CN108070558A - 一种临床级神经干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种临床级神经干细胞的制备方法：a)提供单个神经干细胞；b)神经干细胞接种到常规培养瓶中，此后更换为低吸附培养瓶；c)在培养基中添加肿瘤坏死因子‑α、白蛋白、B27、无动物原性细胞因子刺激神经干细胞的增殖；d)根据生长状况进行半量换液；e)根据生长状况进行消化传代；f)收获得到高纯度高活性且高分化潜能的临床级神经干细胞。本公开的方法操作简单，所得细胞纯度高且增殖能力强。通过本公开的方法制备的神经干细胞符合临床级要求。

Description

一种临床级神经干细胞的制备方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种高效的临床级神经干细胞的制备方法。
背景技术
神经干细胞源于胚胎干细胞和成年干细胞，存在部位包括胚胎脑的端脑、小脑、海马、纹状体、大脑皮质、脑室/脑室下区、室管膜/室管膜下区、脊髓和成年脑的脑室下区、纹状体、海马齿状回、脊髓等处。
神经干细胞终身具有自我更新能力和向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞多谱系分化的潜能。它的发现和研究是神经生物学领域最重要的进展之一。
除了具有自我更新和多向分化潜能两个基本特征外，神经干细胞还存在转分化性(可塑性)、无限增殖分裂、可对称或不对称分裂、损伤或疾病状态下能刺激其增殖分化、迁移能力、低免疫原性等特征。神经干细胞能够特异性表达巢蛋白、波形蛋白、Musashil蛋白及RCI抗原。
神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病，主要表现在神经干细胞在神经发育及损伤的修复中发挥作用。植入到神经组织后，可整合入神经通路，使治疗基因的表达受到微环境调控，分化产生的神经细胞将逐渐替代有缺陷或死亡的神经细胞。因此，神经干细胞是脑卒中、脱髓鞘病、多发性硬化症等神经系统疾病基因治疗的理想载体。
神经干细胞的临床应用前景广阔。如何获得大量可增生、高活性、高分化潜能的神经干细胞是研究其生物学性质和临床应用的基础。
CN1194086C和CN1435187A公开了一种神经干细胞制剂及其制备方法，其采用分离培养的神经干细胞在体外传3至6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到神经干细胞制剂。
CN106619722A公开了一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其包括如下步骤：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；将扩增融合到80％-90％的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代，并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；将步骤种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养(包含bFGF、EGF、B27、N2添加剂、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、NAC、LIF)，待培养瓶细胞融合到80％至90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P6-P9代；将P6-P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。
CN106924286A公开了一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制备方法，其包括如下步骤：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞；将P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代；取P8代细胞进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用；将工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0至4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂(Matrigel与0.4％羧甲基纤维素钠溶液)按体积比1：1进行混合。
