CN104450616A - 一种dc细胞与cik细胞的共培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，属于细胞培养技术领域。包括步骤：1）提取单个核细胞、2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养、5）扩增培养。本发明是一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，在DC细胞刺激成熟，并与CIK细胞共培养之后，按浓度来添加因子GM-CSF，并在培养12小时后，补加因子GM-CSF，从而保持DC细胞活性，延长DC细胞在CIK培养体系中的生存期，长时间保持DC细胞的活性。
Description
技术领域
一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
CIK生物免疫治疗作为21世纪治疗肿瘤的首选方案，广泛用于各种实体瘤的治疗。CIK生物免疫治疗具备：1）增殖，可以在短时间内大量扩增；2）CIK细胞来源于自身对人体没有任何毒副作用；3）杀瘤谱广，对绝大多数肿瘤都具备杀伤效力；4）杀瘤活性高，且不受CSA、FK506等免疫抑制剂的影响；5）可有效抵抗肿瘤细胞引发的凋亡机制。树突状细胞,简称DC细胞, 是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，增殖细胞毒性T淋巴细胞CTL，从而介导强大的特异性抗肿瘤细胞免疫。
DC细胞是机体免疫应答的始动者，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应；CIK细胞可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残余病灶，所以负载肿瘤抗原的DC与CIK的有机结合,即DC-CIK细胞,能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应。DC细胞与CIK细胞共培养后，提高了细胞的增殖速度和杀伤活性，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。然而，现有的DC-CIK共培养，是将收获的DC细胞添加到CIK培养体系中，从而通过DC细胞与CIK细胞的结合，将DC细胞携带的抗原信息提成给CIK细胞；但是CIK的培养环境不利于DC细胞的生长，不能有效的长时间维持DC细胞的活性，从而影响DC细胞提呈抗原的效率。DC细胞成熟慢、生存期短，CIK细胞的扩增培养时间较长，两种细胞共培养后存在培养时间不同步的问题，导致所获的DC-CIK细胞活性降低。目前迫切需要一种可延长DC细胞生存期的DC-CIK共培养方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，该方法可明显延长DC细胞的生存期，长时间保持DC细胞的活性。
本发明的技术方案为，该DC细胞与CIK细胞的共培养方法，由如下步骤组成： 1）提取单个核细胞、2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养、5）扩增培养；
其中，步骤4）DC细胞和CIK细胞混合培养具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心，弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液，并对一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液，并对二次重悬细胞液进行取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50 ~100ng/ml的浓度向培养体系中补加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养。
优选的，所述步骤1）提取细胞采用如下操作：
1.1）转移外周血：采集患者50~80ml 外周血，并转移到无菌离心管中，平均每管20~40ml ；
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的5~20ml 人淋巴细胞分离液的无菌离心管中，配平后进行离心；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现分层，吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5毫米处；将红细胞层之上的所有液体转移至无菌离心管中，按细胞悬液与生理盐水体积比1：1向无菌离心管中补充生理盐水，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）无菌离心管中所得的细胞进行离心，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将所得细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，离心，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：将所得细胞收集到一支离心管中，补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，离心，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
优选的，所述步骤2）CIK细胞培养具体操作如下：
2.1）接种细胞：使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到4.0×106～6.0×106个/ml，接种至培养瓶中，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养1~2小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃多次使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，并收集残留非贴壁细胞于无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）培养瓶中加入25~30ml 培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的DC前体细胞取样计数，用培养基调整细胞密度至1.0～2.0×106/ml 接种到培养瓶中，加入因子IFN-γ混匀，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
2.5）上述悬浮细胞在经过24小时的培养后，向培养瓶中加入因子IL-2、IL-1α、抗CD3单抗，此后所培养的细胞即为CIK细胞。
优选的，所述步骤3）DC细胞培养具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入无菌离心管中，离心，弃上清液，获得细胞沉淀；用15ml 培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
3.2）贴壁细胞培养至第5天时进行第二次换液，方法同上，在加入新鲜培养基后，加入因子GM-CSF、IL-4和TNF-α，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
3.3）贴壁细胞培养第6~7天，在显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
