CN1820069A - 祖细胞的选择和增殖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及祖细胞群及获得和培养祖细胞的方法。本发明方法和组合物可用于包括再生医学(组织再生)、移植和癌症研究的领域。

Description

祖细胞的选择和增殖
相关申请的交叉引用
本发明要求与2003年6月3日提交的美国临时专利申请60/475,553的优先权，该申请的内容纳入本文作参考。
技术领域
本发明一般涉及祖细胞选择、增殖和使用方法。更具体地说，本发明涉及用于体外产生祖细胞群的方法和组合物。
发明背景
成体干细胞和胚胎干细胞由于其在细胞治疗中的潜在作用受到科学界的强烈关注。一种有前景的干细胞源是成熟器官中天然存在的干细胞和祖细胞。然而，由于选择性培养相关的困难，限制了实质祖细胞的使用。例如，在建立来自成人胰或成人胰岛组织的祖细胞培养物中遇到的主要问题是污染性非实质细胞类型的过度生长和分化一定型细胞的继续存在。
培养胰岛祖细胞作为胰岛素依赖型糖尿病的潜在治疗手段是特别感兴趣的。已尝试在含血清培养基中培养来源于分离的胰组织的胰岛细胞。然而，大多数连续增殖的胰岛细胞群仅显示适度的增殖能力且保留分化特性。胚胎来源的祖细胞，在牛脑提取物的帮助下增殖，不仅产生胰岛细胞，而且产生腺泡细胞和导管细胞的细胞群，与胰岛前体相比，它可能代表早期胚胎胰祖细胞。而且，本方法使用天然高祖细胞数量的胚胎来源的细胞，而在成熟组织中鉴定和控制祖细胞更难。描述了能够体内产生胰岛素的胰岛细胞群。
虽然本方法使胰岛前体细胞一定程度的增殖，但该细胞需要伴随的不同组织类型的间质或“抚育”细胞如导管细胞的共增殖，而导管细胞代表是培养基中的大多数细胞。
已使用(例如)细胞标记物的可选择的机械分离方法，以选择干细胞或祖细胞群。然而，这种人为细胞选择仅得到暂时富含的干细胞和祖细胞群。
在为寻求得到含再生组分的增殖上皮细胞群，没有研究可区分祖细胞及其天然后代，过渡放大细胞。因此，先前的方法不利于维持祖细胞库通过过渡放大过度生长。过渡放大细胞具有能够连续传代的生长能力，但它们天然抑制干细胞活化和祖细胞继续增殖(Hardin-Young等，Current Neurovascular Research1，(2004)；Parenteau，Encyclopedia of Animal and Plant Cell Technology，365-78(1999))。控制过渡放大细胞的产生和生长或控制污染细胞类型的生存的同时不能维持祖细胞活化和生长，阻止了基本上纯的成人祖细胞群的发育和维持。这一困难导致在实践人上皮细胞培养物中经历的变异。
因此，需要一种产生大多数细胞是体外能够延长扩展、体内具有高保真度器官再生的实质祖细胞的细胞培养物的方法。此外，需要一种产生这种来自成熟(成人或新生儿)组织，尤其是实质性组织的方法。
发明概述
本发明提供选择和扩展来自新生儿或成人实质性组织的祖细胞群的方法。本发明培养的祖细胞群是一种容易获得的细胞来源，体内移植时，它可用于增加、修复、恢复或代替患病、损伤、缺失或损害的组织或器官。
本发明方法提供促进真祖细胞的选择的培养条件。根据本发明，选择损害更分化(more differentiated cell)细胞的细胞培养条件，因而解除更分化细胞通常对祖细胞生长的抑制作用。结果使得构成大多数细胞培养物的自支持、未分化祖细胞的集落形成。本发明考虑在细胞培养中可诱导应激反应的任何无血清的培养条件，以抑制更分化细胞的增殖而使祖细胞生长。理想地，选择条件以使一旦产生祖细胞群即可诱导组织特异性分化，体外或体内。
虽然考虑了促进祖细胞生长的任何一组培养条件，优选的增殖祖细胞的方法包括在正在分化和/或分化的细胞中诱导凋亡或坏死的无血清培养基。可将细胞先培养在含有低水平或不含钙和/或生长因子的严格的原代培养基中，以使培养朝祖细胞活化和生长偏移。祖细胞开始生长后，祖细胞扩展成为大多数细胞群，细胞在比原代培养基较不严格的第二代最小生长培养基中增殖。最后，在特定生长因子的存在下，通过在第三代培养基中加入分化因子，可促进所得祖细胞培养物的分化。
或者，分化前收集祖细胞供使用。考虑抑制分化细胞生长的任何培养基成分，作为产生本发明祖细胞群的方法。降低生长因子的浓度和/或效力是达到此目的的一种方法。抑制细胞粘附是另一种方法。然而，本领域已知其它方法，例如降低某些通常促进分化细胞生长的离子的浓度、抑制细胞粘附、改变培养pH等。当然，可采用任何这种独立技术的组合。
在优选的实施例中，本发明方法包括：在无血清培养基中提供含有祖细胞和至少一种正在分化细胞及分化细胞的原代细胞培养物；在原代细胞培养物中诱导应激反应，使祖细胞复制并抑制至少一种正在分化细胞和分化细胞的增殖；鉴定复制所得祖细胞群，它构成原代细胞培养物的大多数细胞。方法可包括从原代细胞培养物中分离祖细胞并培养分离的祖细胞的步骤，以提供次生细胞培养至不少于5个连续代。可在含有谷胱甘肽，例如0.01-10mM谷胱甘肽的合成培养基中维持次生细胞培养。方法还可包括刺激祖细胞群分化的步骤。