普通的提取方法获得的神经干细胞纯度较低，培养体系不够完善，不能快速获得高增殖能力、高活性的神经干细胞，很难达到临床回输的要求。因此，本领域仍然需要寻找一种高纯度、高活性、高分化潜能的临床级神经干细胞的制备方法。
发明内容
鉴于上述需求，本申请提供了一种临床级神经干细胞的制备方法，其包括步骤：
a)提供单个神经干细胞；
b)以3×105/ml至5×105/ml的浓度，将所述的神经干细胞接种到常规培养瓶中维持12至24小时；
c)以1×105/ml至3×105/ml的浓度，将所述神经干细胞转移至低吸附培养瓶；
d)每3至5天，优选每4天，进行半量换液；
e)每6至9天，优选每8天，对所述神经干细胞进行传代，
任选地，计数细胞数量和/或活性检测；
f)收获第3至11代，优选第四代，的神经干细胞。
在一些实施方案中，所述低吸附培养瓶中的培养基包含：DMEM/F12无血清培养基和细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子选自：50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、10％至15％白蛋白、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml IGF-1、及其组合。
在一些实施方案中，步骤b)中所述常规培养瓶中的培养基包含DMEM/F12无血清培养基、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF。
在一些实施方案中，所述消化是通过Accutase酶和木瓜蛋白酶进行的。在具体的实施方案中，Accutase酶和木瓜蛋白酶的质量比是1：1。
在一些实施方案中，将神经干细胞放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中进行维持。
在一些实施方案中，所述的传代是通过以下进行的：
(1)当60％以上，优选当80％以上的所述神经干细胞的细胞球生长至200μm至500μm时消化所述神经干细胞；优选200μm至450μm、更优选200μm至400μm；
(2)以1×105/ml至3×105/ml的浓度，将所述神经干细胞接种至低吸附培养瓶中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
所述低吸附培养瓶中的培养基包含：DMEM/F12无血清培养基和细胞因子，其中所述的细胞因子包含50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、10％至15％白蛋白、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml。
在一些实施方案中，神经干细胞源自哺乳动物。在一些实施方案中，神经干细胞源自灵长类动物。
在另一些实施方案中，神经干细胞源自啮齿类动物。在一些实施方案中，神经干细胞源自人，例如人供体、人患者。
在一些实施方案中，适用于本申请方法的神经干细胞，可以通过选自以下的方法获得：从脑组织中提取、IPSC诱导、市售神经干细胞。在一些实施方案中，脑组织选自：海马、海马齿状回、或大脑皮质。
根据一些实施方案，提供了一种神经干细胞的培养基，其包含DMEM/F12无血清培养基和细胞因子。
在一些实施方案中，提供了一种神经干细胞的培养基，其包含DMEM/F12无血清培养基；和50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、10％至15％白蛋白、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml。
在一些实施方案中，提供了一种神经干细胞的培养基，其包含DMEM/F12无血清培养基；和100ng/mL肿瘤坏死因子-α、15％白蛋白、2％B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、30ng/mL CNTF、10ng/ml IGF-1。
术语的定义
神经干细胞(neural stem cell，NSC)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞。它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。流式检测表达Nestin、SOX2、Pax6、CD133等表面标志。
无动物源性细胞因子也称AF级，指产品整个生产过程中都没有动物源性的细胞因子。
临床级指能应用到临床。
