JP2813467B2 - 細胞培養法および培地 - Google Patents

細胞培養法および培地

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、分化した哺乳動物細胞の培養のための方法
および培地に関する。
発明の背景 多数の種類の細胞は、増殖に適当な栄養素および他の
条件が与えられるならば、培養で増殖することができ
る。例えば、固定されたカエルリンパ下においてカエル
胚から皿中に外植された神経組織が軸索突起を生じたこ
とにハリソン（Harrison）が注目した1907年以来、科学
者達は、種々の源から培養された組織および細胞を多数
用いてきた。このような培養は、遺伝学的、生理学的お
よび他の現象を研究をするために、更には当該技術分野
において知られている各種発酵技術を用いてある種の高
分子を製造するために用いられてきた。哺乳動物細胞生
物学の研究において、リンパ節、筋肉、結合組織、腎
臓、真皮および他の組織源に由来する細胞培養が用いら
れてきた。概して、研究用の細胞培養調製試料に最も可
能であった組織源は、発生初期の祖先中胚葉細胞に由来
するものである。祖先内胚葉および外胚葉細胞の子孫で
ある組織は、最近になってやっと、わずかに限られた種
類だけが細胞培養しやすくなってきた。発生初期の内胚
葉および外胚葉に由来する細胞種としては、表皮、毛、
爪、脳、神経系、消化管の内膜等がある。本質的に、正
常に分化した腺および上皮細胞、特にヒト由来の細胞の
長期間培養はまだ利用できない。
哺乳動物膵臓の場合、本発明まではどの科学者も、持
続した細胞分裂および膵臓独特の腺の性質を示した膵臓
内分泌腺細胞の細胞培養を研究する機会がなかったし、
そしてそれを治療に用いる展望を持った医師はいなかっ
た。
ニューロンと同様、哺乳動物膵臓の内分泌腺細胞は、
有糸分裂後、すなわち、分裂終了、本質的には非分裂の
細胞であると考えられてきた。最近の研究は、哺乳動物
膵臓の細胞（ヒトの細胞を含む）は培養中で生存しうる
が持続した細胞分裂はできないということを示した。し
たがって、組織細胞の一次培養は成功したが、培養され
た細胞の不十分な細胞分裂のために、連続培養を生成す
るための一次培養の継代は不可能であった。中期段階の
偶発的細胞、トリチウム化チミジンの吸収および他の細
胞分裂の形跡はこれらの培養において見られたが（クラ
ーク（Clark）ら、Endocrinology，126,1895（1990）；
ブレルジー（Breljie）ら、Endocrinology，128,45（19
91））、細胞分裂の全体の速度は置換速度未満であると
考えられた（すなわち、生産されるよりも多数または同
程度の多数の細胞が死滅する）。したがって、本発明以
前の膵臓内分泌腺細胞培養は増大されなかった。
培養において、膵臓内分泌腺細胞を研究することがで
きないことは、膵臓疾患の分野における医学の能力が進
歩するのを妨げていた。このような疾患としては、血流
中の糖の蓄積を妨げるのに役立つホルモンであるインス
リンホルモンを十分な量生産するランゲルハンス島（膵
臓内の構造）のβ細胞の能力を損傷するまたは破壊する
病気である真性糖尿病がある。Ｉ型真性糖尿病（インス
リン依存性または若年発症型糖尿病）は、典型的に、完
全なホルモン置換療法を必要とする。第二の（より一般
的な）型の病気であるII型糖尿病（時々、末期発症型ま
たは老年糖尿病と称する）において、II型糖尿病に罹患
している患者は、食物摂取を注意深く管理することによ
って血糖レベルを調節ることができるので、治療にはイ
ンスリン注射を必要としないことが多い。しかしなが
ら、これらの患者の30％程度はβ細胞機能をも低下させ
ており、したがってホルモン置換療法も候補である。糖
尿病はヒトに限られないが、他の哺乳動物、例えば、イ
ヌおよびウマなどにおいても注目されている。
糖尿病の病状の病因学は十分に理解されていない。し
かしながら、自己免疫抗体（「誤って」身体構造を攻撃
する抗体）および／またはある種のＴリンパ球は、糖尿
病の臨床症状が現れる前に長期にわたって関与している
ということが注目されている。この方向の根拠は、一部
分は、最近の診断の糖尿病患者の治療が免疫抑制薬であ
るシクロスポリンによって成功したことによる。このよ
うな治療は、マウス（モリ（Mori）に、Diabetologia
29,244〜247（1986））、ラット（ヤウォルスキー（Jaw
orski）ら、Diabetes Res.3,1〜６（1986）およびヒト
（フォートレン（Feutren）ら、Lancet，11,119〜123
（1986））においてインスリン依存性真性糖尿病の緩和
を妨げるかまたは引き起こすことが分かっている。これ
らの体液性および細胞性免疫反応の存在を検出する臨床
試験は、糖尿病前記の状態の固体のスクリーニングを可
能にすると考えられ、引続きそれらの固体を免疫抑制薬
によって予防的に治療しうる。
糖尿病を臨床的に発現した個体の現行の治療は、非糖
尿病個体における膵臓β細胞の役割に対抗することを試
みている。β細胞機能が正常な個体は、それらの血流中
に分泌されたインスリンの量をきちんと調節している。
この調節は、通常は血糖の正常限界外への動揺を妨げる
β細胞にあるフィードバック機構によるものである。血
糖が正確に調節されなければ、危険な、致命的でさえあ
る段階を引き起こすことがある。したがって、糖尿病個
体の治療は、１日基準での注射されたウシ、ブタまたは
クローン化されたヒトのインスリンの使用を必要とす
る。
注射されたインスリンおよび食餌規制は生存を可能に
し、そして多くの場合、糖尿多発症後何年も質の良い生
活を可能にする。しかしながら、糖尿病患者の健康はし
ばしば徐々に低下し、それは、糖尿病患者の血中グルコ
ース濃度の避けられない動揺（高低両方）のための血管
系に対する損傷に原因があると考えられている。要する
に、注射されたインスリンで治療された糖尿病患者は、
炭水化物の吸収と、グルコースの正常限界外への一時的
動揺を妨げるための十分正確な量およびタイミングでの
インスリン注射との調整ができない。これらの動揺は、
正常は視覚機能、腎臓機能、そして歩行機能さえも損傷
する様々な血管障害を引き起こすと考えられる。
米国だけでも何百万人もが冒されているこれらの病状
は両方とも、すなわち、Ｉ型糖尿病およびII型糖尿病
は、好ましくは、更に調節された様式で治療される必要
がある。例えば、動物およびヒトにおいては、完全な単
離された島の移植に成功してきた。しかしながら、移植
された島が現場で持続的に機能しないために、糖尿病の
症状の長期消散はこの方法ではまだ達成されていない。
ロバートソン（Robertson）、New England J.Med.，3
27,1861〜1863（1992）を参照されたい。
ヒトにおいてこれまに達成された移植には、治療され
た患者一人に対して１個または２個の膵臓が提供される
必要があった。残念ながら、米国においては１年間に約
6000の提供されたヒト膵臓しか利用できないし、これら
の内の多くは全膵臓器移植に必要とされる（通常、癌手
術の際に膵臓が除去された場合に用いられる）。したが
って、現在の技術事情が与えられたとしても、このよう
な移植の恩恵を受けられるであろう何百万人もの糖尿病
患者の内、相対的に一握りの患者だけしか治療を受ける
ことができない。
島細胞（必ずしも制限されないが、β細胞を含む）の
供給が、提供された島を細胞培養で培養することによっ
て増加することができるならば、増大した集団は、イン
スリン依存性糖尿病の新規治療を可能にする十分な材料
を提供するであろう。
同様の様式で、ヒト甲状腺の小胞細胞は、甲状腺刺激
ホルモンTSHの周囲濃度に対して反応し且つその活性の
ためにヨウ素化を必要とする極めて大型の複雑なタンパ
ク質であるチログロブリンを合成するように極めて特殊
化されている。TSH濃度に反応して、チログロブリン
は、集合的に甲状腺ホルモンチロキシンとして知られて
いるテトラヨードおよびトリヨードチロニン（T3）とし
て分泌される。ラットの甲状腺細胞は、これらの細胞の
特殊化された機能並びにホルモン依存性を保持させる培
地中でうまく培養された（アンベシ（Ambesi）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA，77,3455〜3459（1980））；しか
しながら、ヒト甲状腺細胞の同様の細胞培養はうまく維
持されなかった。FRTLおよびFRTL−５と称するこれらの
ラット細胞培養並びにそれらのクローン変異体は、甲状
腺疾患が疑われる患者の血清中の甲状腺刺激物質を識別
しようとする臨床試験の基準となっている。
FRTL/FRTL−５細胞培養は、正常なラット成体甲状腺
に由来した。これらの細胞系統は、チロトロピン（TS
H）に対して、チログロブリン（Tg）を放出し、サイク
リックAMP（cAMP）を生産し、ヨウ化物を捕え、そして
成長することによって応答した。FRTLおよびFRTL5細胞
