CN106755101A - 一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法 - Google Patents

一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法：取马蹄内翻足患者的尿液分装于离心管，通过不同转速的离心，取得管底沉淀的尿液脱落细胞，培养于六孔板中，前三天静置，第四天开始采取半量换液的方式培养，待细胞克隆出现较多，改为全换液培养，直至细胞克隆在六孔板中长满。用仙台病毒感染细胞，首先使用1/2DFBS+1/2KSR+VPA培养基培养，在22～30天收获iPS细胞克隆，并验证iPS细胞的各项特性，从而建立稳定的马蹄内翻足患者特异的iPS细胞系。本发明的优点在于能从患者尿液中获得高纯度的脱落细胞，并且该细胞重编程为iPS细胞的效率高，获得的马蹄内翻足iPS细胞性质稳定。

Description

一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的 方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞高效重编程为iPS细胞的方法。
背景技术
先天性马蹄内翻足(Congenital Clubfoot，CCF)是小儿骨科三大常见疾病之一，新生儿总体发病率1‰～3‰，先天性马蹄内翻足表现为出生后一侧或双侧病足显示程度不等内翻下垂畸形，轻者足前部内收、下垂、足跖面出现皱褶，背伸外展有弹性阻力，至小儿学走路后，畸形逐渐加重，足部及小腿肌力平衡失调，健康肌挛缩，加之体重影响，足内分下垂加重，步态不稳，跛行，用足背外缘着地，延误治疗畸形愈加严重，足前部向后内翻，足背负重部位产生胼胝及滑囊，胫骨内旋加重。先天性马蹄内翻足无特效药物治疗。其病因和发病机制目前仍不明确，目前多需采用广泛软组织松解或利用Iizarov原理进行外固定架矫形，手术创伤更大、治疗周期更长、患儿承受的痛苦和家庭的经济负担都更加沉重。因而，进一步明确CCF的病因和发病机制，明晰CCF患儿的疾病演变特征，采取更加针对性的治疗，从而保证良好确实的治疗效果，是儿童骨科亟待解决的一个重要问题。
采用动物模型可以研究各种疾病的病理改变和疾病机制，但动物本身与人类之间存在的生物学差异使得很多疾病状态无法很好地用动物模型来模拟。2006年日本京都大学Yamanaka研究小组首次将小鼠成纤维细胞诱导为多潜能干细胞，简称“iPS细胞”。iPS细胞不仅在细胞形态、表面抗原、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞，并且具有向三个胚层分化的潜能。目前iPS细胞成为研究疾病的最佳模型，获得的疾病特异的多潜能干细胞(disease-specific iPSCs)及其多向诱导分化的潜能给研究疾病的病因学提供了非常好的疾病模型。目前，国际和国内已有众多学者利用该方法将不同来源的体细胞重编程为iPS细胞，并有构建了不同遗传疾病患者特异的iPS细胞系，包括Wilson病(WD)患者、非整倍体疾病患者(Turner疾病等)的iPS细胞系。但目前尚未有人利用尿液脱落细胞构建先天性马蹄内翻足患者的iPS细胞系。通过建立该细胞系，为明确CCF发生的细胞机制提供可靠的细胞来源。捕获缺陷细胞并探求其细胞功能障碍，有助于建立对该疾病病因的理解。对先天性马蹄内翻足病因学的深入探讨对今后预防和临床治疗马蹄内翻足具有重要的理论意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)从马蹄内翻足患者尿液样本中分离尿液脱落细胞，对尿液脱落细胞进行增殖培养；
2)利用包装有重编程因子的病毒载体感染增殖培养获得的尿液脱落细胞克隆；自感染的第2天起使用DFBS培养基进行培养，培养中每天全换液；培养至感染的第5-7天，将尿液脱落细胞接种到饲养层细胞上，然后依次使用DFBS培养基、添加有1mM VPA的1/2DFBS+1/2KSR培养基、1/2DFBS+1/2KSR培养基以及KSR条件培养基进行分阶段培养，在培养至感染后的第22～30天时即可在镜下观察到通过重编程形成的原代iPS细胞，分阶段培养中，使用DFBS培养基培养1-2天，使用添加有1mM VPA的1/2DFBS+1/2KSR培养基培养7-10天后撤去该培养基中的VPA处理，即使用1/2DFBS+1/2KSR培养基继续进行培养，自感染后的第17-19天起使用KSR条件培养基继续培养，培养中均每天全换液。