在优选的实施例中，当次生细胞培养约为60％-75％融合时，可进行连续传代。可在基质组分如胶原的存在下，维持原代细胞培养物或次生细胞培养。
优选的应激反应包括在细胞培养物中诱导凋亡和/或坏死。并且，优选的原代培养基基本上不含生长因子或器官提取物，没有或低水平的钙。可使用任何细胞类型产生原代培养物，但优选上皮细胞，例如胰细胞、肝细胞和表皮细胞。一种优选的方法产生包含至少约60数量％、70数量％或80数量％祖细胞的细胞群。培养细胞一段时间，足以产生祖细胞群。
通过改变培养条件，例如增加分化因子，在培养中完成分化细胞的刺激，以朝形成分化细胞偏移。
本发明提供从非胎(non-fetal)组织体外增殖的基本上纯的哺乳动物祖细胞群。
本发明其它方法包括通过根据方法体外培养胰岛祖细胞；并将祖细胞移植入哺乳动物，防止或治疗糖尿病。
由下面的描述和附图可更全面地理解本发明的上述和其它特征和优点以及发明本身。
附图简要说明
图1说明涉及实质产生和使用祖细胞库的新生方法。
附图不一定按比例，而是通常重点在于说明本发明的原理。结合附图参考说明，将更好地理解本发明的优点。
发明详述
本发明(部分)提供得到能够体外自持和延长扩展和体内器官再生的实质祖细胞群及所得组合物的方法。该方法包括在不能支持更分化细胞的维持，仍允许下面的祖细胞群生长和扩展的培养基中培养原代细胞。结果是祖细胞构成大多数，优选较高百分比，例如60、70或80数量％的细胞群的培养物。在一个实施例中，细胞培养物是基本上纯或同种祖细胞群。一旦建立，可在确定的条件下将祖细胞群增殖用于多次传代，需要时，可扩展用于临床治疗。本发明方法的优点之一是它们提供可用于细胞疗法的容易获得的祖细胞来源。
本发明祖细胞来源于含能再生的实质细胞的任何器官或组织，包括但不限于，来源于胰、肝、肠、心、肾、角膜、皮肤、视网膜、内耳、骨骼肌、脑或腺的细胞群。在优选的实施例中，祖细胞群产生特定实质谱系的细胞，例如胰岛内分泌细胞谱系、肝细胞谱系或表皮细胞谱系。
参考图1，为了达到新生，即从头产生功能组织，本发明方法着眼于体外祖细胞群的增殖和活化。在一个实施例中，来源于器官如胰的原代细胞培养物含有多种细胞类型。残留的干细胞10是慢周期细胞，产生祖细胞20。祖细胞20是分化程度最低的细胞，构成负责器官再生的增殖细胞区室。基于发育研究、基因表达和转录因子的表观调节，慢周期干细胞10区别于祖细胞区室和过渡放大细胞30。一旦激活祖细胞20，产生过渡放大细胞30，过渡放大细胞依次产生实质细胞40。过渡放大细胞30是谱系定型的分化细胞并显示有限的复制。实质细胞40是分化程度最高的功能细胞。
根据本发明的一方面，可在身体外面，例如体外培养基本纯或同种祖细胞群，而不依赖于来自非实质如间质组织、结缔组织或支持组织的细胞。换句话说，本发明祖细胞能够实现由其自身组织型细胞的自持增殖。根据本发明的另一方面，通过控制细胞培养条件，以消除或至少抑制更分化细胞，包括正在分化细胞和分化细胞，可选择上述祖细胞群。该方法的优点在于，更多地是由其行为和这种行为的结果而不是在任何给定时间或位置可能表达的任何标记物来鉴定祖细胞。另一个优点是已知调节细胞周期的机制，包括细胞凋亡和坏死可用来达到本发明的目的。
在优选的实施例中，通过在原代培养基中培养上皮细胞的原代培养物，体外产生基本上纯的上皮祖细胞群，所述原代培养基可在细胞中诱导耗尽成熟、分化实质细胞和/或正在分化的过渡放大细胞的应激反应。此反应改变培养基中细胞信号的动力学，以使祖细胞复制和增殖。应激反应杀死更分化细胞，使所得细胞群基本上不含分化或正在分化的细胞，以及来自其它组织型，如间质细胞、成纤维细胞的污染细胞。虽然尚不确定，但抑制更分化细胞可扼制细胞间抑制祖细胞复制的信号和/或可能提供活化祖细胞增殖的信号。结果，祖细胞增殖而没有任何类型的来自其它组织型的“饲养”细胞或“抚育”细胞。
除肉眼观察外还有各种其它监测应激反应的方法。例如，可测定热激蛋白质或急性期反应物基因的表达作为应激反应的指示器。
一种鉴定祖细胞预融合集落的方法是测定原代培养细胞是否经历主动的有丝分裂。其它方法包括显微镜下观察细胞；或将5-溴-脱氧尿苷(BrdU)，一种胸腺嘧啶核苷类似物，加入到细胞培养物中并使用单克隆抗-BrdU抗体检测BrdU掺入细胞。
原代培养中鉴定祖细胞的预融合集落后，可分离该祖细胞集落并用于建立包含基本同种祖细胞的次生细胞培养物。次生细胞培养物可使用与原代培养相同类型的培养基，或使用较不严格的培养基。次生细胞培养物通过多次传代维持祖细胞，祖细胞保留分化或经历新生的能力。在一个实施例中，祖细胞经历不少于5次传代。
本发明还包括活化祖细胞成为正在分化的细胞如过渡放大细胞，和/或分化细胞如实质细胞的步骤。祖细胞和/或其正在分化的和/或分化的后代可用于治疗应用，如通过移植。