におけるTSH依存性成長は、甲状腺細胞の分裂促進因子
としてのホルモンの重要な役割を示唆した；しかしが
ら、全部の報告がこの知見を確証したのではない（ウェ
スターマーク（Westermark）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA，76,2022〜2026（1979）；バレンテ（Valente）ら、
Endocrinology，112,71〜79（1983）を参照された
い）。第二メッセンジャーとしてのcAMPの役割に関し
て、cAMP生産の調節以外の成分は、TSH刺激作用に関与
することがあると考えられる（例えば、ロンバルディ
（Lombardi）ら、Endocrinology，123,1544〜1522（198
8）を参照されたい）。遺伝子工学処理されたFRTL5細胞
中での細胞内cAMP濃度の偽生理学的上昇は、細胞増殖を
刺激するのに十分であるが（ヘン（Hen）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA，86,4785〜4788（1989））、他の由来
の培養された正常な甲状腺細胞は同様の性質を示さない
ことがある。
cAMP以外の他に第二メッセンジャーは、甲状腺細胞の
調節および作用においてある役割を有すると仮定されて
きた；しかしながら、このような仮説を全て支持する明
確な経験的データがあるわけではない（例えば、ラスパ
（Rasp）ら、Mol.Cell.Endocrin.，81,175〜183（199
1））。更に、重要な役割をオートクリン（タカハシ（T
akahashi）ら、Endocrinology，126,7−36〜７−45（19
90））または間接パラクリン効果（グッドマン（Goodma
n）およびレン（Rene）、Endocrinology，121,2131〜21
40（1987））が果たしていることがある。上記に引用さ
れた研究は種々の動物種またはヒトの病理学的試料から
の甲状腺細胞を論じていたことから、決定的に引用でき
ることはほとんどなく、矛盾は、種間の差、種々の病理
学的状態または用いられた種々の培養条件に対する細胞
の適応のためであるかもしれない。報告によれば、正常
な形質転換されていないドナー組織についての少数の研
究は、インビトロ細胞増殖の形跡が極めて少ない一次培
養に向けられている（例えば、ラスパら、上記を参照さ
れたい）。
甲状腺病理学、例えば、甲状腺腫、グレーヴズ病、橋
本病、腺腫および癌は、甲状腺機能の障害、典型的には
甲状腺自体の切除を伴う。甲状腺病理学の原因は十分に
理解されていないが、切除後の治療は、ホルモン置換に
基づく療法に集中する。正常な甲状腺細胞を培養におい
て十分な量で生産することができたならば、このような
増大した集団は、これらの甲状腺疾患に対する切除後の
新規の治療を可能にする十分な材料を提供するであろ
う。
甲状腺が損傷されまたは除去された場合、しばしば、
上皮小体も損傷されまたは除去される。甲状腺の機能
は、経口によって甲状腺ホルモンを摂取することにより
かなりうまく置換されるが、上皮小体の機能は容易に置
換されない。上皮小体の主なホルモン生成物は、経口に
よって摂取された場合に無効であるパラトルモンと称す
るタンパク質ホルモンである。パラトルモンはビタミン
Ｄの相互作用し且つ無機代謝、特にカルシウムを調節す
る。
同様の状況は耳下腺に関して存在する。これらの腺は
下顎角に位置し且つ口腔を潤す唾液の大部分を生産する
任を負っている。特に３種類の主要な唾液タンパク質、
すなわち、ルミカルミン、アミラーゼおよびガスチン
は、耳下腺によって分泌される。耳下腺分泌の不存在
は、口内乾燥症、すなわち、一般的な臨床的には憂慮す
べきであるが生命を脅かす障害ではない口内乾燥を引き
起こすことがある。口内乾燥症は、口腔癌の治療のため
の口腔のＸ線照射後の全患者およびシェーグレン症候群
の多数の患者に影響を及ぼす。この障害は、口内炎、歯
肉炎、歯周炎、味覚喪失および歯喪失を悪化させる。こ
の症状の治療は、主として口腔湿潤剤を与えることから
成るが、ほとんど成功していない。正常な耳下腺細胞を
培養において十分な量で生産することができたならば、
このような増大した集団は、口内乾燥障害のための新規
の治療を可能にする十分な材料を提供するであろう。
他の細胞種、特に、外胚葉または内胚葉の胚由来のも
のは、慣用法によって長期培養する場合に同様に扱いに
くい。これらの他の細胞種としては、オルファクティー
神経芽細胞、前立腺、涙腺、軟骨、内耳、肝、上皮小
体、口腔粘膜、汗腺、毛包、副腎皮質、尿道、膀胱、多
数のヒト腫瘍等がある。更に、甲状腺、肺、頚部、上皮
（癌）および下垂体の腫瘍細胞並びに甲状腺腺腫を含む
一次ヒト腫瘍細胞は、培養で増殖させることができな
い。
若干の細胞、例えば、羊膜細胞並びに静脈および動脈
内皮は、インビトロで培養されてきた；しかしながら、
成長速度または分化した機能と忠実な保存は、特に有効
であるとは証明されていない。慣用的な培地中での羊膜
細胞の成長速度は、いくつかの遺伝的疾患の診断の目的
のために細胞を増殖させるのに必要な時間が、胎児の発
育のある時点で、例えば、情報を患者に対して最も極端
な効果でしか作用させることができないかまたはおそら
く全く作用させることができない場合にその情報を提供
させることができるようにある。このような成長速度
は、当然ながら、前述の細胞のいずれかの培養に関して
経済的な効果を有する。培養された細胞自体が、火傷犠
牲者に適用しうる皮膚細胞などの外科的方法のためのま
たは薬剤の製造のための生成物である限り、細胞培養速
度を増加させる技術の存在は、これらの細胞をより豊富
に且つより安価に供給する。
本発明は、多数のこれらの培養要求を満たすことを試
みる。特に、本発明は、従来培養されていない野生種細
胞の増大した培養を製造することができる新規の培養法
および培地を提供する。このような細胞としては、膵島
細胞、甲状腺細胞、上皮小体細胞、耳下腺細胞、腫瘍細
胞および上記で論及された他の細胞種がある。本発明
は、更に、組織様性質を有する、膵臓、甲状腺、上皮小
体および耳下腺細胞などの細胞のある種の凝集体（本明
細書中において「偽組織」と称する）、更には、様々な
疾患、例えば、血糖濃度障害、甲状腺欠損症、パラトル
モン欠損症および／または無機異混和症並びに哺乳動物
の口内乾燥症の治療のための該偽組織の使用を提供しよ
うとしている。更に、本発明は、外因性物質の細胞障害
検定のための培養細胞の使用技術を提供し且つ患者の病
状を評価しようとしている。
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、本発
明の好ましい例証された実施態様についての以下の説明
を読むことにより、および添付の図面を参照することに
より一層容易に明らかになるが、それらはいずれも例示
のためにのみ与えられており、本発明を制限するもので
はない。
発明の概要 本発明は、腺、神経芽細胞、肝、副腎皮質、口腔粘
膜、端骨、内耳、尿道および膀胱の細胞から成る群より
選択される細胞種の増大した非形質転換細胞培養を製造
する方法であって、（ａ）該細胞を含む組織を細かく刻
み、それによって該組織の下部構造または遊離細胞を得
ることによって該細胞を調製し；（ｂ）該下部構造また
は細胞を濃縮し；（ｃ）該濃縮された下部構造または細
胞を、持続した細胞分裂を支持することができる培地中
に再懸濁させ；（ｄ）該培養をインキュベートし；そし
て（ｅ）該培養を定期的に継代する工程を含む上記方法
を提供する。好ましくは、培地は基礎培地および視床下
部、下垂体または胎盤の抽出物を含む。本発明は、更
に、クローン系統を製造する方法であって、（ａ）前記
のように細胞培養を製造し；（ｂ）該培養を密集細胞層
になるまで増殖させ；（ｃ）該細胞を解離させ；（ｄ）
該細胞を、第一の平板培養のためのならし培地が入って
いる別の培養容器中に接種し；（ｅ）細胞の個々のコロ
ニーを採取し；（ｆ）該コロニーを、第二の平板培養の
ための別の培養容器中に接種し；そして（ｇ）得られた
細胞を定期的に継代する工程を含む上記方法を提供す
る。
本発明の方法は、膵臓、甲状腺、上皮小体および耳下
腺を含む種々の細胞並びに多数の他の種類の細胞によっ
て用いるのに適している。
本発明は、更に、望ましくは本発明の方法と一緒に用
いられる培地を提供する。該培地は、基礎培地および組
織またはその成分の抽出物を含む培地であって、それら
の組合わせは、該分泌腺または内分泌腺に由来する培養
細胞による持続した細胞分裂を妨げないようにある。基
礎培地は、好ましくは、クーンの修飾F12培地であり、
組織は、視床下部、下垂体および胎盤から成る群より選
択されるのが好ましい。
更に、本発明は、膵臓内分泌腺細胞、甲状腺細胞およ
び耳下腺細胞の増大した細胞培養並びに診断用検定およ
び治療的処置における該細胞培養の使用法を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、グルコース刺激を伴わないHPSL−６培養細胞