神经元细胞：是构成神经系统结构和功能的基本单位。具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。TuJ1是神经元细胞的标志物。
星形胶质细胞(Astroglia)，是脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物。
少突胶质细胞(Oligodendrocyte)是中枢神经的成髓鞘神经胶质细胞。少突胶质细胞的标志物为A2B5+/O4+。
在具体的实施方案中，可以采用细胞的表面标志物来表示细胞。如：Nestin+、Sox2+、Pax6+表示神经干细胞；TUJ1+表示神经元；GFAP+表示星形胶质细胞；A2B5/O4+表示少突胶质细胞。
木瓜蛋白酶是一种含巯基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶用于分离细胞，可以将连接细胞的细胞外基质打断。
Accutase酶是包含有蛋白水解酶和胶原酶活性的一种细胞消化液。Accutase酶用于组织解离和细胞分离，因分离后的细胞能保持完好的表面抗原，且不含任何动物或者细菌来源组分，可满足对后续检测(如细胞表面标记、病毒生长分析、流式细胞分析、生物反应器)的要求。
附图说明
图1A至1J：神经干细胞流式细胞仪检测分析图：Nestin、Sox2、Pax6高表达。图1A至1E，第三代，巢蛋白97.3％、Sox2 97.3％、Pax693.9％；图1F至1J：第11代，巢蛋白97.2％、Sox2 97.5％、Pax6 99.1％。
图2A至2M：神经干细胞分化前免疫荧光分析图。图2A至2C：巢蛋白；图2D至2F：Sox2；图2G至2I：GFAP；图2J至2L：Tuj1；图2M：O4。图2A、2D、2G、2J和2M表示免疫荧光图；图2B、2E、2H和2K表示DAPI核染图；图2C、2F、2I和2L表示共染组合图。
巢蛋白(++)、Sox2(++)、Tuj1(-)、GFAP(-)、O4(-)表示细胞的干细胞属性，不表达分化标志物Tuj1、GFAP、O4；表明细胞处于未分化状态。
图3A至3M：神经干细胞分化为神经元的免疫荧光鉴定分析图。图3A至3C：巢蛋白；图3D至3F：Sox2；图3G至3I：GFAP/Tuj1双染色；图3J至3L：Tuj1；图3M：O4。图3A、3D、3G、3J、3H和3M表示免疫荧光图；图3B、3E和3K表示DAPI核染图；图3C、3F、3I和3L表示共染组合图。
细胞呈现Tuj1(++)、巢蛋白(+-)、Sox2(+-)、GFAP(-)、O4(-)，表示细胞具有分化为神经元的潜能。
图4A至4M：神经干细胞分化为星形胶质细胞的免疫荧光鉴定分析图。图4A至4C：巢蛋白；图4D至4F：Sox2；图4G至4I：GFAP；图4J至4L：Tuj1；图4M：O4。图4A、4D、4G、4J和4M表示免疫荧光图；图4B、4E、4H和4K表示DAPI核染图；图4C、4F、4I和4L表示共染组合图。
细胞呈现GFAP(++)、巢蛋白(+-)、Sox2(+-)、Tuj1(+-)、O4(-)表示细胞具有分化为星形胶质细胞的潜能。
图5A至5M：神经干细胞分化为少突胶质细胞的免疫荧光鉴定分析图。图5A至5C：巢蛋白；图5D至5F：Sox2；图5G至5I：GFAP；图5J至5L：Tuj1；图5M：O4。图5A、5D、5G、5J和5M表示免疫荧光图；图5B、5E、5H和5K表示DAPI核染图；图5C、5F、5I和5L表示共染组合图。
细胞呈现巢蛋白(+-)、Sox2(+-)、O4(+)、Tuj1(-)、GFAP(-)表示细胞具有分化为少突胶质细胞的潜能。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：单个神经干细胞的分离
在医院获得受试者的海马组织，签署供者家属知情同意书，并且各种病毒检测均阴性；将海马及海马齿状回组织至于含有5ml消化酶(Accutase酶和木瓜蛋白酶按质量比为1:1)的15ml离心管中，轻轻摇晃，37℃，15min；
消化完全后，加入5ml含抗生素的基础培养基(表1)，混匀，轻轻吹打；
BD 45μm滤膜过滤神经干细胞，500g，离心5min；
含双抗的基础培养基(表1)重悬神经干细胞沉淀，500g离心5min；
10ml完全培养基重悬神经干细胞沉淀，混匀，计数。
表1.培养基组成
实施例2：神经干细胞的接种及培养
将实施例1所得的神经干细胞的浓度调整至5*105/ml；
接种到普通T75培养瓶(表2)中，25至30ml/T75，放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养；
12至24小时后，收集神经干细胞悬液，400g离心5min，去上清；
