KR100374976B1 - 기능성랑게르한스섬의시험관내성장및그생체내사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 최초로, 시험관내 배양으로 기능성 섬의 성장을 가능케 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 당뇨병의 생체내 치료를 위하여 포유동물에 이식하기 위한 시험관내 생성 섬형 구조물의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 다시, 정상 췌장 조직에서 관측되는 것과 같은 기능적, 형태학적 및 조직학적 특징을 지닌 생체내 기관을 성장하기 위하여 시험관내 성장 섬 이식편을 사용하는 방법에 관한 것이다. 시험관내에서의 이들 세포 및 생체내에서의 이들 기관의 성장능력은 당뇨병과 관련된 연구 및 치료에 있어서 중요한 새로운 수단을 제시하고 있다.

Description

기능성 랑게르한스 섬의 시험관내 성장 및 그 생체내 사용방법

발명의 배경

당뇨병은 하나의 주요한 일반 대중의 건강 문제이다. 국립 당뇨병 자문회 (National Diabetes Advisory Board)에 의하여 의뢰된, 당뇨병을 퇴치하기 위한 국가 장기 계획의 1987년 보고서 (1987 Report of The National Long-Range Plan to Combat Diabetes)에 제시된 바와 같이 , 미국에서 600만명이 당뇨병을 앓고 있는 것으로 알려져 있으며, 다시 500만명이 아직 진단되지 않은 질병을 갖고 있다. 해마다, 50만 이상의 새로운 당뇨병 환자가 확인되고 있다, 1984년에 당뇨병은 35,000 미국인 사망의 직접적인 원인이 되었으며 별도의 95,000인의 사망에 관련되는 요인을 제공하였다.

당뇨병에 의한 시각상의 합병증은, 미국내 20 ~ 74세 국민에 있어서의 새로운 경우의 법적맹의 선도요인이 되고 있다. 하지 절단 위험은 당뇨병을 지닌 자가 당뇨병을 지니지 않은 사람보다 15배나 높다. 신장병은 흔하고도 심각한 당뇨병의 합병증이다. 말기 상태의 신장병 치료를 받고 있는 미국내의 모든 신규 환자의 약 30%가 당뇨병을 갖고 있다. 당뇨병을 지닌 사람은 치주에 생기는 질병의 위험도 높다. 치주염은 신속히 진전되어 치아를 상실하게 될 뿐만 아니라, 신진대사 기능을 손상시키게 된다. 당뇨병을 지닌 여성은 심각한 임신 합병증의 위험이 있다, 현재 통계로는, 당뇨병을 지닌 산부의 영아 생존율은 약 7%이다.

분명히, 당뇨병의 경제적 부담은 막대하다. 해마다, 당뇨병 환자 또는 그 합병증 환자가 병원에서 지내는 날은 2400만일이나 된다. 줄잡은 어림으로, 당뇨병에 소요되는 1년간 비용은 적어도 240억불 (미국 당뇨병협회 추정, 1988)이 되나; 당뇨병 자체보다도 오히려 당뇨병의 특정 합병증에 흔히 별도의 의료 비용이 소요되기 때문에, 이 질병으로 인한 전반적인 경제적 충격은 보다 심각한 것이다.

당뇨병은 신체가 탄수화물, 지방 및 단백질을 적절히 유지하고 사용하는 것을 불가능하게 하는, 만성의 복합 대사성 질환이다. 이것은 다양한 유전적이며 환경적인 요인의 상호 작용에 의하여 초래되며, 인슐린 생성의 결핍 또는 그 사용의 손상에 의하여 야기되는 높은 혈당량을 특징으로 한다. 당뇨병의 대부분의 경우는 2가지의 임상 형태에 속한다: 형태 I, 즉 소아형 및 형태 II, 즉 성인형이다. 형태 I 당뇨병은 흔히 인슐린 의존성 당뇨병 즉 IDD라 불리운다. 각 형태는 상이한 예후, 치료방법 및 원인을 갖는다.