の培地中のインスリンおよびＣ−ペプチドの蓄積を示す
グラフである。
図２は、細胞増殖、インスリン生産およびＣ−ペプチ
ドに関して、HPSL−８系統の膵臓細胞のグルコース刺激
の結果を示すグラフである。
図３は、グルコース刺激後のHPSL−８細胞によるホル
モン分泌に対するクーン4506.07培地の修飾の効果を示
すグラフである。
図４は、グルコース刺激後のHPSL−８細胞によるホル
モン分泌速度に対する、追加のインスリン不含のクーン
4506.07培地の修飾の効果を示すグラフである。
図５は、HPSL−８によるホルモン分泌速度に対する、
追加のインスリン含有クーン4506.07培地の修飾の効果
を示すグラフである。
図６は、偽島を含む偽組織または懸濁細胞の移植を受
けた糖尿病マウスにおける血糖濃度の調節を示すグラフ
である。
図７は、甲状腺培養細胞の成長に対するインスリン含
有および不含のTSHの効果を示すグラフである。
図８は、FRTLまたはNHTB−2K細胞におけるcAMP蓄積
の、TSHに刺激された用量依存性増加を示すグラフであ
る。
発明の詳細な説明 以下の発明の詳細な説明を、本発明を実施する場合に
当業者に役立つように提供する。この詳細な説明は、本
発明を制限すると解釈されるべきではなく、本明細書中
で論及された実施態様の修正および変更は、本発明の発
見の精神または範囲を逸脱することなく当業者によって
行なわれることができる。
本発明は、腺、神経芽細胞、肝、副腎皮質、口腔粘
膜、軟骨、内耳、尿道および膀胱の細胞から成る群より
選択される細胞種の増大した非形質転換細胞培養を製造
する方法であって、（１）前記細胞を含む組織を細かく
刻み、それによって細胞または該組織の下部構造を得る
ことによって該細胞を調製し；（２）該細胞または下部
構造を濃縮し；（３）該濃縮された細胞または下部構造
を、持続した細胞分裂を支持することができる培地中に
再懸濁させ；（４）該培養をインキュベートし；そして
（５）該培養を継代する工程を含む上記方法を提供す
る。
この手順を施される細胞種は、種々の組織に由来し、
ヒト由来であるかまたは任意の他の動物由来でありうる
し、そして任意の適当な起原、例えば、完全な膵臓、耳
下腺、甲状腺、上皮小体、前立腺、涙腺、軟骨、腎臓、
内耳、肝、口腔粘膜、汗腺、毛包、副腎皮質、尿道およ
び膀胱またはその一部分若しくは複数体からであってよ
い。組織は、任意の適当な方法を用いて、例えば、摘出
された組織を静かに細かく裂くことによってまたは摘出
された組織を、例えば、管を介する潅流によるか若しく
は、例えば、適当なpHおよび張度のコラゲナーゼ含有緩
衝液中での細かく裂かれた組織の簡単なインキュベーシ
ョンによりコラゲナーゼで消化することによって調製し
た。次に、調製された組織を、濃縮（および部分精製）
に適当な方法および材料、例えば、フィコール勾配によ
る遠心分離を用いて濃縮する。次に、濃縮された組織を
任意の適当な容器、例えば、組織培養ガラス器具または
プラスチック器具中に再懸濁させる。再懸濁された材料
は、組織の全下部構造、細胞および細胞集団を含むこと
がある。例えば、このような下部構造としては、膵臓組
織の場合は島および管並びに甲状腺組織の場合は小胞が
ありうる。
再懸濁された組織細胞の初期培養は一次培養である。
一次培養の初期培養において、細胞は、同時細胞分裂を
伴って適当な培養容器表面上に付着し且つ広がる。初期
培養に引続き、通常、培養容器中の細胞単層の達成後、
一次培養の細胞を解離させ且つ初期培養またはその次の
培養を新たな培養容器中に希釈すること、すなわち、当
該技術分野において継代として知られる手順によって連
続的に増殖された二次および引続きの培養を調製する。
このような継代は、由来する組織の細胞の増大した培養
を生じる。細胞培養を適当な間隔で、例えば、１週間に
約１回または培養細胞の約２回〜約３回の細胞分裂後に
継代する。２〜３週間の更に長い間隔または２〜３日間
の更に短い間隔でも十分であろう。細胞培養を継代する
ために、約1:2〜約1:100の比率での培養細胞の希釈を用
いる。好ましくは、約1:4〜約1:50の比率を用いる。更
に好ましくは、約1:4〜約1:6の比率を用いる。
遊離細胞および／または凝集塊（凝集塊が組織の順序
付けられた下部構造を構成しうる場合）の形であってよ
い濃縮された調製組織を、任意の適当な初期細胞または
推定上の細胞濃度で再懸濁させる。適当な細胞濃度は、
培養容器の表面積１平方センチメートルにつき細胞約10
0個〜約1000個である。初期平板培養のためのこのよな
細胞濃度は、以下のような特異的細胞システムのための
この種のパラメーターを決定することによって最もよく
例証される。
膵臓組織細胞を培養するために、濃縮された島を任意
の適当な初期島濃度で、例えば、培養容器の表面積１平
方センチメートルにつき島約１〜約700個の初期島濃度
で再懸濁させるが、これは、標準的な直径100mmのペト
リ皿１枚につき島約100〜約50,000個の初期島濃度に相
当する。好ましい実施態様において、濃縮された島を、
培養容器の表面積１平方センチメートルにつき島約１〜
約70個の濃度で再懸濁させるが、これは、標準的な直径
100mmのペトリ皿１枚につき島約100〜約5000個の初期島
濃度に相当する。更に好ましい実施態様において、濃縮
された島を、培養容器の表面積１平方センチメートルに
つき島約１〜約７個の濃度で再懸濁させるが、これは、
標準的な直径100mmのペトリ皿１枚につき島約100〜約50
0個の初期島濃度に相当する。この方法のもう一つの更
に好ましい実施態様において、濃縮された島を、培養容
器の表面積１平方センチメートルにつき島約３〜約７個
の濃度で再懸濁させるが、これは、標準的な直径100mm
のペトリ皿１枚につき島約250〜約500個の初期島濃度に
相当する。
甲状腺組織細胞を培養するために、濃縮された細胞お
よび小胞断片を、任意の適当な初期濃度で、例えば、直
径100mmのペトリ皿（ファルコン（Falcon）、ベクトン
・ディキンソン（Becton Dickinson）、リンカーン・
パーク、NJ）１枚につき島約104個〜約106個の初期島濃
度で再懸濁させる。好ましい実施態様において、濃縮さ
れた甲状腺細胞を、直径100mmのペトリ皿１枚につき細
胞約６×104個〜約５×105個の細胞濃度で再懸濁させ
る。更に好ましい実施態様において、濃縮された甲状腺
細胞を、直径100mmのペトリ皿１枚につき細胞約８×104
個〜約３×105個の細胞濃度で再懸濁させる。
増大した細胞培養を製造する方法は、適当な基礎培地
および適当な組織の適当な抽出物を含み、それらの組合
わせが、外分泌腺および内分泌腺を含む前述の組織に由
来する培養細胞による持続した細胞分裂を妨げないよう
に設計されている培地の使用に依る。典型的に、それら
に由来する血清または成分も混合物中に含まれる。組織
抽出物の成分を、粗製または部分的に精製された組織抽
出物の代わりに用いてよい。
用いることができる基礎培地としては、シグマ・ケミ
カル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）、ライフ・
テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Life Techno
logies,Inc.）またはバイオホイッタカー・カンパニー
（BioWhittaker Co.）から商業的に入手可能なものが
ある。いずれの基礎培地も、少なくともマグネシウムイ
オン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、重炭酸塩イオ
ン、カリウムイオンおよび糖濃度を、得られた培地中に
おいて更に低いまたは高い濃度に操作することができる
という条件ならば用いることができ；特に、マグネシウ
ムイオン、カルシウムイオン、重炭酸塩イオンおよびＤ
−グルコース濃度は、標準的な基礎培地中において普通
であるよりも低い濃度で必要とされ、亜鉛イオンは同じ
かまたは高い濃度で必要とされ、そしてカリウムイオン
は同じかまたは低い濃度で必要とされる。
適当なマグネシウム塩、例えば、MgSO4・7H2OおよびM
gCl2・6H2Oによって与えられるマグネシウムイオンの好
ましい濃度は、60〜240mg/Lであり；更に好ましいマグ
ネシウム塩濃度は、100〜150mg/Lである。適当なカルシ
ウム塩、例えば、CaCl2・2H2Oによって与えられるカル
シウムイオンの好ましい濃度は、25〜200mg/Lであり；
更に好ましいカルシウムイオン濃度は、40〜125mg/Lで
ある。適当な亜鉛塩、例えば、ZnSO4・7H2Oによって与
えられる亜鉛イオンの好ましい濃度は、0.1〜0.5mg/Lで
あり；更に好ましい亜鉛イオン濃度は、0.12〜0.40mg/L
であり；また更に好ましい亜鉛イオン濃度は、0.15〜0.