所述尿液样本采集自中段尿，单个样本采集量为150-200mL。
采集尿液样本前对待采样的马蹄内翻足患者进行尿液检查，若检查发现某马蹄内翻足患者的尿液存在内源性污染，则不对该马蹄内翻足患者进行尿液采样。
所述分离尿液脱落细胞具体包括以下步骤：a)将尿液样本分装于多支体积<50mL的离心管中，然后将离心管于390-410g转速离心10-12分钟；b)离心后吸出上清液，将离心管管底留下的0.4-0.5mL含有细胞团块的液体按照每3-5管液体合为1管进行合并，向保留合并后液体的对应离心管中加入缓冲液，然后于190-210g转速离心10-12分钟；c)重复步骤b)若干次，直至离心管管底留下的含有细胞团块的液体全部合并入一支离心管，向该离心管中加入缓冲液，然后于190-210g转速离心10-12分钟，离心后吸出上清液，将离心管管底留下的150-250μL含有细胞团块的液体与2.5-3.5mL尿液细胞分离培养基混合后将细胞团块打散，得到尿液脱落细胞悬液。
所述增殖培养具体包括以下步骤：将尿液脱落细胞悬液置于经基质胶预处理的培养容器中，然后于细胞培养箱静置3-3.5天，然后利用尿液细胞增殖培养基对尿液脱落细胞进行培养，该培养期间细胞克隆铺满培养容器面积的20％之前每两天进行半换液，之后则每两天全换液。
所述基质胶预处理具体包括以下步骤：在对马蹄内翻足患者尿液样本进行分离前至少0.5小时，将基质胶铺于培养容器内，然后将培养容器于37℃环境下静置，在该培养容器中加入尿液脱落细胞悬液前将基质胶去除；所述培养容器选自六孔板，六孔板单孔的基质胶用量为500-600μL。
所述KSR条件培养基为添加有8μg/mL bFGF的KSR。
所述步骤2)中，培养的条件还包括：培养温度为37℃，CO2浓度为5％。
所述病毒载体由仙台病毒构建而成。
所述iPS细胞的传代培养包括以下步骤：将iPS细胞从饲养层细胞中剥离，接种于饲养层细胞，采用KSR条件培养基进行培养，每3-5天传代一次。
本发明的有益效果体现在：
本发明为了获得iPS细胞，采集的是马蹄内翻足患者的尿液脱落细胞，而非传统方法采集的皮肤成纤维细胞，完全无创，不会对患者造成身体伤害。本发明在感染细胞接种到饲养层细胞后采用分阶段培养，使用的培养基包括1/2DFBS+1/2KSR+VPA培养基、1/2DFBS+1/2KSR培养基、KSR条件培养基，而非传统的KSR培养基，既能维持细胞的生长速率，还能促进iPS细胞克隆的形成，能高效且快速的获得大量iPS细胞。采用本发明方法获得的iPS细胞具有旺盛的增殖能力，经鉴定证实具有iPS细胞的所有特征。本发明的优点在于采用尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的效率高，获得的iPS细胞性质稳定。
本发明进一步取得的技术效果为：
(1)采尿量为150-200mL，此容量既能分离出足量的尿液脱落细胞，同时又少于普通人正常的排尿量，不会对排尿者造成生理负担。
(2)本发明分装尿液使用的离心管非传统方法使用的50mL离心管。离心管(例如15mL离心管)管体更细，管底更尖，更加有利于尿液细胞离心后的充分沉积，获得的沉积细胞更多，在吸出上清液时更方便，造成的细胞损失更小。390-410g的转速既能让尿液脱落细胞充分沉淀，又不会对细胞造成应力损伤。另外，后续有至少两遍清洗细胞(例如采用PBS)的过程，比传统方法多了一遍，既能够充分清洗细胞，又可稀释最终细胞沉淀液中尿液的含量。最终能从患者尿液中有效获得脱落细胞。
(3)本发明在细胞转入培养容器(例如培养板)之前，先用一定量基质胶铺于培养容器(例如500-600μL/孔)中，这样更利于后续细胞贴壁生长。使用的培养容器为6孔板，而非传统的12孔板，培养面积更大，为后续克隆的大量增殖提供了足够的空间，同时又不会浪费过多的培养基。
