CN103305466B - 一种保持高细胞活率的神经干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保持高细胞活率的神经干细胞的培养方法。本发明的方法主要包括步骤：在无血清的DMEM/F12培养基中，对神经干细胞交替进行悬浮与贴壁培养。这种方法有效地提高了神经干细胞的活率，达到长期培养而保持高细胞活率的目的。

Description

一种保持高细胞活率的神经干细胞的培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域。具体来说，涉及一种神经干细胞的培养方法。

背景技术

对于包括帕金森病、Alzheimer's病、脑卒中、恶性神经胶质瘤及中枢和外周神经损伤等神经系统疾病，长期以来均缺乏有效的治疗手段。常规临床治疗方法主要是以减少或防止继发性损伤为主，基本上没有治愈的可能。自上世纪90年代神经干细胞的发现，对上述神经系统疾病的治疗带来了希望。

神经干细胞具有自我更新、自我复制的特性。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体等脑神经病变部位及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效。但要广泛地开展神经干细胞治疗神经系统疾病，神经干细胞的来源和数量仍是制约其广泛应用于临床治疗领域的主要难点。

对于神经干细胞的提取、培养、纯化、诱导等方面已积累了一定的经验。目前，神经干细胞的培养主要以悬浮培养为主，神经干细胞以神经干细胞凝集体，即神经细胞球的方式扩增。但是，随着神经细胞球培养时间的延长以及神经细胞球的扩大，营养物质通过渗透方式进入神经球内营养神经干细胞的途径不断加长，神经干细胞获得营养供应越来越困难，结果导致神经干细胞的大量凋亡或死亡，神经干细胞的整体活率低。

因此，建立一种保持高细胞活率的人神经干细胞的培养方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

根据本发明的一方面，本发明提供一种神经干细胞的培养方法，其包括步骤：

1）提供神经干细胞；

2）对神经干细胞进行悬浮培养，然后将经过悬浮培养的神经干细胞进行贴壁培养；

3）重复1次或多次步骤2）；

4）收获神经干细胞。

在悬浮培养和贴壁培养的交替过程中，应当先悬浮培养再贴壁培养。先悬浮培养可以有效地将神经干细胞与其它非神经干细胞区分开。

在一些实施方式中，当神经干细胞在悬浮培养中传代一次时，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。优选，当神经干细胞在悬浮培养中传代一次且状态良好时，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。所述状态良好是指神经球大小均匀、神经干细胞在显微镜视野下发亮、且细胞活率不低于95%。因为，此时的神经干细胞的生长状态处于最佳时期，适于转变为贴壁培养方式。在一些实施方式中，当贴壁培养的神经干细胞达到70%-80%融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换。

在具体实施方式中，当神经干细胞在悬浮培养中培养24h时完成了一次传代且状态良好，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。应当理解，不同培养批次可以稍有不同，在20-30小时之间，大多在24小时左右，但不限于此。当贴壁培养的神经干细胞达到80%融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换。

可以理解，这种悬浮-贴壁的交替培养可以重复多次。理论上讲，只要条件稳定，这种交替培养可以重复数次、甚至数十次。因为，这主要取决于神经干细胞自身的生物学性质，曾报道神经干细胞经传代50次后仍具有干细胞特性。鉴于此，本领域技术人员可以根据神经干细胞的来源、神经干细胞的初始状态、临床需求、实验室条件等自行确定重复的次数。在实践中，为了避免操作周期过长，重复6至7次是较客观、经济的选择。在一个具体实施方式中，重复了1至2次。

在一些实施方式中，神经干细胞是哺乳动物神经干细胞。哺乳动物包括但不限于猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、人。在一些具体实施方式中，神经干细胞是人神经干细胞。

在一些实施方式中，根据本领域常规方法提供神经干细胞。在一些具体实施方式中，通过商业购买、细胞中心提供、医疗机构收集等途径来提供神经干细胞。在一些具体实施方式中，可以自行制备神经干细胞，例如从捐献者的组织中通过机械吹打、研磨、或酶消化的方法制备神经干细胞的单细胞悬液，来提供神经干细胞。

在一些实施方式中，根据本领域常规方法进行神经干细胞的悬浮培养。神经干细胞的悬浮培养是本领域公知的成熟技术，例如杨小锋，2005；Sigma技术手册N3660-1EA；Laura Pacey KK等人，2006和郑可，2005等中所描述的那些方法。任何适合的培养基以及培养条件均可用于进行神经干细胞的悬浮培养。在一些具体实施方式中，在无血清的DMEM/F12培养基中进行悬浮培养。在一些具体实施方式中，无血清的DMEM/F12培养基pH范围为7.0至7.2；优选7.0。在一些具体实施方式中，培养条件为在5%CO₂培养箱37℃中培养。