20mg/Lである。好ましいアスコルビン酸濃度は、30〜12
5mg/Lであり；更に好ましいアスコルビン酸濃度は、40
〜100mg/Lである。適当な重炭酸塩、例えば、重炭酸ナ
トリウムによって与えられる好ましい重炭酸塩イオン濃
度は、175〜700mg/Lであり；更に好ましい重炭酸塩イオ
ン濃度は、300〜400mg/Lである。適当なカリウム塩、例
えば、塩化カリウムによって与えられる好ましいカリウ
ムイオン濃度は、100〜400mg/Lであり；好ましいカリウ
ムイオン濃度は、200〜325mg/Lであり；最も好ましいカ
リウムイオン濃度は、210〜250mg/Lである。適当な糖、
例えば、Ｄ−グルコースによって与えられる好ましい糖
濃度は、400〜1800mg/Lであり；更に好ましい糖濃度
は、600〜1200mg/Lであり；最も好ましい糖濃度は、800
〜1000mg/Lである。ヒト胎盤性ラクトゲンの好ましい濃
度は、３〜15μm/mlであり；更に好ましいヒト胎盤性ラ
クトゲン濃度は、４〜13μg/mlであり；最も好ましいヒ
ト胎盤性ラクトゲン濃度は、８〜12μg/mlである。適当
な天然に単離された、クローンに由来するまたは合成の
インスリン、例えば、単離されたウシナトリウム−イン
スリンによって与えられるインスリンの好ましい濃度
は、50〜20,000ng/mlであり；更に好ましいインスリン
濃度は、100〜10,000ng/mlであり；最も好ましいインス
リン濃度は、500〜5,000ng/mlである。
用いることができる一つの基礎培地は、好ましくは、
バイオホイッタカー・カンパニー、ウォーカービル、MD
から入手可能であるかまたは実施例１に与えられた処方
にしたがって製造されるクーンの修飾F12培地（クーン
（Coon）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86,1703（198
9））である。
本発明の培地を製造するのに用いることができる組織
抽出物としては、成長因子を含む任意の適当な組織があ
る。このような組織としては、好ましくは、視床下部、
下垂体および胎盤の少なくとも一つがある。前述のよう
に、組織抽出物の適当な成分、例えば、適当な成長因子
を含む部分的にまたは完全に精製された溶液またはその
合成変種を、完全な組織抽出物の代わりに用いることが
でき、例えば、ヒト胎盤抽出物の代わりにヒト胎盤性ラ
クトゲン用いることができる。組織抽出物のこのような
適当な成分を完全な組織抽出物に加えて、例えば、ヒト
胎盤性ラクトゲンおよびヒト胎盤抽出物を用いるこもで
きる。
血清は、当業者によって典型的に用いられる濃度より
も低い濃度で用いられる。例えば、典型的な細胞培地
は、10％〜20％ウシ胎児血清を用いるが、本発明の培地
は10％未満の血清、概して約２％〜約６％血清を用い
る。本発明の培地中の好ましい血清濃度は、約３％〜約
５％である。本発明の培地中の更に好ましい血清濃度
は、約４％である。血清源としては、ウシ胎児および生
まれたばかりの子ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ並びにヒト
胎児および成人がある。好ましくは、ウシ胎児血清を用
いる。更に、適当な血清成分、例えば、適当な成長因子
を含む血清に由来する部分的にまたは完全に精製された
溶液を全血清の代わりに用いる。血清中にある適当な成
長因子は、合成によって製造することもでき、それによ
って血清の要求に代えることができる。
好ましい培地は、実施例１に定義のように、クーン45
06.035およびクーン4506.07培地である。クーン4506.03
5およびクーン4506.07培地は、これらの培地が調製され
うるクーンの修飾F12培地と比較して低いカルシウムイ
オン（Ca++）濃度、低い追加血清濃度（４％対10〜20％
ウシ胎児血清）および組織抽出物成分およびヒト胎盤性
ラクトゲンによって与えられる比較的高い成長因子濃度
を有する。繊維芽細胞は、典型的に、腺細胞の培養を過
増殖させるが、このような繊維芽細胞は、通常は島細胞
と一緒に同時精製され、例えば、それらが継続した連続
継代で維持されている場合、クーン4506.035またはクー
ン4506.07培地中の培養を過増殖させない。クーン4506.
07培地を用いると、例えば、繊維芽細胞は、ダルベッコ
修飾イーグル培地中10％ウシ胎児血清などの慣用的な培
他の場合よりも25〜50％遅く成長する。
クーン4506.035またはクーン4506.07培地中で増殖し
た島の集団培養は、実際に、島の内分泌腺細胞の豊富な
培養となる。内因性繊維芽細胞が機能性内分泌腺細胞を
過増殖させ且つ溢れさせるこの失敗は、これらの細胞を
増殖させる最初の試みと比較して、本発明の膵臓内分泌
腺細胞の培養の成功において重要である。同様に、この
特徴は、他の前述の細胞種の増殖にとって重要である。
更に、本発明は、例えば、本明細書中で論及された膵
臓内分泌腺細胞培養を含む本明細書中で論及された細胞
培養それぞれからクローン系統を製造する方法であっ
て、（１）前記に概説された手順にしたがって細胞培養
を製造し；（２）該培養を増殖させ；（３）該細胞を解
離させ；（４）該細胞を、第一の平板培養のための別の
培養容器中に接種し；（５）細胞の個々のコロニーを採
取し；（６）該コロニーを、第二の平板培養のための別
の培養容器中に接種し；そして（７）得られたクローン
細胞系統を定期的に継代する工程を含む上記方法を提供
する。
細胞培養は、密集した細胞層に増殖した時点でクロー
ン系統を製造するのに用いることができるし、または該
培養を密集する前に用いてよい。解離は、任意の適当な
手段を用いて、例えば、トリプシンまたは他のタンパク
質分解処理によって行なうことができる。個々に単離可
能なコロニー増殖を促進するように、培養容器の表面積
１平方センチメートル当りの任意の適当な細胞濃度を第
一の平板培養に用いることができる。好ましくは、培養
容器の表面積１平方センチメートルにつき細胞約３〜約
150個を用い；更に好ましくは、細胞約７〜約70個／平
方センチメートルを用いる。
クローン系統の製造には、直前に記載した第一の平板
培養のためのならし培地が必要であり、ここにおいて該
培地は、均一に（すなわち、クローン化される細胞の同
一種類によって）または異種に（すなわち、クローン化
される種以外の細胞によって）調節されることができ
る。ならし培地は、（１）本明細書中に記載の手順にし
たがって製造される培養細胞をインキュベートし；
（２）その培地を採取し；そして（３）得られたならし
培地を滅菌濾過する工程によって調製することができ
る。
ならし培地の調製に用いられる細胞濃度は、培養容器
の表面積１平方センチメートルにつき極僅かの細胞〜近
密集まででありうる。必要なインキュベーション時間の
長さは、細胞濃度に反比例する。本質的に、細胞から排
出された適当な濃度の細胞生産物がならし培地の必要な
成分を形成し、その濃度は、培地の単位容量当たりのイ
ンキュベートされた細胞数が大きくなるに伴ってより速
く達成される。細胞は増殖する必要があり；したがっ
て、密集未満である任意の濃度はならし培地を調製する
のに十分である。好ましくは、細胞濃度は、培養容器の
表面積１平方センチメートルにつき細胞約５×103〜約
５×104個であり、その場合のインキュベーション時間
は約18時間〜約24時間である。前述の逆の関係により、
インキュベートされる細胞が少ない場合、一層長いイン
キュベーション時間を必要とし；平板培養される細胞が
多い場合、必要なインキュベーション時間はより短い。
細胞がインキュベートされている培地の量に関して、
培養容器は任意の適当な量の培地を含んでいてよいが、
好ましくは、細胞106個につき約２〜約４ミリリットル
含むべきである。好ましい培地としては、クーン4506.0
35およびクーン4506.07がある。
ならし培地の採取は、任意の適当な手段を用いて、例
えば、培地をフラスコなどの適当な容器中に注入または
吸引して行なわれる。採取された倍入の滅菌濾過は、任
意の適当な手段を用いて、例えば、加圧下において培地
を適当な限外濾過膜に通過させて行なわれる。或いは、
当該技術分野において知られているダイアフィルトレー
ション法においてメンブランフィルターも用いて培地を
濾過することができる。
クローン系統の製造法における第一の平板培養の摂取
のために、滅菌濾過したならし培地を希釈して、それが
摂取材料の増殖促進に適当であるようにする。好ましく
は、３〜５部のならし培地を１〜３部の適当な培地で希
釈する。更に好ましくは、約２部のならし培地を約１部
の適当な培地で希釈する。
第一平板培養で生じる個々のコロニーを、適当な回数
の集団倍加後に採取し、したがって、これらのコロニー
は適当な数の細胞を含む。好ましくは、コロニーを約７
