks 100ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。

（7）细胞冻存液配置方法：10ml DMSO缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。

2、各组分的分装

试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为脂肪保存液1瓶（50ml/瓶），脂肪洗涤液1瓶（250ml/瓶），脂肪分解液1瓶（50ml/瓶），细胞洗涤液3瓶（250ml/瓶），细胞培养液4瓶（250ml/瓶），细胞消化液1瓶（50ml/瓶），细胞冻存液1瓶（50ml/瓶）。

按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内或者37℃水浴解冻，解冻之后4℃保存，一个月内用完。

二、脂肪间充质干细胞的制备

用步骤一的试剂盒，参考实施例一中方法制备脂肪间充质干细胞，并用相同的方法对获得的间充质干细胞进行计数，结果20ml脂肪，在3周内扩增得到4.4×10⁹个脂肪间充质干细胞，表明本发明的试剂盒可以在较短时间内获得大量脂肪间充质干细胞。

Claims (1)

1.一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，其特征在于：包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；

    所述脂肪保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；

所述脂肪洗涤液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBS；

所述脂肪分解液为含胶原酶I 0.75～2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；

所述细胞洗涤液为PBS、D-Hanks或HBSS；

所述细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ml及其添加物50ml组成；

所述细胞消化液为含Trypsin-EDTA 1.25～2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液；

所述细胞冻存液为含DMSO 60～200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。