약 5 ~ 10%의 당뇨병 환자가 IDD이다. IDD는 통상 랑게르한스의 췌장섬의 인슐린 생성 β 세포의 파괴에 기인하는, 부분적 또는 완전한 인슐린 생성 불능을 특징으로 한다. IDD 환자는 매일 인슐린을 주사하여 그 질병을 제어하지 않으면 사망하게 된다.

1970년대 중반까지 당뇨병의 병인을 해명하는데 있어서 몇가지 진전이 있었는데, 이 시기에 형태 I IDD가 자동면역 원인 병인론을 갖고 있다는 증거자료들이 수집되기 시작하였다. 현재는 IDD가, 유전학적으로 발병할 소질이 있는 사람의 랑게르한스의 췌장 섬의 인슐린 생성 β 세포를 선별적으로 파괴하는, 진행성 자동면역 반응으로부터 기인하는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있다. IDD의 β 세포에 대한 자동면역은 체액 (벡케스코브 (Baekkeskov)등, 1982; 벡케스코브 등, 1990; 레디 (Reddy) 등, 1988; 폰테실리(Pontesilli) 등, 1987) 및 세포 - 매개 (레디 등, 1988; 폰테실리 등, 1987, 왕 (Wang) 등, 1987) 면역 메카니즘 모두와 관련된다. 체액 면역은, β 세포막에 대한 자동항체의 표출 (항 - 69kD 및 섬 - 세포표면 자기 항체), β 세포 함량 (항 - 카르복시펩티다아제 A₁, 항 - 64kD 및 / 또는 항 - GAD 자기항체), 및 / 또는 β 세포 분비 생성물 (항 - 인슐린)을 특징으로 한다, 혈청은 IDD를 옮기지 않으나, 항 - β 세포 자기항체는 매우 어릴때 발생하여, 환경적인 자극에 대한 의문을 일으키며, 아마도 항원의태와 관련된다. IDD의 자연 경과중의 세포 - 매개 면역학적 반응성의 존재는, 인슐린 염이라고 하는, 췌장 섬내의 염증성 장애로 증명되었다. 염증성 / 면역 세포 침윤물이 조직학에 의하여 선명하게 눈에 보이는 인슐린 염은, T 및 B 임파구, 단핵구 및 천연 킬러 세포를 포함하는 수많은 세포형태를 포함하는 것으로 알려져 왔다 (시그노어 (Signore) 등, 1989; 자아페 (Jarpe) 등, 1991). 인체 IDD의 모델로서 NOD (비 - 비만 당뇨병, Non-Obese Diabetic) 마우스를 사용하는 채택 이입 실험(adoptive transfer experiment)은, IDD의 병인에 있어서 자동 - 공격형 T 임파구에 대한 주요 역할을 굳건히 확립하였다 (벤델락 (Bendelac) 등, 1987; 밀러 (Miller) 등, 1988; 하나후사 (Hanafusa) 등, 1988; 벤델락 등, 1988). 유감스럽게도, 췌장 β 세포 파괴의 근원적인 메카니즘은 미지의 상태로 남아 있다.

췌장 β 세포에 대한 면역학적 공격을 저지하기 위한 가능한 수단으로서, 수많은 방법 (예를들면, 골수이식, 면역억제약 및 자기항원 면역화)이 조사되어 왔다. 그러나, 이들 시도가 효과적이기 위하여는, 결과적으로 임상적 질병으로 발전하는 개체가 확인되어야 한다. 대개는, 많은 퍼센트의 β 세포가 이미 파괴된 지점까지 면역학적 공격이 진진되기 때문에, 환자는 효과적인 개입 치료를 하기에는 너무 늦게 확인된다. β 세포는 말기 분화된 세포로 생각되기 때문에, 몸체는 신규의 β 세포를 재생하기에는 용량이 작아서, 정규적인 장기간의 인슐린 치료를 필요로 한다. 최근, 이와 같은 문제점을 극복하기 위한 하나의 시도는 섬 세포 이식술이다, 섬 세포 이식술은, 섬이 동종(allogenic)이어서 다음에 동종 면역(allo-immune) 반응을 일으킬 수 있다는 단점이 있다. 따라서 IDD 환자로부터 직접적으로 기능적 β 세포를 함유하는 랑게르한스 섬을 성장시키면 큰 장점을 지니게 된다.