〜約15回の集団倍加後に採取し、この時点でのコロニー
は細胞を約128個〜約32,000個含む。更に好ましくは、
コロニーを約９〜約12回の集団倍加後に採取し、この時
点でのコロニーは細胞を約500個〜約4,000個含む。
第二平板培養のための摂取は、任意の適当な出発細胞
濃度を用いて達成することができる。用いられる細胞数
は、選択されたコロニー中に含まれる量によって制限さ
れ；したがって、ここでの平板培養内度は、培養容器の
寸法および培地の量を変化させることによって変更され
る。濃度は、ならし培地の製造に好ましく用いられた濃
度と同様である。例えば、直径30mmのペトリ皿または微
量滴定プレート（直径5mmのウェルを有する）の標準的
な培養容器を用いて、表面積対摂取材料中の細胞数の適
当な比率を与えることができる。
好ましくは、約１〜約３部のならし培地を、第一平板
培養の細胞および第二平板培養の細胞を支持するための
培地約１〜約３部で希釈する。更に好ましくは、約１部
のならし培地を、第一平板培養の細胞および第二平板培
養の細胞を支持するための培地約１部で希釈する。
クローン化された培養の継代は、前記に記載の一次培
養および連続的に増殖された培養を継代するのに用いら
れたのと同様の方法で達成される。細胞のクローン化系
統を継代する場合に用いられた培地は、一次培養のため
の島細胞製造の初期平板培養について前記に記載された
ような任意の適当な培地であってよい。ならし培地をク
ローン化培養の継代に用いてよいが、新鮮な培地が好適
である。
本明細書中前記に記載の方法の目的は、持続した細胞
分裂が可能である種々の細胞種の二倍体非形質転換細胞
培養であって、それぞれの培養が単一細胞種または関連
細胞種を含む前記培養を単離することである。この目的
は、いずれもヒト由来である膵臓組織、甲状腺組織、上
皮小体組織および耳下腺組織を用いて達成されたが、他
の哺乳動物、例えば、イヌまたはウマに由来するこのよ
うな組織も同様に用いることができた。このような培養
は、更に、単一先祖細胞に由来した細胞の培養を生じ
る。したがって、膵臓内分泌腺および管、甲状腺、上皮
小体並びに耳下腺細胞は、少なくとも本発明の培地を用
いて刺激された場合、有糸分裂後ではない。培養中の細
胞は二倍体のままであったし、しかも本発明の、例え
ば、膵臓内分泌腺および管、甲状腺並びに耳下腺細胞培
養が前悪性状態に形質転換されなかったことを示す他の
特性（例えば、以下の実施例５、12および13に示され
た）を保持した。更に、例えば、α、β、δおよび管膵
臓細胞のみならず繊維芽細胞、マクロファージ等からも
成る部分的に精製された膵島によって開始された培養
が、本発明の培地を用いると、膵臓内分泌腺細胞によっ
て優勢に占められたことは注目された。明らかに、本発
明の培地は膵臓内分泌腺細胞に有利に、そして膵島と一
緒に明白に同時精製される他の細胞には不利に選択す
る。
以下に詳細に記載のように、本発明の膵臓内分泌腺細
胞培養は、島細胞で支配されてい何等かの源の細胞障害
性原因物質を同定することが目的である検定の基準とし
て用いることができる。同様に、甲状腺細胞、耳下腺細
胞および他の細胞を同じように用いることができる。概
して、細胞障害性は、疑わしい毒性物質の希釈物に対し
て細胞培養を暴露し、そして若干の時間後に破壊されま
たは死滅した細胞数を評価することによって測定され
る。機能的に分化したヒト細胞の出現により、新規の且
つ一層鋭敏な検定が可能である。死滅した細胞を監視す
る他に、１種類または複数の疑わしい毒性物質が、正常
な生理学的機能を妨げる、例えば、インスリンを分泌す
ることによって周囲グルコース濃度の変化に反応する培
養中のヒトβ細胞の能力を妨げるその能力を定量するこ
とができる。この種類の検定は、グルコース感知過程か
またはＣ−ペプチド放出によって実証されるプレインス
リンプロセッシング段階を含むインスリン分泌過程を妨
げるかもしれない、致命的ではないがそれにもかかわら
ず毒性の反応の根拠をを与える。グルコース濃度対イン
スリン分泌曲線の形の変化は、正常な生理学的機能のこ
のような損傷を示すことができるし、しかもRIAのよう
な確立された分析法を用いる測定は、培地中へのインス
リン分泌およびＣ−ペプチド放出両方を定量することが
できる。
したがって、本発明の培養細胞は、正常なヒト細胞の
特性を示し、食品産業、医薬品産業、化粧品産業および
他の産業において用いられるような何等かの種類の細胞
障害性原因物質の存在を検出するように設計された試験
において用いることができる。医学的診断の分野におけ
るこのような試験としては、糖尿病または混在的糖尿病
の患者の血液または組織中のある種の自己抗体またはＴ
−リンパ球を検出するように設計された臨床検出があ
る。このような自己抗体Ｔ−リンパ球は、培養された細
胞と相互作用するかまたはそれらのまたはそれらに対す
る細胞障害性反応を促進するそれらの能力によって識別
されると考えられる。
この診断用検定は、細胞分裂することができる膵臓内
分泌腺細胞の二倍体細胞培養を化学物質または体液試料
に対して暴露し且つ細胞の暴露の効果を評価することを
含む。二倍体細胞培養は前記の通りであり且つ何等かの
哺乳動物に由来することができ；好ましくは、細胞培養
はヒトに由来する。暴露とは、被験化学物質を溶液中に
入れた後、試験細胞がインキュベートされている培地中
に希釈することを意味する。同様に、適当な体液、例え
ば、血清、脊髄液、粘液等は、試験細胞がインキュベー
トされている培地中にそれを希釈することによって検査
されると考えられる。試験試料並びに正および負の対照
の連続希釈もこの手順に含まれると考えられる。試験培
養の培地中に希釈された化学物質または体液の作用につ
いての評価は、任意の適当な手段を用いて、例えば、当
該技術分野において知られている方法を用いる培養の生
命徴候を追跡することによって達成することができる。
このような追跡可能な生命徴候としては、集団倍加時間
および代謝率がある。好ましくは、培地中の疑わしい細
胞毒素の混入によって刺激された培養膵臓β細胞の、周
囲グルコース濃度の変化に対する反応を、当該技術分野
において知られている方法を用い評価する。評価のため
の主な反応は、インスリン分泌および前段階のプレイン
スリンのプロセッシング並びに結果として得られたＣ−
ペプチドの放出である。
自己抗体および細胞障害性Ｔ細胞についての診断検査
検定において用いる提供されたヒト膵臓細胞は、好まし
くは、IDDMの高発生率に関係したHLAマーカーを有する
個体から得られる。これらのマーカーには、極めて高い
IDDMを発生する危険に関係しているHLAクラスII抗原DR
−３、DR−４、DW−３、DW−４およびＢ−８、Ｂ−15が
ある。
血糖濃度を調節する目的で移植するための偽組織を製
造する場合に用いる提供されたヒト膵臓細胞は、好まし
くは、IDDMの発生に関係があるとしても極めて希である
HLAマーカーを有する個体から得られる。これらには、H
LAクラスII抗原DR−５、DR−２、BW−２、BW−３、BW−
８およびＡ−11がある。
同様に、本発明のもう一つの好ましい態様は、当該技
術分野において知られている方法を用いて周囲TSH濃度
に対する培養された甲状腺細胞の反応によって毒性が評
価される培地中の疑わしい細胞毒素の混入によって刺激
された培養甲状腺細胞に関する。評価のための主な反応
は、cAMP生産およびヨウ化物吸収である。本発明の培養
の使用によって新たに培養可能である他の細胞種を必要
とする類似の細胞障害性試験もまた本発明の態様であ
る。
本発明は、更に、本発明の培養の使用を必要とする治
療法に関する。例えば、本発明は、哺乳動物に対して膵
臓内分泌腺細胞の細胞培養を投与することを含む血糖濃
度を変化させる方法を提供する。血糖濃度を変化させる
のに用いられる細胞培養は、膵臓内分泌腺細胞の一次細
胞培養、またはその連続継代培養であってよい。このよ
うな細胞培養の製造は本明細書中前記に記載の通りであ
る。用いられる細胞培養は、その製造もまた本明細書中
前記に記載の通りである膵臓内分泌腺細胞のクローン性
細胞培養であってもよい。本発明の培養された際臓内分
泌腺細胞としては、グルコース濃度に反応したインスリ
ンを分泌するβ細胞がある。
血糖濃度を変化させる方法は、組織様の形の培養され
た膵臓内分泌腺細胞を用いて達成することができる。個
々のβ細胞としてかまたは他の細胞種との組合わせでの
このような培養された膵臓内分泌腺細胞は、自発的にま
たは当該技術分野において知られている培養技術によ
り、密着した凝集体を形成することができる。このよう
な密着した凝集体を本明細書中において「偽島」と称す
る。好ましくは、偽島は、当該技術分野において知られ
ている方法を用いて、コラーゲンなどの適当な生体適合
性基質中に埋め込まれる。培養された膵臓内分泌腺細胞
は、更に、それによって細胞が共インキュベーション前