通篇说明书中，若所述组合物具有、包括或包含特定组分，或所述方法具有、包括或包含特定方法步骤，则考虑本发明组合物也基本包含，或由所述成分组成，并且本发明方法也基本包括，或由所述方法步骤组成。
应理解，只要本发明可操作，步骤的顺序或进行某些操作的顺序不重要。而且，可同时进行两个或多个步骤或操作。
原代细胞培养物
设计原代细胞培养物，在正在分化的细胞和分化细胞中，包括其它组织型的污染细胞中诱导应激反应，但允许祖细胞增殖。认为，一旦耗尽正在分化的细胞和分化细胞群，祖细胞活化，进入细胞周期并开始高速分裂。可通过多种方法，例如诱导这种细胞的凋亡和/或坏死，开始祖细胞选择过程的应激反应。在一个实施例中，原代培养基是确定化学成分的。“确定化学成分的”表示培养基基本上不含有或大体上不含有血清或器官提取物。在某些实施例中，培养基含有低水平或大体上不含生长因子。如果存在生长因子，优选小于约10ng/ml，更优选小于约5ng/ml，例如约1ng/ml。在一个实施例中，培养基含有cAMP的升高剂，如霍乱毒素和毛喉素，优选浓度为9ng/ml，以支持祖细胞的活化和增生。
可设计原代培养基，以抑制细胞-细胞粘附。例如，培养基可含有氧化氮，已知氧化氮可抑制细胞粘附并破坏细胞基质相互作用。另一方面或此外，可加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1-β(ILl-β)和干扰素-γ(IFN-γ)，以刺激氧化氮诱导的凋亡。也可在稀释的水胶体、葡聚糖等中培养细胞，以破坏细胞粘附并不利于更分化细胞的存活。
在一些实施例中，培养基含有低水平钙或不含钙。如果培养基中存在钙，钙的浓度优选小于约1mM，例如约0.001-0.9mM。在一个实施例中，钙浓度约为0.01-0.5mM，在另一个实施例中，约为0.08mM。虽然不希望受被理论约束，认为低钙环境限制细胞与细胞接触，细胞-细胞接触对更分化细胞的相互作用和维持是必需的。低钙环境联合确定化学成分的培养基以及最小浓度的生长因子，使得分化细胞分裂地更慢，最终导致这种细胞凋亡，培养物内产生祖细胞群。
本领域已知许多凋亡或坏死相关途径。可设计原代培养基，以启动或增强这种途径。下调所述应激的途径可去活化，例如，可阻断抑制凋亡的蛋白激酶。许多这种途径是协同的，且可联合使用，这种信号途径的例子包括，胱冬酶途径、Bcl-2途径和白介素-10途径。
胱冬酶途径涉及转录因子的核因子κB(NF-κB)，一旦易位至核，该因子可活化各种基因的转录，包括影响细胞死亡发生的基因。可将调节NF-κB的配体、抗原、抗体、生长因子、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、辅因子、激素和其它因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)，加入到培养基中，通过胱冬酶、Bcl-2和其它途径杀死正在分化和/或分化细胞。这种因子包括TNF-α、TNF-样细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)、TNF相关诱导细胞凋亡的配体(TRAIL)、白介素(IL)(例如IL 10)、Fas配体、凋亡诱导蛋白配体(例如APO-3L和2L)、转化生长因子β(TGF-β)、内毒素(例如脂多糖)、正常T细胞表达和分泌的活化调节因子(regulated-upon-activation normal T-cell expressed and secreted)(RANTES)、干扰素(如IFN-γ)、噁玳酸(oxadaic acid)(色氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂)等。
可被破坏而不利于更分化细胞存活的抑制凋亡信号途径的例子包括：AKT-介导的信号途径及通过其它所谓“存活激酶”如IKK、erk、Raf-1的活化途径。干扰AKT信号途径的可能方法包括使用：siRNA、生长因子如自分泌和旁分泌产生的生长因子，和/或阻断受体酪氨酸激酶AKT的抗体。或者，使用严格的确定成分培养基排除可诱导该途径的生长因子，得到相似的结果。破坏抑制凋亡信号的另一个例子包括热激蛋白质70的失活。
其它环境因子如热、辐射、湿度和pH也在细胞培养中导致所需应激反应。例如，在更分化细胞中紫外辐射可诱导细胞死亡。
次生细胞培养
次生细胞培养通常包括利用祖细胞在应激条件下旺盛生长的能力，从原代细胞培养物中选择祖细胞。次生细胞培养维持祖细胞，使其保留分化或新生而不实际分化的潜力。通过连续传代，祖细胞群耐受长期增殖的能力产生本发明的另一个优点，即积聚足够量的祖细胞用于新生或其它应用的能力。