발명의 요약

본 발명은 인슐린 생성 β 세포 및 기타 섬 세포 형태를 함유하는 기능적 섬이, 단일 만능-(pluripotent) 간세포로부터 장기간 배양으로 성장될 수 있다는 발견에 관한 것이다.

본 발명의 신규 방법은 만능 간세포가 성인의 췌장에도 존재한다는 발견을 이용하고 있다. 세포는 정상 혈청으로 보충되는 고아미노산 영양 배지에서 배양될 수 있는데, 상기 정상 혈청은 섬 세포의 근원 역활을 하는 동일 포유동물류로부터 유도되는 것이 바람직하다 (상동 혈청). 이 배양주는 다음에 수주일 동안 방해받지 않은 상태로 남아 간질 세포의 구축을 허용하게 된다. 일단 이 간질 세포층이 성숙하면, 상동성의 정상 혈청과 글루코오스로 보충된 고 아미노산 배지로 세포 배양주를 재공급함으로써 세포 분화가 개시될 수 있다. 추가 기간의 성장 후, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 분비억제 호르몬 및 기타 내분비 호르몬을 생성하는 세포를 함유하는 기능성 섬이, 표준 기술을 사용하여 회수될 수 있다.

췌장 세포가 배양에 있어서 β 세포를 포함하는 신규 섬 세포의 성장에 사용될 수 있다는 것은, 이전에는 알려지거나 추측되지 않았다. 시험관내에서 섬과 같은 조직의 성장을 위한 배양 기술의 뜻밖의 발견은, 당뇨병 연구에 있어서 종전에 실질적으로 오랫동안 장벽이 되었던 문제점을 제거하게 된다, 여기에 기술된 신규방법 및 물질은 당뇨병의 메카니즘을 보다 용이하게 이해할 수 있게 한다. 또한 배양주에서 섬 세포를 성장시키는 능력은, 최초로 가능한 소정의 당뇨병 치료방법을 제시하게 된다. 예를 들면, 본 발명에 따라, 당뇨병 환자로부터의 신규 배양 섬이, 인슐린 치료에 대한 환자의 필요성을 조절 또는 제거하는 방법으로서, 환자에 이식될 수 있는데, 그것은 배양된 섬 및 / 또는 섬 세포가 생체내에서 인슐린을 생성할 수 있기 때문이다. 따라서 본 발명은, 본 발명의 시험관내 성장 섬을, IDD의 생체내 치료를 위하여 포유 동물류에 이식하는데 사용하는 것과도 관련된다.

본 발명은 또한, 수반되는 면역학적 파괴에 저항하는 섬 세포의 유전자 조작을 매우 용이하게 한다, 예를들면, 배양된 섬 세포는, 파피적 면역공정을 억제 또는 방지하는 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 형질전환될 수 있다. 기타 유용한 단백질 또는 펩티드가 발현될 수 있다.

즉, 개체의 췌장 세포로부터 시험관내 기능성 섬을 성장시키는 능력은, 주요한 기술적 약진을 나타내며, IDD를 치료하는 신규 방법의 사용을 용이하게 한다. 만능 간세포가 성인 췌장에 존재한다는 발견으로, 세포의 공급원으로서 태아 조직을 사용할 필요성이 없게 된다.

본 발명은 또한 여기에 기술된 방법에 따라 시험관내에서 생성된 섬세포에 관한 것이다. 이들 세포는 시험관내에서 배양된 포유동물 췌장세포 부유액으로부터 생성될 수 있으며, 기능적 섬 세포 및 섬과 같은 조직 구조를 발생시킬 수 있다.