に遊離懸濁液の形であるコラーゲンなどの適当な生体適
合性基質との共インキュベーションにより、密着した凝
集体に形成されうる。どちらかの方法によって形成され
た細胞の密着した凝集体を、「偽組織」と称する。偽組
織は、哺乳動物中に植込まれることができ且つそこにお
いて血糖濃度を変化させるように機能する生物学的に適
合性の移植片を形成する。
本明細書中に記載のおよび以下に例証された方法にし
たがって製造された膵臓内分泌腺細胞の一次、二次およ
び引続きのまたはクローンの培養、或いはそれらの組合
わせを、このような偽組織において用いることができ
る。方法は、膵臓内分泌腺細胞を偽組織として、例え
ば、哺乳動物中に移植することを必要とし、そこにおい
て偽組織は血管化し、そして血中グルコース濃度が十分
に高濃度に達した場合にインスリンを分泌することによ
って宿主哺乳動物の血中グルコース濃度に反応する。偽
組織の血管化は、偽組織が血管化しなかったこれらの実
験では血糖濃度が調節されなかったという点で重要であ
ると考えられる。同様に、偽組織の遅れた血管化は、血
糖濃度を調節する偽組織の能力を損なうと考えられた。
本発明による成功した偽組織の実証を、以下の実施例10
において糖尿病マウス実験系で例証する。しかしなが
ら、同様のアプローチを用いて、他の哺乳動物、特に、
ヒト、イヌおよびウマにおいても異常な血糖濃度を処置
するのに用いることができる。
本発明は、更に、哺乳動物に対して甲状腺または上皮
小体細胞の細胞培養をそれぞれ投与することを含む。甲
状腺ホルモンまたはパラトルモンを提供する方法に関す
る。甲状腺ホルモンまたはパラトルモンを提供するのに
用いられる細胞培養は、甲状腺若しくは上皮小体細胞の
一次細胞培養またはその連続継代培養であってよい。こ
のような細胞培養の製造は、本明細書中前記に記載の通
りである。用いられる細胞培養は、甲状腺または上皮小
体細胞のクローン細胞培養であってもよく、その製造も
また本明細書中前記に記載の通りである。本発明の培養
された甲状腺または上皮小体細胞としては、TSH濃度に
反応して甲状腺ホルモンを分泌する甲状腺小胞細胞およ
びパラトルモンを分泌する上皮小体組織がある。
甲状腺小胞細胞およびパラトルモンを提供する方法
は、組織様の形に形成されているそれぞれの腺に由来す
る適当な細胞の培養を用いて達成することができる。個
々の小胞細胞としてか、他の細胞種との組合わせでかま
たは解離した腺細胞でのこのような培養された腺細胞
は、自発的にまたは当該技術分野において知られている
培養技術により密着した凝集体を形成することができ
る。このような密着した凝集体を、本明細書中において
適切に、「甲状腺偽組織」または「上皮小体偽組織」と
称する。好ましくは、このような偽組織は、当該技術分
野において知られている方法を用いて、コラーゲンなど
の適当な生体適合性基質中に埋め込まれる。培養された
腺細胞は、更に、それによって細胞が共インキュベーシ
ョン前に遊離懸濁液の形であるコラーゲンなどの適当な
生体適合性基質との共インキュベーションにより、密着
した凝集体に形成されうる。どちらかの方法によって形
成された細胞の密着した凝集体を、適切に「甲状腺偽組
織」または「上皮小体偽組織」と称する。甲状腺または
上皮小体偽組織は、哺乳動物中に植込まれることができ
且つそこにおいて、用いられた偽組織を形成する細胞の
由来に応じて甲状腺ホルモンまたはパラトルモンを提供
するように機能する生物学的に適合性の移植片を形成す
る。
本明細書中に記載のおよび以下に例証された方法にし
たがって製造された甲状腺または上皮小体細胞の一次、
二次および引続きのまたはクローンの培養、或いは一
次、二次および引続きのまたはクローンの培養の組合わ
せを、このような甲状腺または上皮小体偽組織において
用いることができる。方法は、適当な細胞を甲状腺偽組
織として、例えば、哺乳動物中に移植することを必要と
し、そこにおいて甲状腺偽組織は血管化し、そして血中
TSH濃度が中分に高濃度に達した場合に甲状腺ホルモン
を分泌し、cAMPを生産し、そしてヨウ化物を吸収するこ
とによって宿主哺乳動物の血中TSH濃度に反応する。同
様に、上皮小体偽組織を哺乳動物中に移植することがで
き、そこにおいて偽組織は血管化し、そして例えば、パ
ラトルモンを分泌することによって血中カルシウム濃度
に反応する。
コラーゲンは、通常、酸性条件下で抽出され、そして
引続き中和された場合、４℃で液体のままである。37℃
では、コラーゲンの中和溶液は付加逆的にゲルを生成す
る。したがって、細胞懸濁液をコラーゲン溶液中におい
て４℃で製造した後、37℃でインキュベートした場合、
細胞はゲル中に埋め込まれることになる。高濃度（1:1
のコラーゲン：細胞）では、様々な部位への植込みに適
した形状に（例えば、皮下に植込むためのシートとし
て）流延し且つ成形することができる一つの種類の偽組
織が成形される。或いは、細胞を最初に25〜250個の細
胞集団（偽島）に再凝集させることができ、次に、それ
らの集団を順に上記のようなコラーゲンゲル中に埋め込
み、それによって別の種類の偽組織を生成することがで
きる。どちらの場合も、コラーゲンゲルの使用は、宿主
哺乳動物の組織中への移植片細胞の血管化および治療を
促進することが知られている。
以下の実施例は、本発明の生成物の製造および使用並
びに方法を例証するものである。以下の実施例はそれ自
体で本発明を更に例証するが、当然ながら、いずれにし
てもその範囲を制限するものと解釈されるべきではな
い。
実施例１ この実施例では、培養で組織細胞を増殖させるのに適
当な培地の調製を説明する。詳しくは、クーン4506.07
及び4506.035培地を説明する。
添加カルシウムを含まず且つKC1が少ないクーン修飾F
12培他を組織抽出物の混合物と組合せることによって、
本発明に従う増殖培地を調製した。クーン修飾F12の培
地の処方を以下に記す。
組織抽出物は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、1703
（1989）において説明されているクーンらによる方法で
作った。２倍希釈（1:2wt/vol）水性ヘペス緩衝液（NaO
HでpH7.2に調整した20mM）を用いて、ワーリングブレン
ダーで凍結組織をホモジネートした。前記のようにして
作った組織ホモジネートを、冷蔵庫（４℃）の中で30分
間冷却してから、短時間ブレンドすることによって再混
合し、更に30分間冷却した。前記のように再混合した
後、冷却（≦６℃）遠心分離を２回行った。最初に、ホ
モジェネートを、約30,000xgで１時間、低速遠心分離し
た。次に、得られた上澄み液をデカントし、直ちに、超
遠心機を用いて、約150,000xgで１時間、再び遠心分離
した。上澄み液（抽出物）を遠心管から吸引するときに
は、管底にある最も高密度の材料が最終生成物を汚染し
ないように注意深く行った。なぜならば、前記材料は、
無菌濾過を極めて困難にする物質を含んでいるからであ
る。次に、部分的に充填されたプラスチック管を液体窒
素中に入れることによって、得られた抽出物を迅速に凍
結させた。ウシの視床下部及び全ての下垂体の抽出物を
このようにして作った。また、この方法を用いてヒト胎
盤も抽出したが、ヒト胎盤は非常に強靭で線維性の組織
であるので、均質化工程の前に前記組織を粉砕するか又
は切り刻む必要があった。
成分の調製が完了したら、それらを当業において公知
の方法で組合せて、以下に示した各成分の最終濃度を有
する培地を提供した。実験観察により、クーン4506.035
及び4506.07培地のある種の成分は、以下の表に示した
ように、ある範囲内で変化させることができるか又は別
の濃度を有することができる、ことが分かった。１つの
成分、即ちNa−インスリンは、以下の表に示したよう
に、ある濃度範囲にわたって有用であることが経験に基
づいて決定された；本発明の増殖培地で用いられる通常
の濃度は、表の下の脚注に示してある。特に断りがなけ
れば、全ての値はmg/L単位である。
実施例２ この実施例では、外植された膵臓組織由来のランゲル
ハンスの部分的に精製された膵島の調製、及び部分的に
精製された膵島を初代培養して膵臓内分泌細胞の大量培
養を提供することに関して説明する。
膵臓又はその部分は、正常は膵臓機能を有していると
考えられるヒト成人ドナーから得た。ここで用いた膵臓
組織は、男性及び女性の双方合わせて11人のヒト成人患
者から採取され、イタリアのミラノ及びミズーリ州セン
トルイスにある２つの医療移植グループによって集めら
れた。これらの人達から誘導された培養細胞の培養特性
又は腺特性に関して差異が認められなかった。
ミラノ及びセントルイスの膵臓組織の部分的に精製さ
れたランゲルハンスの膵島は、イタリアのミラノにある
サンラファエレ（San Raffaele）病院Drs.Valerio Di C