次生细胞培养可使用与原代培养相同类型的培养基，正如该培养基可继续抑制祖细胞的分化。或者，第二代培养基可较不严格。因为开始培养中基本上不含更分化细胞，所以可将一些限量的生长因子加入到碱性培养基中。在第二代培养基中可略微或间歇使用一些非必需生长因子。这种生长因子的例子包括：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、角质形成细胞生长因子(KGF)和碱性成纤维细胞生长因子。
进一步调节
可进一步调节由原代或第二代培养收集的细胞。在某些实施例中，诱导祖细胞进行性分化入各阶段，参考图1如上所述。可制备具有分化因子如较高水平的钙、血清和/或TGF-β的第三代培养基。培养基还可包含地塞米松和环腺苷酸单磷酸盐(cAMP)升高剂，且已知可促进和维持分化细胞生长的其它因子。加入有助于形成细胞复合物的细胞外基质、水凝胶或水胶体底物或聚合物也可促进细胞分化。这种细胞可应用于许多疗法。
实施例
提供下面的实施例以阐述本发明的原理，而不应解释为以任何方式限制权利要求的范围。本领域技术人员将明白，不背离本发明的精神和范围内可进行多种改进。
实施例1：培养条件
通过酶解感兴趣组织或模拟形成1-2mm2的组织移植物，建立来源于人组织的祖细胞。如果使用酶消化，优选酶例如胶原酶、透明质酸酶、分散酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和糜蛋白酶。本领域已知许多制备原代细胞培养物的方法。
通过将异种细胞群平铺并铺展在组织培养底物(如涂布有I型胶原的板)上，开始培养。通常，大多数细胞显示大、铺展的上皮样细胞到成纤维细胞外观。然后在含有少或无钙且非常少或无生长因子的确定化学成分培养基中培养细胞。确定化学成分的条件是指培养基基本上不含有血清或器官提取物。如果培养基中存在钙，钙的浓度优选小于约1mM，例如约为0.001-0.9mM。在另一个实施例中，钙浓度约为0.08mM。如果存在生长因子，其浓度小于约10ng/ml，优选小于约5ng/ml，例如约为1ng/ml。
第一个10天内鉴定单一实质祖细胞和实质祖细胞集落。通常，肉眼观察集落区别于其它细胞。与大多数细胞不同，实质祖细胞的形状仍为小的圆形或多角形。祖细胞通常小于约15微米并具有致密外观。这种细胞顽固，并且使用相差显微镜可容易地识别。而且，可由其活性有丝分裂鉴别实质祖细胞。通常，实质祖细胞的集落数量增加，约14天内在原代培养中成为主要细胞群。当松散形成的集落和小分裂细胞占据约50-70％的细胞培养物表面时，由胰蛋白酶消化收集细胞。在一个实施例中，祖细胞占据约80％的细胞培养物表面。
第二代培养中所得祖细胞群的特征在于，具有小尺寸，传代后集落形成率约为40％或更高，约36小时或更少时间快速细胞分裂。传代祖细胞至少约5代并可延长到约13代或更多，取决于传代期间所用的分裂比例。细胞通常达到约10个群体倍增或更多。细胞保持组织特异性祖细胞的特征，例如谱系特异性基因和祖细胞相关发育基因的表达。
改变环境如第三代培养基的培养条件后，所述环境含有促进和/或支持正在分化的细胞发育和生长的因子，祖细胞具有显示器官型分化的能力。这种因子的例子包括：皮质醇、TGF-β、肝细胞生长因子或其它已鉴定为在调节胚胎器官发生中有效的因子。可引入第三代培养的其它环境条件的例子包括，加入细胞外基质以促进簇形成或三维培养，加入浓度大于约1.0mM的钙，或可产生细胞-细胞粘附和发展组织结构的任何方法。根据组织类型，可一起使用或按顺序使用任何这种因子和条件，以促进器官发生。
胰岛祖细胞群的选择如下所述。然而，该实施例不是为了限制，祖细胞可来源于含有能再生实质细胞的任何组织或器官，例如肝、肠、心、角膜、皮肤、视网膜、内耳、骨骼肌、脑或腺体。
实施例2：胰岛细胞
内分泌祖细胞来源于整体新生胰腺或分离的成人胰岛。然后在严格条件下培养细胞，对细胞培养物施加应激条件以选择内分泌祖细胞群的生长。一旦建立，该细胞群增殖未分化的多次传代，因而扩展了胰岛素依赖性糖尿病的临床治疗。
本发明诱导应激的培养基允许建立原代培养物，并且由这种可连续传代的原代培养物可促进细胞亚群的鉴定，因而提供了具有治疗价值的扩展细胞数目。优选地，诱导应激的培养基由不含血清或生长因子的确定化学成分的培养基构成。使用该培养基和培养方法的胰腺或胰岛组织的细胞生长主要显示上皮样形态且表达上皮细胞的细胞角蛋白标记特征。
随着细胞在培养基中扩展，其特征是与胰祖细胞，如PDX1相关标记的表达。在胰发育的早期需要同源结构域蛋白PDX1(Nature Genetics 15：106-110(1997)；Development 122：1409-1416(1996))。随着分化的内分泌细胞的出现，这种细胞从上皮细胞分离并转移入相邻的间充质并在那里聚簇。后面需要PDX1，通过正调节胰岛素和胰岛淀粉样多肽表达并抑制胰高血糖素表达以维持产生激素的β细胞表型(Genes Dev 12：1763-1768(1998))。也需要PDX-1调节β细胞中的GLUT2表达，提示在维持正常β细胞稳态中起着重要作用。