본 발명은 다시, 췌장 간세포 즉, 선조세포, 또는 즉 정상 췌장을 구성하는 모든 상이한 형태의 세포 및 조직을 형성할 수 있는 세포의 시험관내 성장, 증식 및 분화에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 정상적인 췌장에서 관측되는 것과 유사한, 기능적, 형태학적 및 조직학적 특징을 나타내는 " 외 - 췌장" (ecto-pancress) 기관을 생성하기 위하여, 시험관내 성장 췌장 간세포를 생체내에서 사용하는 것에 관한 것이다. 따라서, 시험관내 성장 췌장세포로 부터 생체내에 기능성 " 외 - 췌장" 을 생성하는 능력은, 췌장의 손상 또는 파지를 야기시키는 것으로 알려진 광범위한 췌장질병의 치료, 회복 또는 치유에 사용될 수 있다.

제1A도 내지 1D도는 본 발명의 공정에 따라 성장된 세포를 나타낸다.

제2도는 본 발명에 따라 성장된 섬을 나타낸다.

본 발명에 따라, 기능성 랑게르한스 섬이 최초로 시험관내 배양으로 성장될 수 있다. 본 발명의 기술은, 인슐린, 글루카곤, 성장호르몬 분비 억제 호르몬 또는기타 내분비 호르몬을 생성할 수 있는 세포 배양주를 초래하게 된다. 대상 단백질을 코드화하는 DNA로 섬 세포를 형질전환시키는 등의 방법에 의하여, 기타 유용한 단백질도 제조될 수 있다. 이들 기능성 세포 배양주를 성장시키는 능력은 당분야의 숙련자로 하여금 종전에는 불가능 하였던 방법을 실행 가능케 한다.

본 발명의 방법은 포유동물의 췌장으로부터 간세포의 부유액을 제조하는 방법을 포함한다. 바람직하게는 간세포는 당뇨병전증 포유동물의 췌장으로부터 얻을 수 있다. 그러나, 이미 당뇨병의 임상 징후를 나타내는 포유동물의 세포가 본 발명에 사용될 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 세포 부유액은 표준기술을 이용하여 제조된다. 세포부유액은 다음에 세포의 성장을 용이하게 하는 영양배지에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, 영양배지는 고농도의 아미노산을 지닌 것이다. 그와같은 하나의 배지는 클릭의 EHAA 배지로 잘 알려져 있으며 당분야의 숙련자는 용이하게 얻을 수 있다. 기타 동등한 영양 배지가 제조되어 당분야의 숙련자에 의하여 사용될 수 있다. 섬 세포를 부유시키기 위하여 사용되는 배지는, 섬 세포의 공급원이 되는 동일 포유동물류로부터의 정상 혈청으로 보충되는 것이 이롭다. 따라서, 마우스 섬의 경우에 있어서, 배지는 정상적인 마우스 혈청으로 보충되는 반면에, 인체 섬 세포인 경우에는 배지는 정상적인 인체 혈청으로 보충된다. 정상적인 혈청의 제조는 당분야의 숙련자에 잘 알려져 있다. 본 발명의 세포배양법에 사용되는 정상적인 혈청의 농도는 약 0,5% ~ 약 10% 범위인데, 마우스의 경우는 바람직하게는 약 1%이다. 인체 혈청에 있어서는 약 5% 정도로, 높은 농도가 바람직하다.

정상 혈청으로 보충된 영양배지에서 제조된 세포 부유액은 다음에 세포성장을 용이하게 하는 조건, 바람직하게는 약 35 ~ 40℃ 및 바람직하게는 약 5% CO₂대기에서 배양된다. 이 배양기간은, 따라서, 당분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 공정을 이용하여 수행된다. 다음에 세포 배양주는 수주 동안 공급없이 방해받지 않은 상태로 남겨지는 것이 바람직하다. 바람직하게는 배양주는 약 3주 이상 방해를 받지 않는다. 이 기간 중에 간질 세포는 증식되며 및 궁극적으로 섬 세포를 발생시키는 단층을 구축한다. 세포분화의 개시는, 상술한 바와 같이, 정상 혈청으로 보충된 클릭의 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써 일어날 수 있다. 재공급을 신속히 하면 상당한 세포분화로 광범위한 섬 병소(islet foci) 형성을 유도하는 것으로 판명되었다. 섬형 구조물에 세포를 병리학적으로 검사하면, 적어도 3개의 구별되는 세포형태가 식별될 수 있으며, 대조 마우스의 섬으로부터 제조된 섬 세포와 유사한 것으로 나타났다. 이들 병소(foci) 내에서 발생하는 세포 분화를 위해 요구되는 시간은 공급의 빈도가 증가함에 따라 감소하였다.