arlo、Guido Pozza、及びCarlo Socciによって、またミ
ズーリ州セントルイスにあるワシントン大学医学部のバ
ーンズ（Barnes）病院Drs.Scharp及びLacyによって提供
された。膵島組織を細かく切り刻む工程、又はコラゲナ
ーゼの溶液を用い、共通の管路を介して膵臓全体を潅流
する工程、及びフィコール段階勾配によって最終分離し
て、他の膵島組織成分から十分に精製された島の濃縮集
団を製造する工程を含む確立された方法を用いて、島を
調製した。前記方法によって約300,000個の島を調製
し、そのうち5,000−10,000個を用いた。
単離された島を、（実施例１で説明した）クーン450
6.035又はクーン4506.07培地で用いている組織培養グレ
ードのガラス製品又はプラスチック製品（Falcon及びCo
rning社製のものを用いても同じように成功した）であ
る培養器の中で直接調製した後、１日平板培養した。次
に、300−500個の島を、それぞれ標準100mm直径ペトリ
皿の中に入れた。それらは表面に付着し、島細胞は培養
器表面上で増殖して広がった。一定期間（通常は２−３
週間）の後、それらを、（EDTA又はEGTAによるキレート
化を用いて間合は用いずに）標準的な方法でトリプシン
処理して、細胞を培養器表面から且つ互いから解離させ
た。
実施例３ この実施例では、継代によって、大量の膵臓内分泌細
胞培養の維持に関して説明する。
同じ培養器において増殖及び拡散している多数の島に
よって生じた大量の初代培養（標準100mm直径ペトリ皿
１つ当たり100−500個の島）をトリプシン処理し、更に
それらを新しい容器中で４−６倍希釈することによっ
て、１週間、対数増殖期に維持した。長期連続継代は、
１週間当たり約2.5集団倍加の速度で増殖した。そのよ
うに増殖された細胞は、例えば繊維芽細胞及び毛状内皮
細胞のような、島で同じように精製された他の細胞に比
べて、島の内分泌細胞が富んでいることが観察された。
10継代の後、例えばHPSL−８培養は、（細胞形態学によ
って判断すると）極めて少ないか又は全く繊維芽細胞を
含んでいなかった。更に、因子−VIII−関連抗原に関す
る間接蛍光抗体アッセイを用いても、毛状内皮細胞の証
拠は発見されなかった。
実施例４ この実施例では、ならし培地の調製に関して説明す
る。
上記実施例２で説明した初代培養の連続継代によって
作られらた初代培養と大量培養の双方を別々に用いて、
ならし培地（CM）と呼ばれる誘導培地を製造した。CM
は、初代培養平板から及び連続増殖継代平板から細胞を
クローニングするために用いた。CMは、容器表面積の１
平方センチメートル（cm2）当たり約５×104個の細胞
と、106個の細胞当たり約2.75mlの培地になるような十
分なクーン4506.07培地とを含む培養器に対して加え、2
0−25時間それらを培養し、次に培地を取り出し、使用
直前に（ミリポア社製0.22μｍ膜又はそれと同等のもの
を用いて）無菌濾過することによって作った。
実施例５ この実施例では、培養された膵臓内分泌細胞のクロー
ン株の調製に関して説明し、更にクローン株についての
分析結果を記す。
実施例２に従って調製された膵臓内分泌細胞の大量培
養を、膵臓内分泌細胞の供給源として用い、それらを、
続けて２回平板培養した。実施例４に従って調製された
ならし培地を、１回目の平板培養のために、１パートの
新鮮なクーン4506.07培地を用いて２パートのCMへと希
釈した。新たにトリプシン処理された細胞の懸濁液を、
標準100mm直径プラスチックペトリ皿１つ当たり500、10
00、2000、及び5000個の細胞密度で平板培養した。従っ
て、クローン培養は、新鮮なクーン4506.07培地で1:1に
希釈され新たに調製されたCMを用いて１週間に２度供給
された。
十分に単離された円形で均質なコロニーが、0.03−0.
7％の効率で得られた。ガラス製クローニングシリンダ
ー及びペトリ皿にシリンダーを付着させるためのシリコ
ーンハイバックグリースを用いて、コロニーが約1000個
の細胞に達したときに、トリプシン処理することによっ
て前記コロニーを選択的に解離させた。トリプシン処理
によって平板培養から細胞を遊離させた後、クローン化
された（コロニー精製された）細胞を、少量のトリプシ
ン溶液と共にガラス製又はプラスチック製毛管ピペット
を用いて、シリンダーから取り出し、前と同様に、新鮮
なクーン4506.07培地で1:1に希釈されたCMが存在してい
る標準60mm直径プラスチック製ペトリ皿において平板培
養した。これらの細胞が増殖して集密になったとき、ト
リプシン処理によって細胞の全平板培養を解離され、1:
6又はそれ以上に希釈し、更に継代培養するために新鮮
な平板培養中に移した。次に、このようにして確立され
たクローン細胞株を１週間に２度供給し、CMにとって必
要のなくなった新鮮なクーン4506.07増殖培地を完全に
交換した。このよにして培養されたクローン細胞株を、
25−30継代維持した。その場合、老化又は細胞分裂の他
の欠陥の兆候はなく、また形質転換又は連続培養への遺
伝適応（genetic adaptation）の明らかな兆候も全くな
かった。これらの集団のアリコートを記録保管のために
凍結させ、残りの細胞に関しては：（１）蛍光免疫細胞
化学（二抗体法を用いる。その場合、第二抗体及び精製
ホルモンブロック調節は陰性であった）；及び（２）イ
ンスリン又はＣ−ペプチド用RIA（ベータ細胞の指
標）、グルカゴン（アルファ細胞の指標）、及びソマト
スタチン（デルタ細胞の指標）を用いて、その特性を決
定した。
これらの分析結果から、クーン4506.07培地で分裂す
るヒト膵臓から誘導された細胞のいくつかが、クローン
精製にもかかわらず、島細胞タイプ：即ち、アルファ細
胞、ベータ細胞、及びデルタ細胞の少なくとも３つを含
む細胞の集団を産生する多能性細胞へと部分的に復帰突
然変異しかもしれない、このが分かった。１つの分析で
は、クローン集団は、その集団がベータ細胞20−25％、
アルファ細胞10−15％、及びデルタ細胞５％から成って
いることを示す陽性反応（細胞間顆粒に集中した）を明
確に示した。残りの細胞は、これら３つの細胞タイプの
染色に関して陰性又は弱陽性のいずれかであった。他の
細胞染色では、大部分の細胞がこれらの生成物のそれぞ
れに関して拡散的に着色した。全てのクローン集団にお
ける全ての細胞は、神経及び神経内分泌マーカー、ニュ
ーロン特異的エノラーゼ（NSE）に関して強く陽性であ
り、細胞のほとんどは、神経内分泌系の分泌細胞、即ち
クロモグラニンＡのためのマーカーに関して強く陽性で
あった。従って、ヒト膵臓内分泌細胞のいくつかのクロ
ーンは、正常な成人のランゲルハンスの非分裂島におい
て認められる細胞タイプの少なくのも３つを産生でき
る。
同様な実験では、ヒト膵島細胞のクローン株は分化を
示した。HPSL−8U及びHPSL−8Dと命名された、試験され
た27の２種類のクローンは、明らかにデルタ細胞を示し
た。その根拠は、これらのクローン培養を、インスリン
が無く且つ高濃度（20mM）のグルコースを有する培地に
おいて24時間培養したときに、それらは、それぞれ、ソ
マトスタチン（デルタ細胞特有のホルモン生成物）を57
0pg/ml及び116pg/ml産生したからである。高濃度インス
リン（15μg/ml）及び低濃度グルコース（2.5mM）の培
地では、これらのクローン培養は、ぞれぞれ、ソマトス
タチンを、わずかに9.6pg/ml及び28pg/ml産生したのみ
であり、それは、これらの生理的条件に対して予想され
た低い応答を示している。27のクローンのうちの６つ
は、88.5−114pg/ml/24時間の少量だが有意量のインス
リンを産生した。27のクローンのうち、これらの培養条
件下で検出される十分な量のグルカゴンを産生したクロ
ーンは無かった。
実施例６ この実施例では、膵臓内分泌細胞株HPSL−６の調製、
及び様々な集団倍加後における上記HPSL−６によるイン
スリン及びＣ−ペプチドの定常状態産生に関して説明す
る。
部分的に精製された島を、実施例２に記載した方法を
用いて、セントルイスで採取した膵臓組織から調製し
た。即ち、島を、遠心分離によって濃縮し、クーン450
6.07培地中に再懸濁させ、標準100mmプラスチック製ペ
トリ皿１つ当たり約250個の島の密度で分散させ、供給
した。クーン4506.07培地は毎週２回取り替えた。その
培養を、約36.5℃に設定され且つ空気ガス混合物中加湿
５％のCO2が供給されている水ジャケット付き培養器中
で維持した。培養を開始して２週間後、細胞をトリプシ
ン処理し、１つのペトリ皿の内容物を２つの新しいペト
リ皿の中に分配した。これらの新しいペトリ皿上の細胞
を供給し、前と同様に培養した。これらのペトリ皿の中