哺乳动物神经发生蛋白基因家族的成员之一，神经发生蛋白-3已鉴定为前分泌基因(见Proc Natl Acad Sci USA 97：1607-11(2000)Curr Opin Genet Dev 9：295-300(1999))，并认为是发育过程中胰岛祖细胞的标记(Development 129：2447-57(2002))。特征为胰岛来源细胞群的祖细胞表达神经发生蛋白-3。
使用化学或物理方法，例如通过在培养基中补充促进产生胰岛素的细胞分化的试剂，或在细胞外基质的存在下通过诱导形态变化如细胞簇β形成，可诱导内分泌祖细胞分化。诱导细胞分化也可是移植入允许环境的结果。例如，在肾囊下、皮下或小肠的粘膜下空隙中植入后，可见体内分化。
实施例3：培养基
用于原代培养的严格、诱导应激的培养基不含或基本上不含血清或器官提取物。
本发明原代培养基备有营养基，营养基还可补充或没有其它组分。营养基可包括无机盐、葡萄糖、氨基酸和维生素和其它基础培养基成分。例子包括：Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)；极限必需培养基(MEM)；M199；RPMI1640；Iscove′s改良Dulbecco’s培养基(EDMEM)；Ham′s F12，Ham′s F-10，NCTC109和NCTC 135。本发明优选的基础培养基包含3比1比例的没有葡萄糖、丙酮酸镁或丙酮酸钠，含4.0mM L-谷氨酰胺的不含钙或低钙DMEM的营养基，和含5mM葡萄糖的Ham′s F-12。基础培养基中最终葡萄糖浓度优选调节至约5mM。基础培养基中补充有一种或多种动物细胞培养领域技术人员已知的以下成分：胰岛素或胰岛素样生长因子；转铁蛋白或亚铁离子；三碘甲腺原氨酸或甲状腺素；乙醇胺和/或正磷酰基乙醇胺，氯化锶，丙酮酸钠，硒，非必需氨基酸，蛋白酶抑制剂(例如，抑肽酶或大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI))和葡萄糖。
在一个实施例中，培养基中不加入生长因子。在另一个实施例中，基础培养基还补充有诸如非必需氨基酸、生长因子和激素的成分。例如，加入TGF-β作为凋亡基因以促进分化肝细胞的凋亡，或加入TNFα作为分化胰岛、肝和上皮细胞的凋亡基因。可用于本发明的确定成分培养基参见Parenteau的美国专利5,712,163，该专利纳入本文作参考。可使用滴定实验测定补充物的合适浓度，如本领域技术人员所知的那样。优选浓度的例子如下所述：
在第二代培养基中胰岛素的优选浓度为5.0μg/ml。前胰岛素，胰岛素样生长因子如IGF-I或II可取代胰岛素。本文所用胰岛素样生长因子指结构类似于胰岛素并刺激胰岛素样生长因子受体的组合物。
优选地，在第二代培养基中通过转铁蛋白提供浓度约为0.05-50u g/ml，优选浓度约为5μg/ml的亚铁离子。
加入三碘甲腺原氨酸以维持细胞代谢速率。优选存在的浓度约为2-200pM，更优选约为20pM。
实施本发明可使用乙醇胺和正磷酰基乙醇胺中的一种或两种。两者都是在肌醇途径和脂肪酸代谢中作为前体起作用的磷脂。在不含血清的培养基中补充血清中通常存在的脂质是必需的。培养基中提供一种或两种乙醇胺和正磷酰基乙醇胺，优选浓度约为10-6M-10-2M，更优选约为10-4M。
使用的硒浓度约为10-9M-10-7M，优选约5×10-8M。使用的氨基酸L-谷氨酰胺或其取代物浓度约为1mM-10mM，优选约为6mM。
制备祖细胞连续传代的第二代培养基时，培养基中可加入其它成分，取决于，例如，所培养的特定细胞，包括但不限于，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TNF-α)、角质化形成细胞生长因子(KGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在第二代培养基中作为任选成分的EGF，使用的浓度低至1ng/ml。
第二代培养基的优选实施例包括：3∶1 DMEM(无葡萄糖，无钙，有4mM L-谷氨酰胺)和Ham′s F-12的基础培养基，补充有以下成分使每种成分的最终浓度为：6mM L-谷氨酰胺(或等价物)，1ng/ml EGF，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷酰基乙醇胺，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化锶，100mM丙酮酸钠，10mM非必需氨基酸和5mM葡萄糖。