完全培养基(表2)重新悬浮，混匀，轻轻吹打，计数；
根据细胞活率、数量，将神经干细胞的浓度调整至1.5*105/ml，接种到低吸附的T75培养瓶(表2)中，25至30ml/T75，放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养；
每四天根据生长状况(80％以上的神经球直径不低于200μm)进行半量换液；
每八天根据细胞球的大小(80％以上的神经球直径不小于200μm且不大于500μm)进行消化(Accutase酶和木瓜蛋白酶)传代(传代的步骤见实施例3)。
表2.培养基组成
实施例3：神经细胞的传代
待细胞球大小约200μm至450μm时进行传代，收集细胞球培养液；
200g离心5min，去上清，保留细胞球沉淀；
加入混合消化液2ml，轻轻吹散神经干细胞沉淀，37℃水浴摇床5分钟；
轻轻吹打神经干细胞悬液，显微镜镜下观察细胞球状态，如未消化完全，继续37℃水浴摇床5分钟；
加入10ml基础培养基(表3)，轻轻吹打神经干细胞悬液，BD 45μm滤膜过滤神经干细胞；
500g离心5min，用完全培养基(同上)进行重悬，计数；
将神经干细胞调整至1.5*105/ml，分瓶接种到低吸附T75培养瓶(表3)中，25至30ml/T75，放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
表3.培养基组成
实施例4：神经干细胞的增殖
采用添加有肿瘤坏死因子-α、白蛋白、B27、EGF、bFGF、CNTF、IGF-1的完全培养基来刺激实施例3所得的神经干细胞，使其增殖；其中在接种有神经干细胞的完全培养基中肿瘤坏死因子-α终浓度为100ng/mL、白蛋白终浓度为15％、EGF的终浓度为20ng/mL、bFGF的终浓度为20ng/mL、CNTF的终浓度为30ng/mL、IGF-1的终浓度为10ng/mL；B27的终浓度为2％。
放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育神经干细胞，每天观察细胞生长状况。细胞数可达到1*109。
实施例5：流式细胞仪对神经干细胞表型检测
通过流式检测神经干细胞表型，检测指标Nestin、Sox2、Pax6。分别对第3代(图1A至1E)、第11代的细胞进行检测(图1F至1J)。
结果显示：两个代次(第3代、第11代)的细胞中，三种指标均高表达，表达率近乎100％。此种培养方法益于神经干细胞的长期稳定培养，并同时保持神经干细胞的分化潜能。
实施例6：神经干细胞诱导分化前的免疫荧光鉴定
将神经球接种多聚赖氨酸包被的六孔板内，加入完全培养基(同上)；24h后进行免疫荧光检测，结果见图2A至2M。
结果显示：Nestin(++)、Sox2(++)、Tuj1(-)、GFAP(-)，O4(-)的细胞表面表型表示细胞处于未分化阶段；尚未分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。
实施例7：神经干细胞向神经元细胞分化能力的检测
将神经球接种多聚赖氨酸包被的六孔板内，加入完全培养基(同上)；24h后更换含B27的无因子培养基(表4)进行分化培养；每三天进行换液，分化12天后进行免疫荧光鉴定，结果见图3A至3M。
结果显示：Tuj1(++)，Nestin(+-)、Sox2(+-)、GFAP(-)，O4(-)的细胞表面表型，表示细胞具有分化为神经元的潜能。
表4.培养基组成
组成
含B27的无因子培养基 DMEM/F12、B27
实施例8：神经干细胞向星形胶质细胞分化能力的检测
神经球经消化酶(同上)处理为单细胞后，根据活率、数量按照2.0*105/孔接种于多聚赖氨酸包被的六孔板内，加入完全培养基(同上)，24h后更换含10％FBS、B27的无因子培养基(表5)进行分化培养，每三天进行换液，分化12天后进行免疫荧光检测，结果见图4A至4M。
表5.培养基组成
组成
含FBS、B27的无因子培养基 DMEM/F12、B27、FBS
结果显示：GFAP(++)、Nestin(+-)、Sox2(+-)、Tuj1(+-)、O4(-)的细胞表面表型，表示细胞具有分化为星形胶质细胞的潜能。
实施例9：神经干细胞向少突胶质细胞分化能力的检测
神经球经消化酶处理为单细胞后，根据活率、数量按照1.5*105/孔接种于多聚赖氨酸包被的六孔板内，加入完全培养基(同上)，24h后更换含IGF-1、N2、PDGF的基础培养基(表6)，培养四天后再更换为含IGF-1、N2、T3、VC的基础培养基(表6)培养七天后进行免疫荧光检测，结果见图5A至5M。
表6.培养基组成
结果显示Nestin(+-)、Sox2(+-)、O4(+)、Tuj1(-)、GFAP(-)的细胞表面表型，表示细胞具有分化为少突胶质细胞的潜能。