본 발명자들은 섬 - 유도 간질세포와 섬 병소를 새로운 배양 플라스크에 연속적으로 이전함으로써 섬 생성 배양주를 증식 및 확대할 수 있었다. 이것은, 예를들면 IDD의 신진대사 문제를 반전시키기 위하여 여기에 기술된 방법에 사용하는데 요구되는 충분한 수의 섬의 생성을 용이하게 한다.

본 발명에 따라 시험관내 제조된 섬형 구조물 및/또는 섬 세포가 IDD를 반전시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 섬형 구조물이 NOD 마우스들에 이식되었다. 섬 이식편을 수용한 마우스들은 인슐린 - 의존 당뇨병의 반전을 나타낸 반면에, 미처리 NOD 마우스들은 임상학적 질병의 징후를 보였다. 또한, 이식편의 존속기간 중 어떤 자기면역 발병도 관측되지 않았다. 따라서 본 발명의 섬 이식편은, 인체를 포함하는 포유동물의 당뇨병 치료를 위하여 생채내에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 면역학적 공격에 관련된 특정 인자에 대하여 저항하도록 조작된 자가이식 섬의 재이식에 의하여, 당뇨병의 진전이 늦추어지거나 정지될 수 있다. 예를들면, 섬은 세포독성 T세포 - 유도인티페론 - γ에 저항력이 있도록 조작될 수 있다. 전체 섬을 장기간 배양할 수 있다는 것은, β 세포의 세포인식, 섬 침윤의 양식 및 β 세포 파괴의 면역메카니즘을 포함하는, IDD의 병인 조사에도 사용될 수 있다. 또한, 이 기술은 섬 이식, 자가이식 섬 대체 및 인공 섬의 개발도 용이하게 한다. 본 발명의 방법에 따른 이들 세포의 성장은, 세포 분화 및 기능과 관련된 중요한 관점을 학생들에게 가르치는데 매우 유용하다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 만능 췌장 간세포가 포유동물로부터 유리된 췌장세포로부터 시험관내 성장된다. 본 발명의 방법과 관련하여 이들 시험관내 성장 세포를 이용하는 놀라운 발견은, 생체내에서, 기능적, 형태학적, 조직학적 내분비 및 외분비 조직을 나타내는 기관을 성장 및 생성할 수 있는 능력이다. 본 발명에 따라 생체내에서 생성된 외 - 췌장 (몸체내의 비정상 부위에 위치한 기관형 췌장)은 주요한 과학적 발견을 나타내며, 다수의 췌장 관련 발병 조건의 연구, 처방, 반전 또는 치료를 위한 신규 수단을 제공한다.

여기에 사용된 바와 같이 " 성장" 이라는 용어는 세포를 살아있는 상태로 유지시키는 것을 가리키며, 이들만에 국한되는 것은 아니나, 세포의 증식 및 / 또는분화를 포함한다 " 증식" 이라는 용어는 세포분열의 결과 배양주에 존재하는 세포의 수가 증가하는 것을 가르킨다.

아래의 실시예는, 본 발명을 실시하기 위하여, 최상의 양태를 포함하는 공정을 설명하고 있다. 이들 실시예는 제한적으로 해석되어서는 안된다. 별도의 지시가 없는 한 모든 백분율은 중량기준이며, 모든 용매 혼합물 비율은 용적 기준이다.