虽然根据本发明增殖的细胞群包含一个阶段的祖细胞库，但可诱导进一步的定型分化和器官发育。需要时，第三代培养基使得祖细胞产生大多数过渡放大细胞并促进器官发育。用于产生过渡放大细胞的培养基的优选实施例包含1∶1 DMEM(无葡萄糖，无钙，含4mM L-谷氨酰胺)和Ham′s F-12的基础培养基，补充有以下成分使每种成分的最终浓度为：6mM L-谷氨酰胺(或等价物)，10ng/ml EGF或HGF或两者(取决于细胞类型)，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷酰基乙醇胺，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，100mM丙酮酸钠，2x10-9孕酮，1.1uM皮质醇，0.08mM氯化钙和9ng/mL毛喉素。
可将祖细胞以此培养基中约1,000-5,000个细胞/平方厘米的中等密度平板接种在涂布有胶原的塑料表面上，并至少培养一代。可使用细胞群或可启动进一步分化。需要进一步分化时，可将细胞转移至不含毛喉素的第三代培养基且增加钙浓度(例如)至1.88mM的条件下。也可包括其它培养环境的改变，例如，加入细胞外基质成分。一些环境条件的改变取决于组织类型，例如，可在气液界面培养表皮细胞，可在促进簇形成的基质条件中培养胰岛细胞，可在促进束形成的三维底物中培养肝细胞。
制备本发明使用的培养基的典型方法如下所述。然而，可使用其它常规方法制备本发明成分，在某些成分中用类似物或功能等价物取代或不取代。并且，可根据诸如年龄、大小和健康的因素，优化来自不同种的细胞和来自不同生物体的细胞系的补充物浓度。可用成分的不同浓度进行滴定实验，以得到该成分的最佳浓度。
在无菌条件下，从基础培养基和通过常规方法，如过滤灭菌产生或得到的成分开始，制备原代、第二代和第三代培养基。整个实施例中使用合适的无菌步骤。混合DMEM和F-12，然后加入各个成分完成培养基。所有成分的储备液可储存在-20℃，除了营养物源可储存在4℃。
可使用适合于动物细胞或组织培养的容器，如培养皿、培养瓶或滚瓶培养内分泌祖细胞。可使用材料如玻璃，不锈钢，聚合物，硅底物，包括融合硅和聚硅，以及其它生物相容材料作为细胞生长表面。本发明细胞可在固体表面或多孔表面如多孔膜上生长，以使培养基与培养细胞双向接触。此外，细胞生长表面材料可是化学处理或修饰的、静电荷的、或涂覆有生物试剂如肽或基质成分。实施本发明的优选生长表面是涂覆有I型胶原的常规组织培养表面。
培养优选维持在约34℃-38℃，更优选37℃，气体约5-10％ CO2，相对湿度约为80-90％。使用培养箱以维持培养细胞的控制的温度、湿度和气体混合物环境条件。
可收集居留祖细胞活化祖细胞的第一步中使用的培养基，并用于促进仍居留在扩展的培养中的祖细胞的活化。类似地，可使用增殖后面传代细胞的条件培养基，支持低密度接种的祖细胞的增殖。条件培养基可含有10-50％的营养培养基。或者，可通过除去普通肝素结合生长因子，浓缩并脱盐收集的培养基，产生更特殊的条件补充物。可以相当于原来起始物质的浓度使用浓缩的补充物。更详细的实施例如在以下实施例7中提供。
实施例4：移植
本发明提供移植入哺乳动物的方法。可将上述所需祖细胞移植入或引入哺乳动物或患者中。在一个实施例中，移植涉及通过将细胞悬浮液注射入哺乳动物或患者，将细胞群外科移植入哺乳动物或患者的组织或器官，或灌注具有细胞悬液的组织或器官，将祖细胞转移入哺乳动物或患者。转移祖细胞或移植的途径将由细胞居留在特定组织或器官的需要及细胞找到并由所需靶组织或器官保留的能力来确定。若要使移植细胞居留在特定部位，可用外科方法植入组织或器官(如十二指肠)中，或如果细胞具有迁移至所需靶器官的能力则注射入血流或相关器官，正如当注射入门脉循环或脾时肝细胞可定位于肝那样。
本发明特别考虑将同基因、同种异体基因或异种基因祖细胞或它们的混合物移植入患者。
实施例5：使用胰祖细胞治疗胰岛素依赖性糖尿病
祖细胞可用于代替1型糖尿病患者所失去的β细胞或在2型胰岛素依赖性糖尿病患者中增加β细胞的总量。优选尸体组织作为用来产生祖细胞的供体组织。从组织分离胰岛和选择祖细胞如下所述。培养物扩展后或一段时间由生长因子、激素和钙诱导的分化后，可直接将祖细胞移植入患者。在一个实施例中，祖细胞是免疫耐受的，以使在同种异体移植物中，它们不诱发体液或免疫细胞反应。在本发明该实施例的一方面，这些细胞一般不表达MHC类II型抗原，且不诱发促进T细胞活化的共刺激反应。
在本发明的另一个实施例中，移植物的受体可显示通过注射自身抗原如GAD65的封闭抗体，通过注射一种或多种本文所述免疫抑制药物，或通过本领域已知的防止或改善同种异体免疫和/或自身免疫排斥的任何方法，可对抗移植细胞的免疫反应。
实施例6：药物开发
成人器官祖细胞，尤其是浓缩或基本上纯的细胞群的独特性质，使得这些细胞成为鉴定(例如)器官调节和自分泌生长调节非常适合和理想的工具。尤其涉及致癌作用和研究如何体内刺激再生。可使用人细胞尤其有益。在明确化学成分的条件下使用系统的能力也利于研究和分析。