优选的，所述步骤5）扩增培养采用如下方法：每2~3天1：1补加培养基并补加因子IL-2，细胞培养至第14~16天，即可停止培养。
优选的，所述的步骤1.2）血样加入方法为：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5 cm处，让第一滴血样延管壁滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后转动离心管的同时加入血样。
优选的，所述的步骤4.4）中吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50ng/ml的浓度向培养体系中补加2500ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5% 的CO2培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5% 的CO2培养箱继续培养。
对本发明的技术方案的说明如下：
上述各步骤2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养中所述的所有培养基均选自LONZA品牌的x-vivoTM 15培养基；所述T150培养瓶所表示的意思是：培养瓶底部规格为150 cm2的培养瓶，无菌、无热源、一次性使用，其最大液体量为175ml 。
取样计数：将细胞悬液用生理盐水稀释两倍后滴入血细胞计数板上，低倍显微镜下统计四个大格的细胞数；细胞悬液的细胞数= (四个大格子细胞数和/4) ×2×104；本发明中重悬细胞中，重悬就是“重新悬浮”，具体操作是用生理盐水或培养基将离心或沉降等方法得到的细胞重新悬浮。
因子GM-CSF：为人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，由原核表达系统（E.coli）重组表达制备，该蛋白由127个氨基酸残基组成的非糖基化的多肽链，分子量15.5kDa，带GST标签。其作用为刺激粒细胞及巨噬细胞等白细胞的增殖、分化及活化作用，从而增强造血功能。它也能增强中性粒细胞，嗜曙红细胞及单核细胞的多种功能。它还能促使效应细胞增强如吞噬细菌及消灭癌细胞等免疫活动；
步骤1）提取细胞的作用是：提取的单个核细胞中包含DC前体细胞，可以将其诱导成为DC细胞；也包含T淋巴细胞，可将其诱导成为CIK细胞；
步骤2）CIK细胞培养的作用是：细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞，是一种非特异性细胞免疫，其最主要的效应细胞为CD3+ CD56+细胞；步骤2.2）所述晃动洗涤多次的停止标准为：将每次洗涤后的废液在倒置显微镜下观察，直至悬浮细胞低于5%时停止洗涤。
步骤3）DC细胞培养作用是：成熟的DC细胞可以提呈肿瘤抗原信息给CIK细胞，同时增加CIK细胞的数量以及CD3+ CD56+双阳细胞比例；
步骤4）DC细胞和CIK细胞混合培养的作用是：利用DC细胞对CIK细胞刺激增殖作用，增加双阳细胞比例，增加CIK细胞的细胞数；4.4）所述吸取1.0×106个DC细胞是从步骤4.3）产物中吸取，步骤4.4）所述吸取1.0×108个CIK细胞是从步骤2.5）产物中吸取。步骤4.2）和4.3）中取样计数的目的是便于步骤4.4）中准确定吸取的细胞个数。
步骤5）停止操作的标准为在倒置显微镜下观察时发现数量占80%以上的细胞形态为贴壁紧密的细长梭形，即可停止扩增培养。
申请在研究中发现，正是由于DC细胞与CIK细胞在混合培养后，CIK细胞的培养环境不适合DC细胞的存活，DC细胞活性下降，从而导致抗原提呈效率不高，CIK被激活效率降低。那么本发明的目的就是在DC细胞与CIK细胞共培养后，如何延长DC细胞的生存期，长时间保持其活性，从而更好的刺激CIK细胞增殖以及刺激CIK细胞中最主要的效应细胞，即双阳细胞的比例增加。
现有DC-CIK共培养，其GM-CSF的使用是在单独培养DC细胞时添加的，其在刺激成熟后，就不再使用因子GM-CSF。而本发明是在DC细胞刺激成熟，并与CIK细胞共培养之后，按照浓度来添加因子GM-CSF，从而保持DC细胞活性，延长DC细胞在CIK培养体系中的生存期。故现有培养方法与本发明不同，获得的技术效果也不同，因此两者没有关系。
与现有技术相比，本发明的DC细胞与CIK细胞的共培养方法所具有的有益效果是：通过对DC细胞生存期延长和活性的提高，从而增加CIK细胞数量，同时提高CD3+CDC6+双阳细胞比例，双阳细胞是CIK最主要的效应细胞，CIK细胞总数增加以及双阳细胞的比例提高了，均有利于提高CIK细胞杀伤肿瘤细胞的效率；与现有技术中混合培养后不添加因子GM-CSF的方式相比，采用本发明的培养方法中混合培养体系在添加了因子GM-CSF后，在第14天无论细胞总数还是双阳细胞比例，都有一个明显的增幅。本发明的DC细胞与CIK细胞的共培养方法可明显延长DC细胞的生存期，长时间保持DC细胞的活性，以提高CIK细胞的增殖速度和杀伤活性，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。
附图说明
图1为实施例1的细胞流式表型图。
图2为实施例2的细胞流式表型图。
图3为实施例3的细胞流式表型图。
图4为实施例4的细胞流式表型图。
图5为对比例1的细胞流式表型图。
具体实施方式
实施例1~4 是本发明的一种管状织物的织造方法的具体实施例，其中实施例1为最佳实施例。
实施例1
1）提取细胞，具体操作如下：
1.1）转移外周血：采集患者70ml外周血，并转移到两个50ml 离心管中，平均每管35ml ；
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的20ml 人淋巴细胞分离液的50ml 无菌离心管中。方法如下：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5 cm处，让第一滴血样延管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后缓慢匀速转动离心管，同时匀速缓慢加入血样，配平后离心500 g，30 min，RT，慢升慢降；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米处。小心将红细胞层之上的所有液体转移至50ml 无菌离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水体积比1：1，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）中获得的细胞离心400 g， 10 min，RT，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，转速为1000转每分钟，离心8分钟，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，转速为1000转每分钟，离心8分钟，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
2）CIK细胞培养，具体操作如下：