실시예 1 - 기능적 랑게르한스 섬의 배양

다른 문헌 (쉬이 (Shieh) 등, 1993)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 19 ∼ 20주된, 당뇨병전증의 숫 NOD / UF 마우스들의 췌장으로부터 유리된 전체 섬으로부터, 섬 세포의 단세포 부유액을 준비하였다. 전형적으로, NOD 군체의 약 25%의 숫 마우스들이 이 나이에서 명백한 IDD를 가지며 모두가 심각한 인슐린 염증을 갖게 된다. 섬 세포를 정상 마우스 혈청 (NMS) 1% (펙 (Peck) 및 바하 (Bach), 1973; 펙 및 클릭 (Click), 1973)로 보충된 클릭의 EHAA 배지에 재부유하고, 25㎠의 조직배양 플라스크에 평판 배양하고 및 5% CO₂대기중 37℃에서 배양하였다. 이 단계에서, 2가지 결과가 가능하게 된다. 첫째, 섬 - 침입 세포가 우위를 차지하여 면역세포주가 구축될 수도 있고, 또는 둘째로, 간질형 세포가 우위를 차지하여 " 영양세포" (" nurse cell" ) 단층의 성장을 허용할 수도 있게 된다. 간질형 세포 단층의 성장은, 섬 침입세포가 일시에, 그러나 제한된 숫자로 평판 배양될 때 일어나는 것으로 나타났다. 침입세포의 수가 감소된 섬 세포의 농축은, 경사 분리법 (자아페(Jarpe) 등, 1991)에 의하여 달성될 수 있다. 간질세포 배양주는 4 ~ 5주간미방해 상태 (즉, 재공급 없이)로 방치되면, 증식되어 배양용기의 전체 바닥면을 덮게 된다. 세포의 이 단층으로부터, 마치 간질 세포층으로부터 나타난 것처럼, 작공 둥근 세포가 거의 나타났다.

NMS 및 글루코오즈 또는 슈크로오즈 또는, 설탕 동등물을 포함하는 설탕용액으로 보충된 클릭의 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써, 배양주의 분화가 개시되었다. 전형적으로 설탕은 클루코오즈이다. 클루코오즈의 농도는 약 10mM ∼ 25mM일 수 있는데 통상적으로는 15 ∼ 17mM이다. 바람직하게는, 배지내의 클루코오즈의 농도는 약 16mM이다. 시험관내 세포 배양주 재공급 기술은 당분야에 잘 알려져 있는데, 통상적으로 약 50% ~ 약 90%의 오래된 영양 배지를 제거하고 및 배양 플라스크에 새로운 배지를 첨가시키는 것을 포함한다. 재공급을 신속히 하면 세포 분화를 나타내는 섬 성장의 중심 (여기서 병소라 한다)의 수를 증가시키게 된다. 재공급 속도는, 예를들면 약 1주일 간격일 수 있다. 바람직하게는, 재공급 속도는 약 5 ~ 6일 간격이다.

최고점 생성시에 , 단일 25㎠ 조직 배양 플라스크에서 150 - 200개 만큼의 병소가 동시에 발생하였다. 세포증식 및 분화가 진전됨에 따라, 섬의 조직화가 일어나며 섬은 그 자신 캡슐형 물질에 둘러쌓는 것으로 보이기까지도 한다. 섬은 일반적으로 일정크기 (몇몇은 일반크기의 약 2배까지 성장되기도 하나)까지 성장한 후, 간질층을 떼어내어 매질에 부유하게 된다. 이들 유리 - 부유 섬은, 유사한 조건하에서 배양된 유리된 췌장 섬과 유사하게, 48 ∼ 72시간내에 파괴되는 경향이 있다.

자연분리 또는 파스퇴르 피펫을 이용하여 간질층으로부터의 제거후 수집된 섬형 구조물은 배지에서 온화하게 세척된 후, 환류 피펫작업에 의하여 단일 세포 부유액으로 분쇄되었다. 단일 세포 부유액을 세포원심분리에 의하여 제조한 후, 일반적인 형태 및 인슐린 생성을 위하여 염색하였다. 병소는 내분비 호르몬 글루카곤 (α 세포), 인슐린 (β 세포) 및 / 또는 성장 호르몬 분비억제 호르몬 (δ 세포)을 생성하는 세포를 함유하였다. 또한, 배양된 섬에 함유된 주된 세포 유형을 나타내는 항 - 인슐린 항체로 양성으로 염색된 세포의 주집단은 인슐린 - 생성 β 세포이다. 제 1A도 내지 1D도는 배양 과정 중 발전하는 다양한 세포 유형을 나타내고 있다. 제2도는 본 발명의 방법에 따라 세포의 시험관내 배양 후에 얻어진 잘 발전된 섬을 나타내고 있다.