讨论：
在本申请的方法中，发明人将木瓜蛋白酶和Accutse酶联合应用于原代神经元的提取和中后期神经球的消化。这种联合应用不仅缩短了消化时间，更提高了原代细胞活率和数量。
在细胞培养过程中，相较于常规培养，添加了肿瘤坏死因子-α、白蛋白、CNTF等因子。其中，CNTF是一种酸性蛋白质，其抑制细胞凋亡；调节损伤后细胞内的钙、镁等离子的水平；稳定细胞内外离子平衡从而保护神经细胞。
肿瘤坏死因子-α具有促进细胞增殖和分化；增强有丝分裂原具有生长因子样作用，并协同EGF、PDGF和胰岛素的促增殖作用，促进EGF受体表达。
白蛋白可以减少细胞自溶，表现为乳酸脱氢酶释放的减少。也能防止细胞的机械损伤。在体内约60％的白蛋白位于血管周隙(包括组织间隙)，以保证细胞状态的良好，可促进哺乳动物细胞的生长和提高存活率。
为了提高神经干细胞的纯度、活率和数量，本公开对不同种类的消化酶、细胞因子进行了组合。通过本公开中的方法，能够获得一种高纯度、高活性、高分化潜能的临床级神经干细胞，以期大规模应用。

Claims (8)

1.一种临床级神经干细胞的制备方法，其包括：
a)提供单个神经干细胞；
b)以3×105/ml至5×105/ml的浓度，将所述的神经干细胞接种到常规培养瓶中维持12至24小时；
c)以1×105/ml至3×105/ml的浓度，将所述神经干细胞转移至低吸附培养瓶，
所述低吸附培养瓶中的培养基包含：DMEM/F12无血清培养基和细胞因子；其中所述的细胞因子选自：50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、按质量/体积计10％至15％白蛋白、按质量/体积计1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml IGF-1、及其组合；
d)每3至5天，优选每4天，进行半量换液；
e)每6至9天，优选每8天，对所述神经干细胞进行传代，任选地计数细胞数量和/或活性检测；
f)收获第3至11代优选第四代的神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述常规培养瓶中的培养基包含DMEM/F12无血清培养基、1％至2％的B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化是通过以下进行的：
Accutase酶和木瓜蛋白酶；
优选地，质量比1：1的Accutase酶和木瓜蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的维持是通过以下进行的：放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的传代是通过以下进行的：
当60％以上，优选当80％以上的所述神经干细胞的细胞球生长至200μm至500μm时，消化所述神经干细胞；优选，200μm至450μm、200μm至400μm；
以1×105/ml至3×105/ml的浓度，将所述神经干细胞接种至低吸附培养瓶中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养；
所述低吸附培养瓶中的培养基包含：DMEM/F12无血清培养基和细胞因子，其中所述的细胞因子包含50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、10％至15％白蛋白、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
步骤a)中的所述神经干细胞源自哺乳动物，优选灵长类动物或啮齿类动物；
步骤a)中的所述神经干细胞可以通过选自以下的方法获得：从脑组织中提取、IPSC诱导所得、市售神经干细胞系；
所述脑组织选自：海马、海马齿状回、大脑皮质。
7.一种神经干细胞培养基，其包含：
DMEM/F12无血清培养基；和
细胞因子，
其中，所述的细胞因子包含：50ng/mL至100ng/mL肿瘤坏死因子-α、10％至15％白蛋白、1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/ml。
8.一种神经干细胞培养基，其包含：
DMEM/F12无血清培养基、100ng/mL肿瘤坏死因子-α、15％白蛋白、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF、30ng/mL CNTF、10ng/ml IGF-1。
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