在一些实施方式中，根据本领域常规方法进行神经干细胞的贴壁培养。神经干细胞的贴壁培养是本领域公知的成熟技术，例如Zhang JQ等人，2006；祝畅等人，2006；郝军荣等人，2011等当中所描述的那些方法。任何适合的培养基以及培养条件均可用于进行神经干细胞的贴壁培养。在一些具体实施方式中，在无血清的DMEM/F12培养基中进行贴壁培养。在一些具体实施方式中，无血清的DMEM/F12培养基pH范围为7.0至7.2；优选7.0。在一些具体实施方式中，将悬浮培养获得的神经干细胞接种于培养瓶中贴壁培养。在一些具体实施方式中，在37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养，直至观察到70%-80%融合（confluence）。

在一些实施方式中，将贴壁培养获得的神经干细胞再次依次进行悬浮培养和贴壁培养。在一些实施方式中，重复1次或多次悬浮培养和贴壁培养。在一个具体实施方式中，重复1-2次悬浮培养和贴壁培养。

根据本发明的一方面，提供一种根据如上方法所获得的神经干细胞。

根据本发明的又一方面，提供一种移植组合物，其包含根据如上方法所获得的神经干细胞和可药用载体。本发明的移植组合物可以根据本领域常规方法胃肠外施用。目前临床应用中所使用的干细胞移植途径包括但不限于局部注射移植、经脑脊液注射移植、经血液循环注射移植。根据本发明的移植组合物可以制备成任何适合移植的形式。例如制备成适合通过微量泵将含有神经干细胞的移植组合物泵入目标区域的形式；或者制备成适合通过穿刺针将含有神经干细胞的移植组合物注入目标区域的形式。根据移植方式、治疗目的的不同，本领域技术人员可以确定自行选择适当的可药用载体。

根据本发明的一方面，提供根据如上方法所获得的神经干细胞在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途。神经系统疾病包括但不限于帕金森病、阿尔茨海默氏病（Alzheimer's病）、脑卒中、恶性神经胶质瘤、中枢神经损伤和外周神经损伤。

附图说明

图1显示采用传统悬浮培养法获得的神经干细胞凝集体（神经球）生长，放大倍数×10。

图2显示采用本发明的培养法获得的神经干细胞生长，放大倍数×10。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

材料

神经干细胞获自四平市中心医院脑外伤科室通过合法途径取得捐献者的脑组织；

DMEM/F12培养基购自美国Hyclone公司；

生物安全柜购自哈东联仪器设备有限公司；

神经细胞生长添加剂B27购自购自美国Gibco；

Accutase酶购自美国sigma公司；

bFGF购自美国Falcon公司；

EGF购自美国Pepro Tech公司；

多聚鸟氨酸粘附剂购自美国sigma公司；

T75培养瓶购自国产NEST公司。

实施例

实施例1.神经干细胞的悬浮培养（对照方法）

1）机械吹打或研磨脑组织获得单细胞悬液，经80或200目不锈钢网过滤；

2）用碳酸氢钠将DMEM/F12培养基酸碱度（PH值）调节为中性或弱碱性呈粉红色的PH7.0，向培养基中加入终浓度为20ng/ml的bFGF和EGF，并按照1:100（体积比）的比例将B27加入到培养基中；将步骤1）中的单细胞悬液按照5×10⁵细胞/ml的密度接种至培养基中；在37℃于5%CO₂培养箱中进行悬浮培养。

3）七天后，收集神经干细胞。

实施例2.本发明的方法

1）机械吹打或研磨脑组织获得单细胞悬液，经80或200目不锈钢网过滤；

2）用碳酸氢钠将DMEM/F12培养基酸碱度（PH值）调节为中性或弱碱性呈粉红色的PH7.0，向培养基中加入终浓度为20ng/ml的bFGF和EGF，并按照1:100（体积比）的比例将B27加入到培养基中；将步骤1）中的单细胞悬液按照5×10⁵细胞/ml的密度接种至培养基中；在37℃于5%CO₂培养箱中进行悬浮培养20-30小时（不同培养批次可以稍有不同，大多在24小时左右），直至完成一次传代（即第二代神经干细胞）。当在倒置显微镜下观察到细胞状态良好时，即可准备转入贴壁培养。状态良好是指神经球大小均匀、细胞在光镜下检测发亮、细胞活率不低于95%。

3）取T75培养瓶，每瓶加入3ml粘附剂，37℃培养箱中放置2h后取出，吸出粘附剂，标注好备用。

取悬浮培养获得的神经干细胞（此处称为第二代神经干细胞）接种于T75培养瓶中，每瓶加入15ml第二代神经干细胞；放入37℃，5%CO₂培养箱进行贴壁培养。五天后，倒置显微镜下观察贴壁培养的细胞状态，当细胞有80%融合时，倾倒出培养基。

每瓶加入15ml PBS（pH7.4）清洗1次；每瓶加入2ml Accutase酶，消化3min；10ml PBS（pH7.4）中和反应；收集中和液于50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，收集神经干细胞。

4）将收集的神经干细胞重悬于无血清DMEM/F12培养基中在37℃，5%CO₂培养条件下经过约24小时的悬浮培养，完成一次传代。待悬浮培养的单细胞成小球且状态良好时，再次按照步骤3）进行贴壁培养。