2.1）接种细胞：根据计数结果，用x-vivo培养基，将步骤1.6中所提取获得的外周血单个核细胞调整到4.0×106～5.0×106个外周血单个核细胞/ml，接种至T150培养瓶中；放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下培养1小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃2~5次，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至50ml 无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，晃动洗涤多次的停止标准为：将每次洗涤后的废液在倒置显微镜下观察，直至悬浮细胞低于5%时停止洗涤；收集残留非贴壁细胞于50ml 无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）T150培养瓶中加入25ml的x-vivo培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的悬浮细胞计数，根据计数结果，用培养基调整细胞密度至1.0～1.5×106/ml 接种到T175培养瓶中，加入因子IFN-γ，混匀。置二氧化碳培养箱培养37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5.0％，并填写培养记录；
2.5）培养24小时后，按培养瓶中CIK培养基体积向悬浮培养细胞中加入因子IL-2、IL-1a、抗CD3单抗，所获的细胞即为CIK细胞。
3）DC细胞培养，具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，300 g，10 min，RT条件下离心，弃上清液；用15ml x-vivo培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱培养；
3.2）贴壁细胞培养第5天，每瓶小心吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，离心300g，12min，RT弃上清液，以每瓶15ml 的培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，并按最终培养体积补充因子GM-CSF、IL-4和TNF-a，置37℃、体积分数5% CO2的二氧化碳培养箱培养；
3.3）贴壁细胞培养第6天或第7天，在显微镜下观察细胞，数量在85%以上的细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
4）DC细胞和CIK细胞混合培养，具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至50ml 无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至50ml 无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心15分钟；离心后弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含生理盐水的一次重悬细胞液，混匀后，留取0.5ml 一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含培养基的二次重悬细胞液，混匀，留取0.5ml 一次重悬细胞液，取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50ng/ml的浓度向培养体系中补加2500ng的因子GM-CSF，然后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下培养；培养12小时后，再次添加2500ng的因子GM-CSF，放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下培养。
5）根据细胞培养状态，每2天按体积比1：1补加培养基，然后再补加因子IL-2，摇匀后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下继续培养；细胞培养第14天，细胞技术，并送检流式，检测CD3+ CD56+双阳细胞比例。
实施例2
1）提取细胞，具体操作如下：
1.1）转移外周血：采集患者50ml 外周血，并转移到两个50ml 离心管中，平均每管25ml ；
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的15ml人淋巴细胞分离液的50ml 无菌离心管中。方法如下：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5cm处，让第一滴血样延管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后缓慢匀速转动离心管，同时匀速缓慢加入血样，配平后离心500 g，30 min，RT，慢升慢降；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米处。小心将红细胞层之上的所有液体转移至50ml 无菌离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水体积比为1：1，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）中获得的细胞400 g，离心10 min，RT，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，转速为1200转每分钟，离心8分钟，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，转速为1200转每分钟，离心8分钟，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
2）CIK细胞培养，具体操作如下：
2.1）接种细胞：根据计数结果，用x-vivo培养基，将步骤1.6中所提取获得的外周血单个核细胞调整到5.0×106～6.0×106个外周血单个核细胞/ml，接种至T150培养瓶中；放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养1小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃2~5次，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至50ml 无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，晃动洗涤多次的停止标准为：将每次洗涤后的废液在倒置显微镜下观察，直至悬浮细胞低于5%时停止洗涤；收集残留非贴壁细胞于50ml 无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）T150培养瓶中加入30ml的x-vivo培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的悬浮细胞计数，根据计数结果，用培养基调整细胞密度至1.5～2.0×106/ml 接种到T175培养瓶中，加入因子IFN-γ，混匀。置二氧化碳培养箱培养37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5.0％，并填写培养记录；
2.5）培养24小时后，按培养瓶中CIK培养基体积向悬浮培养细胞中加入因子IL-2、IL-1a、抗CD3单抗，所获的细胞即为CIK细胞。
3）DC细胞培养，具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，300 g，10 min，RT条件下离心，弃上清液；用15ml x-vivo培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱培养；