在一些实施例中，在上述方法的各阶段：从成熟器官的原代活化，第二代生长和连续传代，以及促进分化的第三代条件，使用基因芯片分析、多聚酶链反应、和/或蛋白组学分析，鉴定根据本发明培养的细胞群。使用相同的细胞株，通过比较活化的基因和产生的蛋白，及其在各阶段的表达水平，可观察到直接涉及细胞群调节中改变的差异。然后，在不同条件下，从类似或不同器官来源的多种人细胞株中比较这些反应，得到在成人器官中控制人细胞群的一般细胞途径。这些途径成为生物药物或药物治疗的候选靶点。一旦确立了靶点，可在系统中试验混合物以证实其在调节人细胞或器官型组织中的作用。
实施例7：建立和使用来自分离的人朗格汉胰岛的祖细胞
使用Ricordi首先提出的半自动方法(Diabetes 37：413-420，1988)分离人胰岛。通过导管内输注释放酶(Liberase)HI(Roche Molecular Biosciences，Indianapolis IN)或Serva胶原酶(Crescent Chemical，Brooklyn NY)，膨胀所得器官。连续消化约12-30分钟后，将组织收集于约8升的Hanks溶液中并洗涤。在Cobe 2991细胞分离器中，使用EuroFicoll连续梯度，从其它组织分离游离胰岛(Cell Tiss Res.310：51-58，2002)。
将约200个胰岛接种于含有4ml原代培养基(包含3∶1 DMEM(不含葡萄糖，不含钙，含4mM L-谷氨酰胺)和Ham′s F12的基础培养基，补充有以下成分使每一成分的最终浓度为：6mM L-谷氨酰胺(或等价物)，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷酰基乙醇胺，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化锶，1mM丙酮酸钠，100μM非必需氨基酸25μg/ml抑肽酶，9ng/ml毛喉素和5mM葡萄糖)的60mm涂覆胶原的培养皿中。
培养物孵育14天，期间细胞从分离的胰岛铺展开来。70％融合时，胰酶消化收集出现的祖细胞小细胞群。
胰岛来源祖细胞的连续传代
以4000个细胞/平方厘米在I型胶原涂覆的培养皿上，在第二代培养基(包含3∶1 DMEM(不含葡萄糖，不含钙，含4mM L-谷氨酰胺)∶F12的基础培养基，补充有以下成分使每种成分的最终浓度为：6mM L-谷氨酰胺(或等价物)，1ng/ml EGF，1×10-4M乙醇胺，1×10-4M正磷酰基乙醇胺，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml硒，24.4μg/ml腺嘌呤，1mM氯化锶，100mM丙酮酸钠，10mM非必需氨基酸和5mM葡萄糖)中，连续传代增殖的祖细胞。当建立细胞且达到至少30％融合时，加入表皮生长因子。80％融合或较小时传代细胞。
肝素分级条件培养基用于选择性刺激祖细胞
从活化的增殖祖细胞培养物收集条件培养基，并置于制备型肝素琼脂糖上以除去肝素结合生长因子。通过过滤浓缩保留组分并用G-100琼脂糖柱脱盐。无菌过滤浓缩组分，等分并储存在-70℃备用。用新鲜补充的基础培养基将浓缩组分重新构建至其原先体积，用于支持后传代或低密度祖细胞的增殖。
活化祖细胞的条件培养基
如上所述由胰岛建立培养基。在分化细胞凋亡的中间阶段和祖细胞集落形成开始时，从培养物中收集条件培养基。通过过滤浓缩条件培养基，并用G-100琼脂糖柱脱盐。用新鲜补充的基础培养基将浓缩组分重新构建至其原先体积，用于支持使用细胞分选或其它方法如产生慢周期胰小细胞培养物的培养物方法而获得新的祖细胞的活化。
胰岛祖细胞的体内分化
连续培养胰岛祖细胞至第6代。将胰酶消化的细胞悬浮在基础培养基中并用腹腔镜通过大针将细胞传递入十二指肠的粘膜下间隙。祖细胞聚簇并分化入产生胰岛素的胰岛组织。
部分分化的胰岛祖细胞组织的体内传递
连续培养胰岛祖细胞至第6代并用胰蛋白酶消化。在上述补充的基础培养基存在下，加入1.8mM氯化钙，10ng/mL毛喉素，4μg/ml皮质醇和I型胶原的涂覆层，将细胞接种于组织培养塑料板上。形成囊状结构。收集囊，原样递送或通过除去毛喉素并用胶原酶处理除去胶原涂覆层，进行进一步分化处理。或者，在上述补充的基础培养基存在下，加入1.8mM氯化钙，4μg/ml皮质醇，将细胞悬液接种于零重力培养系统中以促进悬浮细胞聚簇的形成。使用套针将囊或部分分化的聚簇腹腔镜注射入十二指肠的粘膜下间隙或可选地注射入肝门静脉。
不背离本发明的精神或其必要特征，本发明可进行其它具体形式的实施例。因此，在所有方面认为上述实施例是示例性的而不是对本文所述发明的限制。因此，由所附权利要求书而非上述说明书限定本发明的范围，本文包括在权利要求书的意义或等价范围内的所有改变。
上述每种专利文献和科学出版物纳入本文作为参考。

Claims (25)

1.一种体外增殖祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含祖细胞及正在分化的细胞和分化细胞中至少一种的在无血清培养基中的原代细胞培养物；