실시예 2 - 인체 섬 세포의 배양

인체 섬 세포를 배양하기 위하여, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 공정을 이용하였다. 본 발명의 발명은 세포 배양을 개시하는데 있어서 태아 세포의 이용을 필요로 하지 않기 때문에 특히 유리하다. 하나의 바람직한 구체예에서, 인체 세포는 정상 인체 혈청으로 보충된 클릭의 EHAA 배지 (또는 그 동등물)에 부유될 수 있다. 바람직하게는, 배지에 사용된 정상 인체 혈청의 농도는 약 5%이다. 배양주는, 바람직하게는 수주간, 재공급 없이 미방해 상태로 방치되어야 한다. 배양 약 4 ~ 5주후, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 정상 인체 혈청 및 글루코오즈로 보충된 클릭의 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써 세포 분화가 개시될 수 있다. 뒤이어 섬형 구조물이 수집될 수 있으며, 실시예 1에 기술된 바와 같이 다시 증식을 위하여단일 세포 부유액이 제조된다.

실시예 3 - 시험관내 성장 섬 세포의 이식

IDD의 병발증을 반전시키기 위한, 이들 시험관내 생성 섬형 구조물의 효율성을 시험하기 위하여, NOD 마우스들의 췌장 조직으로부터 본 발명의 방법에 따라 시험관내 성장된 일부 간질세포 및 약 150 ~ 200 병소를 환류 피펫 작업에 의하여 조직 배양 플라스크로부터 이동하였다. 다음에 세포를 매일 인슐린 주사로 유지된 선천성 당뇨병 NOD 마우스들의 신장 캡슐 밑에 이식하였다. 이식은 피하주사침으로 신장 캡슐에 구멍을 내고, 엷은 피층 영역을 뀀으로써 완수하였다. 모세관을 조심스럽게 회수하고 구멍 부위는 뜸을 떴다. 각 이식 마우스의 외과적 절개는 피부가 치료의 징후를 보일 때까지 고정시켰다. 이식된 마우스들은 4일간은 종일 투여량의 인슐린 주사로 유지시키며, 다음에 2일간은 반나절 투여량으로 유지시킨 후, 마우스들에 더 이상의 인슐린 치료를 행하지 않았다. 대조 동물은 이식편을 수용하지 않은 당뇨병 NOD 마우스들로 구성하였다.

매일의 인슐린 주사로부터 차단되었을 때, 대조 NOD 마우스들은 혼수상태, 호흡곤란, 체중감소, 혈당량 증가, 소모증후군, 상처치료의 실패 및 3주 내의 사망을 포함하는, 명백한 질병의 신속한 발병 현상을 보였다, 이식된 NOD 마우스들은 약 180mg / dl의 혈당량 (이것은 마우스의 정상 범위보다 약간 상회하는 수치임)을 유지하였고, 증가된 활동성, 외과적 및 혈액 유출부위의 신속한 치료 현상을 보였으며, 호흡곤란을 일으키지 않았고, 조직학적 연구를 위하여 죽을 때까지 건강을 유지하였다. 비장내 이식에서도 유사한 현상이 관측되었다.

실시예 4 - 외 - 췌장의 생체내 생성

실시예 3에 기재된 바와 같은 섬 세포로 이식된 마우스의 이식부위의 조직학적 검사결과는 시험관내에서 생성된 섬 - 형성 간세포의 또다른 특징을 나타내었다. 신장의 이식부위로부터 " 유출된" (" leaked" ) 이식 세포는 다시 증식 및 분화되었고, 고도로 구조된 외 - 췌장을 형성하였다. 첫째, 내분비 췌장으로 조직을 형성한 증식 내분비 세포만으로 구성된 외 - 췌장조직은 혈관을 자극하는 것으로 완성된다. 이 외분비 췌장은 섬형 내분비 구조물을 형성하도록 진전된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 시험관내 세포 배양주는 완전히 새로운 췌장을 재생성할 수 있는 만능 췌장 간세포를 함유한다. 내분비 및 외분비 조직 모두를 함유하는 췌장의 성장은, 췌장염 및 췌장암을 포함하는 췌장병의 새로운 치료방법을 제공한다.