3.2）贴壁细胞培养第5天，每瓶小心吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，离心300g，12min，RT弃上清液，以每瓶15ml 的培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，并按最终培养体积补充因子GM-CSF、IL-4和TNF-a，置37℃、体积分数5% CO2的二氧化碳培养箱培养；
3.3）贴壁细胞培养第6天或第7天，在显微镜下观察细胞，数量在80%以上的细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
4）DC细胞和CIK细胞混合培养，具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至50ml 无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至50ml 无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心后弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含生理盐水的一次重悬细胞液，混匀后，留取0.5ml 一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含培养基的二次重悬细胞液，混匀，留取0.5ml 一次重悬细胞液，取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照70ng/ml的浓度向培养体系中补加3500ng的因子GM-CSF，然后放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养；培养12小时后，再次添加3500ng的因子GM-CSF，放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养。
5）根据细胞培养状态，每2天按体积比1：1补加培养基，然后再补加因子IL-2，摇匀后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下继续培养；细胞培养第14天，细胞技术，并送检流式，检测CD3+ CD56+双阳细胞比例。
实施例3
1）提取细胞，具体操作如下：
1.1）转移外周血：采集患者78ml外周血，并转移到三个50ml 离心管中，平均每管26ml。
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的10ml 人淋巴细胞分离液的50ml 无菌离心管中。方法如下：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5 cm处，让第一滴血样延管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后缓慢匀速转动离心管，同时匀速缓慢加入血样，配平后离心500 g，30 min，RT，慢升慢降；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米处。小心将红细胞层之上的所有液体转移至50ml 无菌离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水体积比为1：1，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）中获得的细胞400 g，离心10 min，RT，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，转速为1000~1200转每分钟，离心8~10分钟，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，转速为1100转每分钟，离心10分钟，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
2）CIK细胞培养，具体操作如下：
2.1）接种细胞：根据计数结果，用x-vivo培养基，将步骤1.6中所提取获得的外周血单个核细胞调整到4.5×106～5.5×106个外周血单个核细胞/ml，接种至T150培养瓶中；放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下培养2小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃2~5次，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至50ml 无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，晃动洗涤多次的停止标准为：将每次洗涤后的废液在倒置显微镜下观察，直至悬浮细胞低于5%时停止洗涤；收集残留非贴壁细胞于50ml 无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）T150培养瓶中加入30ml的x-vivo培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的悬浮细胞计数，根据计数结果，用培养基调整细胞密度至1.0～1.5×106/ml 接种到T175培养瓶中，加入因子IFN-γ，混匀。置二氧化碳培养箱培养37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5.0％，并填写培养记录；
2.5）培养24小时后，按培养瓶中CIK培养基体积向悬浮培养细胞中加入因子IL-2、IL-1a、抗CD3单抗，所获的细胞即为CIK细胞。
3）DC细胞培养，具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，300 g，10 min，RT条件下离心，弃上清液；用15ml x-vivo培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱培养；
3.2）贴壁细胞培养第5天，每瓶小心吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，离心300g，12min，RT弃上清液，以每瓶15ml 的培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，并按最终培养体积补充因子GM-CSF、IL-4和TNF-a，置37℃、体积分数5% CO2的二氧化碳培养箱培养；
3.3）贴壁细胞培养第6天或第7天，在显微镜下观察细胞，数量在80%以上的细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
4）DC细胞和CIK细胞混合培养，具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至50ml 无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至50ml 无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心20分钟；离心后弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含生理盐水的一次重悬细胞液，混匀后，留取0.5ml 一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含培养基的二次重悬细胞液，混匀，留取0.5ml 一次重悬细胞液，取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照85ng/ml的浓度向培养体系中补加4250ng的因子GM-CSF，然后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下培养；培养12小时后，再次添加4250ng的因子GM-CSF，放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养。