在原代细胞培养物中诱导应激反应，其中所述应激反应允许祖细胞复制并抑制所述正在分化的细胞和分化细胞中至少一种的增殖；和
鉴定复制所得祖细胞群，其中所述祖细胞群构成原代细胞培养物中的大多数细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述应激反应包括凋亡。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述应激反应包括坏死。
4.如权利要求1所述的方法，包括从原代细胞培养物中分离祖细胞的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，包括培养祖细胞以提供次生细胞培养物的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养步骤包括祖细胞群的不少于5次的传代。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原代细胞培养物包含选自以下的细胞：上皮细胞、胰细胞和肝细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正在分化的细胞和分化细胞中至少一种是导管上皮细胞、抚育细胞、基质细胞或成纤维细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基基本上不含器官提取物。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含约0mM-0.9mM钙离子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养基包含浓度约为0.08mM的钙离子。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基基本上不含生长因子。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计所述培养基以抑制细胞粘附。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含配体、抗原、抗体、生长因子、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、辅因子和激素中的至少一种。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导应激反应的步骤包括调节胱冬酶途径、Bcl-2途径、白介素-10途径及AKT-介导途径中的至少一种。
16.如权利要求1所述的方法，所述培养基包含肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-样细胞凋亡的弱诱导剂(TWEAK)、TNF相关诱导细胞凋亡的配体(TRAIL)、白介素(IL)、Fas配体、凋亡诱导蛋白配体、转化生长因子、内毒素、正常T细胞表达和分泌的活化调节因子(RANTES)、干扰素和噁玳酸中的至少一种。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含至少一种选自以下的分子：氧化氮、TNF-α、IL-10、IL 1-β、APO-3L、APO-2L、TGF-β、IFN-γ和脂多糖。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含环腺苷酸(cAMP)升高剂。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述祖细胞群由数量至少约为80％的祖细胞构成。
20.如权利要求1所述的方法，还包括刺激祖细胞群分化的步骤。
21.一种在哺乳动物中预防或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：
将按照权利要求4所述的方法分离的祖细胞移植入哺乳动物。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病。
23.一种维持在确定成分培养基中的包含祖细胞的体外祖细胞群，其中，所述确定成分培养基在细胞培养中诱导应激反应，并且，所述祖细胞群在数量上构成培养基中所有细胞的大多数。
24.如权利要求23所述的体外祖细胞群，其特征在于，所述确定成分培养基不含血清和生长因子，含有浓度不大于约0.09mM的钙离子，其中，所述祖细胞群构成不少于培养基中所有细胞的80％，且所述祖细胞能够分化和新生。
25.一种从非胎组织体外增殖的基本上纯的哺乳动物祖细胞群。
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