5）贴壁培养五天后，倒置显微镜下观察贴壁培养的细胞状态，当细胞有80%融合时，倾倒出培养基，经Accutase消化之后收集神经干细胞。

实施例3.细胞活率的检测

采用台盼蓝细胞活率检测法检测实施例1或实施例2中最终收集的神经干细胞。

1）5%台盼蓝染液配制方法：向2.5g的台盼蓝粉剂加入50ml生理盐水，研钵混匀后用滤纸过滤，备用。每隔一段时间配制少量1%的台盼兰染液，方法为每1ml5%台盼蓝染液加入到4ml生理盐水中。

2）细胞活率检测步骤：

分别吸取60μl生理盐水、20μl l%台盼兰染液、20μl样品，在200μl EP管中混匀（台盼蓝浓度为0.2%）；

吸取20μl充池细胞计数板，分别计数四个大方格内的细胞总数及被台盼蓝染色的细胞总数，计数时要不断微调以确认细胞是否死亡。其中如果细胞死亡则台盼蓝进入到细胞内，细胞染成蓝色；若是活细胞，因细胞具有拒染特性，活细胞在显微镜下呈无色。

细胞活率的检测结果

图1为采用传统悬浮培养法培养获得的神经干细胞凝集体（即神经球）。图1中神经球等大均匀散布悬浮在细胞培养瓶中，细胞球的细胞折光性强，显微镜下可见细胞有明亮的折光；采用台盼蓝检测细胞平均活率仅为35-45%。

图2为采用本发明的培养法获得的神经干细胞生长的状态。从图2中可见，神经干细胞以神经球贴附于细胞培养瓶底部，再以此为中心向各个方向呈放射状生长，且细胞间相互交联；采用台盼蓝细胞活性检测法检测细胞活率为95%以上。

表1是采用单纯悬浮培养法与悬浮-贴壁交替培养获得的神经干细胞的随机抽样的10次结果。从表1中可见，采用交替培养法的细胞活率均值为89.8%。而采用单纯悬浮培养法获得的神经干细胞的细胞活率均值仅为29.9%。两者相比具有显著差异。

表1悬浮培养法与本发明方法获得的神经干细胞活率比较

上述实验结果证明了在无血清的DMEM/F12培养基中对神经干细胞交替进行悬浮与贴壁培养，克服了以往单纯以悬浮培养方法的不足。在悬浮培养中，神经干细胞因神经细胞球体积的不断扩大，营养物质渗透到球体内部的阻力增加，神经球内部的神经干细胞因得到的营养物质减少而导致神经干细胞大量凋亡或死亡，神经干细胞的整体活率低。通过本方法的培养，有效地提高了神经干细胞的活率，达到长期培养而保持高细胞活率的目的。

实施例4.移植组合物的制备

在无菌条件下，将实施例2收获的神经干细胞加入到HBSS（Hank’s平衡盐溶液）中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域。

实际施用给患者的神经干细胞的量可以根据多种相关因素包括被分化增殖的神经细胞的量、选择的施用途径和个体患者的体重、年龄和性别由临床操作者自行确定。根据治疗目的，移植组合物中还可以添加细胞因子和/或药物。

参考文献

Laura Pacey KK et al.Neural Stem Cell Culture:Neurospheregeneration,microscopical analysis and cryopreservation.ProtocolExchange.2006；

Neural Stem Cells:Methods and Protocols.Sigma技术手册N3660-1EA；

Zhang JQ et al.Neural differentiation of embryonic stem cells inducedby conditioned medium from neural stem cell.Neuroreport.2006Jul17;17(10):981-6；

郝军荣等人.神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定.神经药理学报.2011年第01期；

杨小锋.大鼠胚胎神经干细胞的培养、分化以及干细胞移植治疗大鼠重度颅脑损伤的研究.浙江大学博士论文.2005年；

祝畅等人.人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定.中国康复医学杂志.2006年第04期；

郑可.不同培养方式长期扩增神经干细胞的比较.大连理工大学硕士论文.2005年。

Claims (4)

1.一种神经干细胞的培养方法，其包括步骤：

1)提供神经干细胞；

2)对神经干细胞进行悬浮培养，当神经干细胞在悬浮培养中传代一次且状态良好时，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换；当贴壁培养的神经干细胞达到70％-80％融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换；

3)重复1次或多次步骤2)；

4)收获神经干细胞，

其中，

所述悬浮培养或贴壁培养是在无血清DMEM/F12培养基中进行的，无血清DMEM/F12培养基的酸碱度范围是pH7.0—pH7.2；

其中所述状态良好是指神经球大小均匀、神经干细胞在显微镜视野下发亮、且细胞活率不低于95％；

其中所述神经干细胞为哺乳动物神经干细胞；

步骤3)中所述的重复多次是指重复2次、或重复6至7次。

2.如权利要求1所述的神经干细胞的培养方法，其中：

当贴壁培养的神经干细胞达到80％融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换。

3.如权利要求1所述的神经干细胞的培养方法，其中所述神经干细胞为人神经干细胞。

4.如权利要求1所述的神经干细胞的培养方法，其中所述无血清DMEM/F12培养基的酸碱度是pH7.0。