5）根据细胞培养状态，每2天按体积比1：1补加培养基，然后再补加因子IL-2，摇匀后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下继续培养；细胞培养第14天，细胞技术，并送检流式，检测CD3+ CD56+双阳细胞比例。
实施例4
1）提取细胞，具体操作如下：
1.1）转移外周血：采集患者60ml 外周血，并转移到三个50ml 离心管中，每管20ml ；
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的20ml 人淋巴细胞分离液的50ml 无菌离心管中。方法如下：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5 cm处，让第一滴血样延管壁缓慢自然滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后缓慢匀速转动离心管，同时匀速缓慢加入血样，配平后离心500 g，30 min，RT，慢升慢降；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米处。小心将红细胞层之上的所有液体转移至50ml 无菌离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水体积比为1：1，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）中获得的细胞400 g，离心10 min，RT，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，转速为1000转每分钟，离心10分钟，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，转速为1200转每分钟，离心8分钟，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
2）CIK细胞培养，具体操作如下：
2.1）接种细胞：根据计数结果，用x-vivo培养基，将步骤1.6中所提取获得的外周血单个核细胞调整到4.0×106～5.0×106个外周血单个核细胞/ml，接种至T150培养瓶中；放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养1.5小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃2~5次，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至50ml 无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，晃动洗涤多次的停止标准为：将每次洗涤后的废液在倒置显微镜下观察，直至悬浮细胞低于5%时停止洗涤；收集残留非贴壁细胞于50ml 无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）T150培养瓶中加入25ml的x-vivo培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的悬浮细胞计数，根据计数结果，用培养基调整细胞密度至1.5～2.0×106/ml 接种到T175培养瓶中，加入因子IFN-γ，混匀。置二氧化碳培养箱培养37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5.0％，并填写培养记录；
2.5）培养24小时后，按培养瓶中CIK培养基体积向悬浮培养细胞中加入因子IL-2、IL-1a、抗CD3单抗，所获的细胞即为CIK细胞。
3）DC细胞培养，具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入50ml无菌离心管中，300g，10 min，RT条件下离心，弃上清液；用15ml x-vivo培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2二氧化碳培养箱培养；
3.2）贴壁细胞培养第5天，每瓶小心吸取15ml 培养基，移入50ml 无菌离心管中，离心300g，12min，RT弃上清液，以每瓶15ml 的培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，并按最终培养体积补充因子GM-CSF、IL-4和TNF-a，置37℃、体积分数5% CO2的二氧化碳培养箱培养；
3.3）贴壁细胞培养第6天或第7天，在显微镜下观察细胞，数量在80%以上的细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
4）DC细胞和CIK细胞混合培养，具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至50ml 无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至50ml 无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心后弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含生理盐水的一次重悬细胞液，混匀后，留取0.5ml 一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液；使用移液管吸取10ml 含培养基的二次重悬细胞液，混匀，留取0.5ml 一次重悬细胞液，取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照100ng/ml的浓度向培养体系中补加5000ng的因子GM-CSF，然后放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养；培养12小时后，再次添加5000ng的因子GM-CSF，放入二氧化碳培养箱37℃，6%CO2体积分数条件下培养。
5）根据细胞培养状态，每2天按体积比1：1补加培养基，然后再补加因子IL-2，摇匀后放入二氧化碳培养箱37℃，5%CO2体积分数条件下继续培养；细胞培养第14天，细胞技术，并送检流式，检测CD3+ CD56+双阳细胞比例。
对比例1
对比例1步骤1）~6）与实施例1相同，但步骤4）DC细胞与CIK细胞混合培养后，不再添加因子GM-CSF，培养12小时后，也不再补加因子GM-CSF。
性能测试
检测方法：采用荧光素标记的单克隆抗体及流式细胞仪检测细胞抗原的表达，细胞大小，细胞内颗粒多少，从而识别正常与异常细胞；单克隆抗体和配套试剂为美国BD公司试剂，仪器采用美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，分析采用CellQuest Pro软件；测试项目的定义、测试方法和衡量标准如下所示，测试结果见表1~2。
表中“14d细胞数”的计算是培养到14天以后，混匀细胞悬液，取样1ml 稀释100倍，将稀释后的细胞悬液加入计数板，显微镜下计算四个区域细胞总数，通过公式，即可计算出细胞总数；DC细胞对CIK的增殖有促进作用，DC细胞在CIK培养体系作用的时间越长，对CIK的增殖促进作用越明显。