(4)本发明在细胞培养的前3-3.5天，用分离培养基静置培养，而非传统的每天补液的培养方式，静置的方式能更好的促进细胞贴壁，避免了由于每天补液对细胞造成的晃动。后续半换液的方式，既能给细胞补充新鲜的培养基，又能避免吸除所有培养基带来的细胞大量损失，能够获得大量贴壁良好的尿液脱落细胞克隆。
附图说明
图1为马蹄内翻足患者的足内翻情况外观图。
图2为培养孔内马蹄内翻足患者尿液脱落细胞增殖情况的显微镜照片。
图3为由尿液脱落细胞重编程形成的克隆的显微镜照片。
图4为图3所示克隆的多能性标记基因的表达情况，从左到右分别是供体细胞(编号14#，重编程以前)、人胚胎干细胞系H9(作为对照)、克隆C4P7(重编程自供体细胞的编号为C4的克隆，第7代)、C6P14、C13P14和C14P15。多能性标记选用的是oct4、nanog、sox2和lin28。
图5为图3所示克隆的碱性磷酸酶染色结果。
图6为iPS细胞核型鉴定结果。
图7为FACS检测多能性标记的结果。
图8为诱导的iPS细胞生成的EB悬浮球的显微镜照片。
图9为iPS细胞的多能性基因甲基化检测结果，从左至右分别是人胚胎干细胞系H9(作为对照)、供体细胞(编号24#，重编程以前)、克隆24#-C6(重编程自供体细胞24#的编号为C6的克隆)和11#-C13，多能性基因选用的是nanog和oct4。
图10为RT-PCR鉴定iPS细胞的外源基因(oct3/4、klf4、cmyc、sev、gapdh)表达的电泳图，从左至右分别是阳性对照(mRNA)、克隆C6和C13、人胚胎干细胞系H9、供体细胞(24#，重编程以前)和超纯水(阴性对照)。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加完整和清楚，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用以解释本发明，但不用于限定本发明。
本发明在前人构建iPS细胞技术的基础上，提出了一种利用仙台病毒四因子(oct3/4、klf4、cmyc、sox2)转染高效诱导马蹄内翻足患者尿液脱落细胞为iPS细胞的培养方法，该方法使用尿液脱落细胞，通过对尿液脱落细胞收集、增殖培养、重编程等过程的改进，建立了马蹄内翻足患者(图1)特异的iPS细胞系CCF-iPSCs。
1.尿液脱落细胞的收集
在取样前，先对马蹄内翻足患者的尿液进行尿检，排除内源性污染(例如马蹄内翻足患者尿液中的病原菌等微生物污染)。排尿前饮用300-500mL纯净水以促进排尿。患者穿戴好洁净套装(包括正确穿戴口罩、手套和头套等)，携带取样器材(湿巾、取样瓶和酒精喷壶等)进入取样室，用酒精喷洒取样点四周环境以除去残留污染细菌，酒精喷洒取样瓶外部消毒并用干净纸巾擦洗干净。取样前用湿纸巾清洁尿道口，从前往后擦拭2-3遍，除去尽可能的污染，尽可能不残留湿纸巾纸屑等杂质。打开取样瓶(无菌)，用取样瓶收集中段尿180mL(2-3秒后开始取样，最后3-4秒的尿液舍弃)。取完样品后第一时间用酒精喷洒取样瓶外部，取样瓶拿入细胞培养室进行下一步的处理。
2.尿液脱落细胞的分离
2.1在尿液分离前半小时，将500μL基质胶(深圳三启生物技术有限公司，UC-0301L5-3)铺于六孔板(Thermo，美国)的一个孔内，放入37℃细胞培养箱中静置。将尿液细胞分离培养基(深圳三启生物技术有限公司，UC-0301L5-1)的A液和B液混合备用，标记为Bal1-Sup1培养基。
2.2将取样瓶中180mL患者尿液分装于12支15mL离心管中(Corning，美国)，400g转速离心10分钟，离心完毕后，小心取出离心管，吸出上清液，管底留下约0.5mL液体，每四管液体合为一管，加入常温PBS(磷酸盐缓冲液)液体补齐至15mL，轻柔混匀后，再200g转速离心10分钟，离心后，小心取出离心管，吸出上清液，管底留下约0.5mL液体，将三管液体合为一管，加入常温PBS液体补齐至15mL，轻柔混匀后，再200g转速离心10分钟，离心后，可见管底沉淀的细胞团块，小心取出离心管，吸出上清液，管底留下约200μL液体，加入3mL配好的Bal1-Sup1培养基，轻柔吹打细胞团块，直至形成均匀的细胞悬液。拿出铺有基质胶的六孔板，吸除基质胶，将细胞悬液转移入孔中。做好标记后，将六孔板放入细胞培养箱中，37℃静置3天(CO2浓度为5％)。