여기에 기재된 실시예 및 구체예는 오직 예시적인 목적만을 위한 것이며, 그와같은 점에서의 다양한 수식 및 변경이 당분야의 숙련자에게 암시될 수 있고, 본 출원서의 범위 및 취지와 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.

참 고 문 헌

Claims (23)

1. 정상 혈청으로 보충된 영양 배지에서 포유동물류로부터의 췌장 세포 부유물을 배양하는 단계, 간 세포(stem cell)를 포함하는 간질층(stromal layer)을 구축하기 위해 3주 이상 동안 상기 세포가 성장되도록 하는 단계, 및 정상 혈청으로 보충된 영양 배지로 상기 세포 배양주를 재공급함으로써, 성숙 섬 세포로의 세포 분화를 개시하는 단계를 포함하는 간 세포의 시험관내 성장방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 췌장 세포가 인체 췌장 세포이며 혈청이 정상 인체 혈청인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 췌장 세포가 마우스 췌장 세포이며 혈청이 정상 마우스 혈청인 방법.
4. 제1항에 있어서, 영양배지가 고 아미노산 영양배지를 포함하는 방법,
5. 제1항에 있어서, 세포 배양주를 재공급하는데 사용된 배지가 글루코오즈를 더 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 배양된 간세포의 분화가, 상기 쉐포 배양주를 상동성의 정상 혈청으로 보충된 영양배지로 재공급함으로써 4 ∼ 5주의 배양주 성장 시점에서 개시되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 배양주의 재공급에 의하여 세포분화가 개시된 후, 배양주가 1주일 간격으로 재공급되는 방법.
8. 제1항의 방법에 의하여 생성된 섬 간 세포.
9. 제1항에 있어서, 섬형 조직이 상기 간 세포의 분화후에 생성되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 정상 혈청이, 췌장 세포가 얻어지는 포유동물과 동류의 포유동물로부터 얻어지는 방법.
11. 제9항의 방법에 의하여 생성된 섬형 조직 구조물.
12. 정상 혈청으로 보충된 영양배지에서 포유동물류로부터의 췌장 세포를 배양하는 단계, 간 세포를 포함하는 간질층을 구축하기 위해 3주 이상동안 상기 세포가 성장되도록 하는 단계, 정상 혈청으로 보충된 영양배지로 상기 간 세포 배양주를 재공급하여 세포분화를 개시하는 단계, 및 상기 세포 배양주로부터 내분비 호르몬을 회수하는 단계를 포함하는, 내분비 호르몬 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 호르몬이 인체 호르몬인 방법.
14. 제12항에 있어서, 호르몬이 마우스 호르몬인 방법.
15. 제12항에 있어서, 정상 호르몬으로 보충된 영양배지로 간세포 배양주를 재공급함으로써, 분화가 4 ∼ 5주의 배양 성장 시점에서 개시되는 방법.
16. 제12항에 있어서, 내분비 호르몬이 인슐린, 글루카곤 및 성장 호르몬 분비억제 호르몬으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
17. 제1항의 방법에 의하여 생성된 섬형 구조물 또는 섬 간 세포를 인간을 제외한 포유동물의 조직에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물에 췌장형 기관을 생성하는 방법.
18. 제17항의 방법에 따라 인간을 제외한 포유동물 생체내에 췌장형 기관을 생성하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 췌장의 질병을 치료하는 방법.
19. 제17항의 방법에 의하여 생성된 췌장형 기관.
20. 제1항에 있어서, 성숙 섬 세포가 α 세포, β 세포 및 δ 세포로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 방법.
21. 제17항에 있어서, 포유동물에 이식된 섬형 구조물 또는 섬 간 세포가 이식편을 수용하는 포유동물에 자가이식적(autologous)인 방법.
22. 제17항의 방법에 의하여 생성된 췌장형 기관을 지닌 인간을 제외한 포유동물.
23. 제22항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물이 마우스인 인간을 제외한 포유동물.