“增殖倍数”是用14天收获的细胞总数除以初始培养细胞数，即可获得经过14天培养后细胞增殖倍数，通过增殖倍数的对比，来验证新型DC-CIK共培养技术对CIK绝对数量的增殖；“14d活性”在经过14天培养结束，细胞用于治疗前，对细胞活性进行检测；方法是通过台盼蓝染色，活的细胞由于有细胞膜的保护而不被染色，死细胞由于细胞膜失去选择滤过性而被染成蓝色，通过计算活、死细胞的比例来计算细胞活性。
“双阳比例”是CD3+ CD56+双阳细胞占CIK细胞的比例，是将细胞悬液混匀后，取样1ml ，210 g，5 min离心去上清，用生理盐水重悬后通加入CD3+抗体和CD56+抗体避光孵育，通过流式细胞仪检测细胞表面标记物，统计同时表达CD3+ CD56+的细胞占所有的数量百分比。
以上测试项目的衡量标准：表中数值的增减说明了不同DC-CIK共培养方法，实施例“14d细胞数”越多，对应的“增殖倍数”越大，双阳细胞比例越大，都可以说明DC细胞起到的作用越大，对应的DC-CIK共培养方法越科学。
表1 实施例和对比例性能测试结果
；
表1分析：通过实施例1~4 和对比例1可以看出：对比例1在步骤4）中不添加因子GM-CSF，其所测得的“14d细胞数”“ 增殖倍数”和“双阳比例”检测结果，与实施例1~4相比，均有明显下降。可证明本发明步骤4）中的因子GM-CSF添加方式具有“延长DC细胞的生存期，长时间保持DC细胞的活性”的效果。
附图分析：图1~5中横轴所表示的是CD3分子的表达，正坐标表示CD3+，负坐标表示CD3；纵轴表示的是CD56分子的表达，正坐标轴表示CD56+，负坐标轴表示CD56；图1~5中 “Quad%Gade”所表示的是各象限的数量百分比；“UL”表示第二象限（ +）、“UR”表示第一象限（+ +）、“ LL”表示第三象限（ ）、“ LR”表示第四象限（+ ）。
细胞流式表型图中每一个点代表一个细胞，流式检测其实就是选定一群细胞后，根据分子是否表达来统计每种细胞所占数量的百分比。
CD3+CD56+双阳细胞流式表型图中，第一象限（+ +）黑点越多，表示同时表达CD3+和CD56+的细胞越多，其百分比即为双阳细胞所占的比例。
申请人对照实施例1~4和对比例1的附图可看出：按照以上对“14d细胞数”“ 增殖倍数”“14d活性”和“双阳比例”衡量标准分析，本发明的一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法中对于“因子GM-CSF的添加时间和50~100ng/ml添加量的限定”的技术方案，在“延长DC细胞的生存期，长时间保持DC细胞的活性”方面可以获得实质性的技术效果，具有重要意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例；但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于，由如下步骤组成： 1）提取单个核细胞、2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养、5）扩增培养；
其中，步骤4）DC细胞和CIK细胞混合培养具体操作如下：
4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；
4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心，弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液，并对一次重悬细胞液进行取样计数；
4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml 培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液，并对二次重悬细胞液进行取样计数；
4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50 ~100ng/ml的浓度向培养体系中补加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养。
2.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤1）提取细胞采用如下操作：
1.1）转移外周血：采集患者50~80ml 外周血，并转移到无菌离心管中，平均每管20~40ml ；
1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的5~20ml 人淋巴细胞分离液的无菌离心管中，配平后进行离心；
1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现分层，吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5毫米处；将红细胞层之上的所有液体转移至无菌离心管中，按细胞悬液与生理盐水体积比为1：1向无菌离心管中补充生理盐水，混匀；
1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）无菌离心管中所得的细胞进行离心，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；
1.5）洗涤Ⅱ：将所得细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，离心，弃上清液；
1.6）洗涤Ⅲ：将所得细胞收集到一支离心管中，补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，离心，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。
3.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤2）CIK细胞培养具体操作如下：
2.1）接种细胞：使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到4.0×106～6.0×106个/ml，接种至培养瓶中，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养1~2小时；
2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃多次使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，并收集残留非贴壁细胞于无菌离心管中；
2.3）向步骤2.2）培养瓶中加入25~30ml 培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO2培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；
2.4）将收集到的DC前体细胞取样计数，用培养基调整细胞密度至1.0～2.0×106/ml 接种到培养瓶中，加入因子IFN-γ混匀，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
2.5）上述悬浮细胞在经过24小时的培养后，向培养瓶中加入因子IL-2、IL-1α、抗CD3单抗，此后所培养的细胞即为CIK细胞。
4.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤3）DC细胞培养具体操作如下：