2.3在细胞悬液转移入孔中的第四天，将尿液细胞增殖培养基(深圳三启生物技术有限公司，UC-0301L5-2)的A液和B液混合备用，标记为Bal2-Sup2培养基。拿出六孔板，沿孔壁轻柔吸除孔内上方的3mL培养基，孔底部保留1mL培养基，加入1mL Bal2-Sup2培养基，继续放入细胞培养箱中培养。在细胞悬液转移入孔中的第六天，拿出六孔板，沿孔壁轻柔吸除孔内上方的1mL培养基，孔底部保留1mL培养基，再加入1mL Bal2-Sup2培养基，继续放入细胞培养箱中培养。大约在第7天，孔内出现细胞克隆(离心后的细胞团块中99.99％都是无用的死亡的鳞状细胞，这些细胞随着培养的过程逐渐消失，细胞团块中只有几个是需要的脱落细胞，这几个脱落细胞会在培养后的第7天左右出现，即贴在孔底，并通过增殖由单个细胞长成了肉眼可辨的细胞集落)。
2.4当细胞克隆出现较多时(具体指细胞克隆铺满培养容器面积的≥20％)，每两天用2mL Bal2-Sup2进行全换液，在培养到16天时，克隆基本长满整个培养孔，形态均匀，增殖速度快(处于对数增长期)，且从图2可以看出，状态良好，数量丰富，可以开始进行重编程。
3.尿液脱落细胞的重编程
3.1 293T包装细胞(上海斯信生物科技有限公司)分盘与转染：在开始重编程的第一天，吸净培养有293T细胞的100mm培养皿中的培养基，3-5mL PBS洗一遍，0.25％胰酶(碧云天，中国)600μL消化30秒，然后加入293T培养基(Hyclone，美国)终止消化，用移液器轻轻吹散粘附的细胞数次，将细胞转入15mL离心管，150g离心5分钟，重悬细胞并计数，接种约4×106/100mm培养皿的细胞量，加入8mL 293T培养基，37℃细胞培养箱过夜(CO2浓度5％)。在第二天下午用质粒(10μg pMX-GFP和10μg pCL，中国科学院广州生物医药与健康研究院)转染293T细胞(转染过程是：依次混合1073.75μL超纯水，质粒，156.25μL 125mM的氯化钙，1250μL的HBS，静置2分钟后，逐滴均匀地加入293T细胞中)，置于37℃培养箱(5％CO2)中，在第三天更换新鲜293T培养基8mL。
3.2病毒收集感染：在重编程第四天下午用灭菌的巴士吸管收集病毒上清液，0.45μm滤膜过滤于15mL离心管中，加入终浓度8μg/mL polybrene(Sigma，美国)，混匀。293T培养盘中再加入8mL 293T培养基，继续培养。将前面培养的尿液脱落细胞的培养基(即Bal2-Sup2培养基)更换为新鲜的培养基后，加入病毒上清液(第一次感染)。感染过夜(温度37℃，5％CO2)后更换新鲜培养基(即Bal2-Sup2培养基)。重编程第五天做病毒二次感染，步骤同第一次感染。
3.3感染后细胞接种饲养层细胞：在病毒感染(指二次感染)的第二天，将培养基换成DFBS培养基(Hyclone，美国)，培养条件为37℃，5％CO2，每天换液，感染的第五天，复苏饲养层细胞(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，复苏方法：将1冻存管的饲养层细胞于37℃水浴锅中溶化，用移液器吸至15mL离心管中，加入含有10％胎牛血清的2mL DMEM培养基，放入离心机，200g离心5分钟后，吸除上清液，用含有10％胎牛血清的2mL DMEM培养基重悬细胞团，转移至100mm培养皿中，再加入含有10％胎牛血清的8mL DMEM培养基)。感染的第六天，将感染后的尿液脱落细胞用0.05％胰酶消化后计数，以5×104/100mm培养皿的密度接种到饲养层细胞上，使用DFBS培养基，培养条件为37℃，5％CO2。接种后第二天使用1/2DFBS+1/2KSR+VPA培养基(即等体积DFBS培养基和KSR的混合物，并添加浓度1mM VPA)，每天换液。VPA处理7-10天后撤去，在感染后18天左右出现克隆(胚胎干细胞形态的克隆)，将培养基换为KSR条件培养基(添加8μg/mL的bFGF的KSR，bFGF即成纤维细胞生长因子，来自碧云天公司，KSR来自于中国科学院广州生物医药与健康研究院)，每天换液。
3.4克隆的挑取、维护及扩大培养
复苏饲养层细胞到12孔板(Thermo，美国)，第二天更换KSR条件培养基。病毒感染后22～30天，镜下选择形态与人胚胎干细胞(EB)相近的克隆(细胞克隆呈圆球形，紧密成团，团块边缘未出现分化的梭形细胞，一个皿中可以出现13-14个原代iPS克隆，显著高于现有已报道的方法，现有方法一般获得7-8个原代iPS克隆)，拍照记录并编号。细胞间紫外照射30分钟后，在酒精灯上将玻璃吸管拉细，分别制作圆头和断口吸管。镜下用圆头吸管将选好的克隆切割并剥离饲养层细胞，用断口吸管将剥离的克隆吸出，放入预铺过饲养层细胞的12孔板中，培养条件为37℃，5％CO2，每天换液。后续再按照此方法将挑出的克隆传代及扩增，3-5天传代一次。从图3可以看出重编程形成的iPS细胞克隆形态良好。
4.马蹄内翻足iPS细胞的鉴定
4.1.Realtime PCR检测外源基因是否沉默
用试剂盒提取iPS细胞克隆(例如C6、C13)、人胚胎干细胞H9和供体细胞的RNA，应用RT-PCR仪上检测外源基因的表达，同时加入阳性对照和阴性对照(超纯水)，见图10，外源基因在克隆中未检出表达。
4.2.免疫荧光鉴定干细胞标志物的表达
镜下挑选边缘整齐、形态均一的若干个克隆，检测干细胞标志物的表达，选用人胚胎干细胞系H9作为对照。所有iPS克隆如同对照的人H9干细胞系一样表达各个多能性标记基因(oct4、nanog、sox2、lin28)，证明其具有多能分化性，见图4。
4.3.碱性磷酸酶染色
PBS清洗细胞，用4％多聚甲醛固定细胞2min。TBST液清洗细胞，加入AP显色液于室温下避光静置5分钟后，观察并拍照。参见图5，细胞出现紫色，为强阳性，符合iPS细胞特征。
4.4iPS细胞核型鉴定
取对数生长期的iPS细胞悬液(用胰酶消化细胞，200g离心5分钟后，用2mL培养基重新吹散细胞，制成细胞悬液)，加入1×10-5mol/L秋水仙素(终浓度为1×10-7mol/L)，处理6h后，轻轻吸出培养液，加0.25％胰蛋白酶消化细胞或手振摇培养瓶使细胞脱落，收集中期分裂象细胞，37℃静置20min后加入冰醋酸-甲醇(1:1)1mL，固定细胞1～20min，再次以1000r/min离心10min，去上清液，加入新固定液，吹打混匀，第3次经1000r/min离心10min，收集分裂象细胞。将沉集的细胞加入0.2mL冰醋酸-甲醇分散细胞，取一滴细胞悬液加到冰冷的玻片上，同时用口吹散细胞液滴，使细胞均匀分散于玻片上。同时可多制备几张染色体玻片，待干燥后染色、镜检。参见图6，细胞的核型为46，XY，证明iPS细胞核型正常。
4.5.FACS检测多能性标记
胰酶消化后(加入传代培养中的细胞培养皿)，用含10mg/mL FBS(胎牛血清，Gibco)的PBS重悬细胞，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD44、CD29、CD45、HLA—ABC(都是Abcam，英国)；PE标记的小鼠抗人CD73、CD34(都是Abcam，英国)；APC标记的小鼠抗人HLA—DR(Abcam，英国)；小鼠抗人CD90(Abcam，英国)冰上孵育45min，PBS洗涤2次，加入FITC标记的二抗兔抗小鼠IgG(Abcam，英国)冰上孵育45min，PBS洗涤3次，FACS检测，CXP分析软件分析，参见图7，Tra-1-60为84.1％，多能性标记合格。
4.6.iPS细胞诱导生成的EB悬浮球
将消化下来的iPS细胞集落移至一培养皿中，差速贴壁30min，去除剩余的饲养层细胞.收集悬浮细胞集落。用不含bFGF的KSR重悬。吹打至合适大小的细胞团，接种于低黏附的细菌培养皿中悬浮培养，隔天换液。参见图8，证明该iPS细胞具有分化成EB的潜力。
4.7.iPS细胞的多能性基因甲基化检测
提取iPS细胞的DNA，采用BSP法检测Oct4和Nanog两个基因启动子区域的甲基化程度。参见图9，如同对照的人H9干细胞系一样，基因的甲基化基本消失，证明iPS细胞的多能性基因能够表达。
此外，经鉴定，上述iPS细胞包含马蹄内翻足疾病的变异基因，可用于后续对马蹄内翻足疾病发病机制的研究，也可作为种子细胞应用于再生医学领域。

Claims (10)

1.一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从马蹄内翻足患者尿液样本中分离尿液脱落细胞，对尿液脱落细胞进行增殖培养；