3.1）在DC前体细胞培养至3天时需进行换液，以保证其营养充足；用移液管每瓶吸取15ml 培养基，移入无菌离心管中，离心，弃上清液，获得细胞沉淀；用15ml 培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，缓慢贴壁加入培养瓶中，加入因子GM-CSF和IL-4，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
3.2）贴壁细胞培养至第5天时进行第二次换液，方法同上，在加入新鲜培养基后，加入因子GM-CSF、IL-4和TNF-α，置于37℃、体积分数5~6% 的CO2培养箱继续培养；
3.3）贴壁细胞培养第6~7天，在显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养。
5.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤5）扩增培养采用如下方法：每2~3天1：1补加培养基并补加因子IL-2，细胞培养至第14~16天，即可停止培养。
6.根据权利要求2所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述的步骤1.2）血样加入方法为：用10ml 的移液管吸取血样，伸至人淋巴细胞分离液液面上方的0.5 cm处，让第一滴血样延管壁滑落铺至人淋巴细胞分离液液面上，然后转动离心管的同时加入血样。
7.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述的步骤4.4）中吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50ng/ml的浓度向培养体系中补加2500ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5% 的CO2培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5% 的CO2培养箱继续培养。
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104862275A (zh) * | 2015-05-05 | 2015-08-26 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂 |
| CN105018424A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-11-04 | 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 | Dc-cik细胞及其制备方法 |
| CN105062968A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN105087489A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN105602902A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-05-25 | 谷超 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN106085850A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-11-09 | 上海闪锦生物科技有限公司 | 一种可提高细胞扩增速度的培养瓶 |
| CN106434556A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-02-22 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 |
| CN106755101A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-05-31 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法 |
| CN106811442A (zh) * | 2015-12-01 | 2017-06-09 | 上海市中医老年医学研究所 | Dc-cik细胞的制备及其在制备治疗卵巢癌药物中的应用 |
| CN107446886A (zh) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 湖南斯奇生物制药有限公司 | 卡介菌多糖核酸在促进cik细胞增殖和提高cik细胞的杀瘤活性中的应用 |
| CN108753723A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-06 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种利用抗CD3McAb与CTC相结合高效诱导DC-CIK的方法 |
| CN109402055A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-03-01 | 广州航华生物医药科技有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂盒及其培养方法 |
| CN109456941A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-12 | 见多视光(北京)科技有限公司 | 一种负载肿瘤细胞外泌体的dc-cik细胞的培养方法 |
| CN111117959A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-08 | 山东龙辰生物技术有限公司 | Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用 |
| CN115785210A (zh) * | 2022-06-10 | 2023-03-14 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 肺癌特异性分子靶标05及其用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1944360A1 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-16 | Koyo International Holding Corporation | Method for culturing dendritic cells (DC) and cytokine-induced killer cells (D-CIK) and applications thereof |
| CN102787097A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-11-21 | 李志惠 | 经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗 |
| CN102978161A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-03-20 | 江阴齐氏生物科技有限公司 | Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 |
| CN103255105A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-08-21 | 陈晚华 | 一种使用dc细胞刺激cik细胞快速增殖的方法 |