2)利用包装有重编程因子的病毒载体感染增殖培养获得的尿液脱落细胞克隆；自感染的第2天起使用DFBS培养基进行培养，培养中每天全换液；培养至感染的第5-7天，将尿液脱落细胞接种到饲养层细胞上，然后依次使用DFBS培养基、添加有1mM VPA的1/2DFBS+1/2KSR培养基、1/2DFBS+1/2KSR培养基以及KSR条件培养基进行分阶段培养，在培养至感染后的第22～30天时即可在镜下观察到通过重编程形成的原代iPS细胞，分阶段培养中，使用DFBS培养基培养1-2天，使用添加有1mM VPA的1/2DFBS+1/2KSR培养基培养7-10天后撤去该培养基中的VPA处理，即使用1/2DFBS+1/2KSR培养基继续进行培养，自感染后的第17-19天起使用KSR条件培养基继续培养，培养中均每天全换液。
2.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述尿液样本采集自中段尿，单个样本采集量为150-200mL。
3.根据权利要求2所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：采集尿液样本前对待采样的马蹄内翻足患者进行尿液检查，若检查发现某马蹄内翻足患者的尿液存在内源性污染，则不对该马蹄内翻足患者进行尿液采样。
4.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述分离尿液脱落细胞具体包括以下步骤：a)将尿液样本分装于多支体积<50mL的离心管中，然后将离心管于390-410g转速离心10-12分钟；b)离心后吸出上清液，将离心管管底留下的0.4-0.5mL含有细胞团块的液体按照每3-5管液体合为1管进行合并，向保留合并后液体的对应离心管中加入缓冲液，然后于190-210g转速离心10-12分钟；c)重复步骤b)若干次，直至离心管管底留下的含有细胞团块的液体全部合并入一支离心管，向该离心管中加入缓冲液，然后于190-210g转速离心10-12分钟，离心后吸出上清液，将离心管管底留下的150-250μL含有细胞团块的液体与2.5-3.5mL尿液细胞分离培养基混合后将细胞团块打散，得到尿液脱落细胞悬液。
5.根据权利要求4所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述增殖培养具体包括以下步骤：将尿液脱落细胞悬液置于经基质胶预处理的培养容器中，然后于细胞培养箱静置3-3.5天，然后利用尿液细胞增殖培养基对尿液脱落细胞进行培养，该培养期间细胞克隆铺满培养容器面积的20％之前每两天进行半换液，之后则每两天全换液。
6.根据权利要求5所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述基质胶预处理具体包括以下步骤：在对马蹄内翻足患者尿液样本进行分离前至少0.5小时，将基质胶铺于培养容器内，然后将培养容器于37℃环境下静置，在该培养容器中加入尿液脱落细胞悬液前将基质胶去除；所述培养容器选自六孔板，六孔板单孔的基质胶用量为500-600μL。
7.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述KSR条件培养基为添加有8μg/mL bFGF的KSR。
8.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中，培养的条件还包括：培养温度为37℃，CO2浓度为5％。
9.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述病毒载体由仙台病毒构建而成。
10.根据权利要求1所述一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法，其特征在于：所述iPS细胞的传代培养包括以下步骤：将iPS细胞从饲养层细胞中剥离，接种于饲养层细胞，采用KSR条件培养基进行培养，每3-5天传代一次。
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