-
2014
- 2014-12-06 CN CN201410733771.1A patent/CN104450616A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1944360A1 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-16 | Koyo International Holding Corporation | Method for culturing dendritic cells (DC) and cytokine-induced killer cells (D-CIK) and applications thereof |
| CN102787097A (zh) * | 2012-05-30 | 2012-11-21 | 李志惠 | 经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗 |
| CN102978161A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-03-20 | 江阴齐氏生物科技有限公司 | Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 |
| CN103255105A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-08-21 | 陈晚华 | 一种使用dc细胞刺激cik细胞快速增殖的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张圣: "DC-CIK在肿瘤治疗中的临床研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 范方毅 等: "DC-CIK细胞联合内分泌治疗骨髓侵润性前列腺癌初探", 《西部医学》 * |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104862275A (zh) * | 2015-05-05 | 2015-08-26 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂 |
| CN105018424A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-11-04 | 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 | Dc-cik细胞及其制备方法 |
| CN105062968A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN105087489A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN105062968B (zh) * | 2015-09-14 | 2019-01-15 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN105087489B (zh) * | 2015-09-14 | 2018-09-21 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种dc细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN106811442A (zh) * | 2015-12-01 | 2017-06-09 | 上海市中医老年医学研究所 | Dc-cik细胞的制备及其在制备治疗卵巢癌药物中的应用 |
| CN105602902A (zh) * | 2016-03-31 | 2016-05-25 | 谷超 | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 |
| CN107446886A (zh) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 湖南斯奇生物制药有限公司 | 卡介菌多糖核酸在促进cik细胞增殖和提高cik细胞的杀瘤活性中的应用 |
| CN106085850A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-11-09 | 上海闪锦生物科技有限公司 | 一种可提高细胞扩增速度的培养瓶 |
| CN106434556A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-02-22 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 |
| CN106434556B (zh) * | 2016-11-22 | 2019-10-11 | 上海新长安生物科技有限公司 | 一种体外诱导扩增i型nkt细胞的方法 |
| US11447746B2 (en) | 2016-11-22 | 2022-09-20 | Shanghai Innovative Chang'An Biological Technology Co., Ltd. | Method for inducing amplification of type I NKT cells in vitro |
| CN106755101A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-05-31 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法 |
| CN108753723A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-06 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种利用抗CD3McAb与CTC相结合高效诱导DC-CIK的方法 |
| CN108753723B (zh) * | 2018-06-13 | 2021-11-16 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种利用抗CD3McAb与CTC相结合高效诱导DC-CIK的方法 |
| CN109402055A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-03-01 | 广州航华生物医药科技有限公司 | 一种dc-cik细胞培养试剂盒及其培养方法 |
| CN109456941A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-12 | 见多视光(北京)科技有限公司 | 一种负载肿瘤细胞外泌体的dc-cik细胞的培养方法 |
| CN111117959A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-08 | 山东龙辰生物技术有限公司 | Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用 |
| CN115785210A (zh) * | 2022-06-10 | 2023-03-14 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 肺癌特异性分子靶标05及其用途 |
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