にある細胞は、５−７日で集密になる（即ち、接触する
まで過密となるので、培養の対数増殖期が終わる）の
で、再び、１つのペトリ皿から得た細胞をトリプシン処
理し、更に２つのペトリ皿の中で継代した（即ち、1:2
継代比）。この方法では、細胞は、各継代世代において
倍加又は１つの集団倍加を経験したと言うことができ
る。慣例によって、継代集団倍加（PDL）は、（HPSL−
６を用いてここで行われたような）この集密時継代法に
おいて、又は（以下の実施例７におけるHPSL−８を用い
て行われたように）各継代で細胞をカウントして希釈す
ることによって計算することができる。
PDL＃13［即ち、13細胞分裂又は原細胞集団の213倍
（約8000倍）の膨張］から開始して、PDL＃18まで続け
る各継代において、インスリン及びＣ−ペプチドの産生
を、（カリフォルニア州、ベルモント94002にあるPenin
sula Laboratories、Ins.社製のRIAキッドを用いて）標
準放射線免疫検定法で測定した。24時間で培地に蓄積い
たインスリン（縞の棒グラフ）及びＣ−ペプチド（空白
の棒グラフ）の量を、図１（ｙ軸は１日当たりのホルモ
ン産生であり、１日における培地500ml当たりのホルモ
ン産生をピコグラムで表している;x軸は集団倍加値であ
り、P.D.Lと表している）に掲げる。これらは、培養に
おける定常状態値であり、グルコース刺激に対する応答
時のホルモン産生の測定値ではない（以下の実施例７を
参照）。明らかに、PDL＃14後に、産生されたインスリ
ンの量は、これらの培養において急激に低下したが、完
全に消失したはいない。しかしながら、PDL＃14は、培
養された膵臓内分泌細胞の約16,000倍の膨張を示してお
り、１つの提供された膵臓から誘導することができる何
千もの独立移植片を製造するのに十分である。
実施例７ この実施例では、膵臓内分泌細胞株HPSL−８の調製、
及び様々な集団倍加後における上記HPSL−６によるイン
スリン及びＣ−ペプチドの定常状態産生に関して説明す
る。
上記実施例２で概説した手順を用いて、部分的に精製
された島、HPSL−８の別のセットを、実施例６に記載し
たのと同様な方法によって連続培養で増殖させた。この
時は、初期の接種材料は、標準100mm直径ペトリ皿１つ
当たり島300−500個であり、継代比は各パスで1:4であ
り、ほぼ毎週発生した。従って、各継代は、２つのPD
L、又は細胞数が４倍になることに相当した。図２は、
培養の様々なPDL状態における細胞株HPSL−８によって
産生されたインスリン（斑点の棒グラフ）及びＣ−ペプ
チド（無地の棒グラフ）の量を示している。左のｙ軸
は、描かれている棒グラフに適用でき、ホルモン産生
を、pg/mg細胞タンパク質／日の単位で示しており（目
盛の倍率は×500である）、及びｘ軸は、培養日数を示
している。この棒グラフには、細胞培養における最初の
73日間の累積増殖曲線（■）も記載してある。右のｙ軸
は、描かれている曲線に適用でき、単位は対数目盛りに
おける累積細胞数である。PDL＃２−４で得られた値
は、図１のHPSL−６に関して示した値と同様な無刺激の
定常状態値である。PDL＃８−10、＃10−12、及び＃15
−17で得られた値は、添加されたインスリンの無い高濃
度グルコース（20mM）培地に変えてから15分で産生され
たインスリン及びＣ−ペプチドの実測量（RIAによって
測定した）より算出されている。これによって、例えば
糖尿病個体で発生するような高濃度グルコース攻撃の条
件下で、インスリンを分泌する培養細胞の能力が測定さ
れる。
PDL＃８−10（約1000倍の膨張）では、膨張した培養
において検出された繊維芽細胞は無く、また抗ヒト因子
VIII抗体により蛍光抗体染色が無いことから判断して、
内皮細胞も存在していない。蛍光抗体染色によって、ニ
ューロン特異的エノラーゼ（NSE）、神経内分泌細胞に
関するマーカーは、全ての培養細胞において見られる。
同様に、別のマーカーによって、PDL＃８−10後におけ
る全ての培養細胞において、繊維芽細胞、内皮細胞、及
びクロモグラニンＡが無いことも証明された。PDL＃８
−10の全、PDL＃２−４（始原）では、これらの免疫化
学的試薬で染色しなかった培養細胞のサブセットがあっ
た。
集団倍加時間は、73日の研究期間では、約2.7日であ
った。PDL＃８−10において、グルコース攻撃に対して
応答して産生されたインスリンの量は、約19ng/mgの細
胞タンパク質／時であることを発見した。また、HPSL−
８単層培養は、インスリン及びＣ−ペプチド産生細胞に
加えて、グルカゴン及びソマトスタチン産生細胞を含
む、ことも示された。
継代１（PDLレベル４−６）でHPSL−８島から調製さ
れた一連の30のクローンにおけるホルモン及びＣ−ペプ
チド産生を、実施例５で説明した方法を用いて分析し
た。インスリンは、６つのクローンで検出することがで
き（４−6pg/mg細胞タンパク質/ml）；グルカゴンは、
いかなるクローンでも発見されず、２つのクローンは高
レベルのソマトスタチン（160及び500pg/mg細胞タンパ
ク質／時）を示した。
実施例８ この実施例では、HPSL−８細胞及び島又は初代培養細
胞が生理学的類似性を示す、ことを説明する。
実施例５、６、及び７におけるように標準RIAタイプ
アッセイを用いて時間推移アッセイを、インスリン、Ｃ
−ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンのための
HPSL−８培養の培地に関して行い、その結果は図３−５
に示してある。これらのグラフにおける各時点で、基礎
となるクーン4506.07培地の配合に関して４つの修飾を
行い、それによって、試験する細胞培養を、上記のグル
コース攻撃の前に、１週間、修飾された培地で培養し
た。修飾Ａは低濃度カルシウム（0.35mM CaCl2・2H
2O）；修飾Ｂは低濃度カルシウム＋10μg/mlで添加され
たヒト胎盤性ラクトゲン；修飾Ｃは高濃度カルシウム
（2.2mM）；及び修飾Ｄは高濃度カルシウム＋10μg/ml
で添加されたヒト胎盤性ラクトゲンであった。図３−５
の各グラフＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、インスリン、Ｃ−ペ
プチド、グルカゴン、及びソマトスタチンの時間蓄積を
表している。ｙ軸は蓄積されたホルモンの単位、即ちpg
蓄積ホルモン/mg細胞タンパク質/ml±s.e.m.;x軸は時間
の単位、即ち分である。
図３に記載されているデータに関して、ホルモン（又
はＣ−ペプチドの場合ではホルモン副産物）は、培養さ
れたHPSL−８細胞によって培地中に分泌され、添加され
たインスリンを有しない培地において、20mMグルコース
攻撃後に測定された。図3Aから、培地中に分泌されたイ
ンスリンの蓄積は、Ｃ−ペプチド分泌による遅延後に対
応し、それは、プロホルモンの活性ホルモンへの活性プ
ロセシングを示している、ことが分かる。時間に対する
インスリン分泌速度として表された同じデータが図４に
示してある。このグラフから、動物におけるグルコース
攻撃後の血清インスリン値のパターンの暗示が認められ
る。即ち、上昇後に、明らかな基底レベルの負の行過ぎ
及び回帰が認められる。絶対的なタイミングは異なる
が、最小時に、培養器においてグルコース／インスリン
貯蔵所として働く会合した肝臓が存在していないので、
刺激も、in vivo状態の刺激とin vivtro刺激では異な
る。
図5Cにおいて見られるように、高濃度インスリン及び
低濃度グルコース（2.5mM）によって、グルコース分泌
の速度が刺激される。図5Bには、HPSL−８細胞を高濃度
インスリン及び低濃度グルコース中で培養した実験結果
がグラフで示してあり、Ｃ−ペプチドの産生は、低レベ
ルグルコースの存在下における高レベルインスリンによ
って遮断される。図5Aに示されているインスリン合成の
負の速度は、破壊及び連結及び／又は培地からの初期高
レベルのインスリンの取込みと考えられる。
培養の全ての段階で見られるソマトスタチンは、異な
るレベルのグルコースによって変動し；図5Dに示されて
いるように、高濃度インスリン及び低濃度グルコースに
よって、有意に増加するようである。
ほとんど全ての場合において、最も多いホルモン産生
は、修飾Ｂ培地を用いた場合に観察された。高濃度のカ
ルシウムは培養細胞によるインスリン産生に関して負の
効果を有する、ことは特に注目に値した。また、島によ
るインスリン分泌を高めることが知られていて、且つin
vitroで初代細胞を単離したヒト胎盤性ラクトゲンが培
養細胞に関してin vitroで同じ効果を有する、ことも注
目に値した。従って、グルコース攻撃に対する培養細胞
の応答によって、in vitroで約1000倍の膨張後でも、単
離された島に対する、これらの単層細胞培養の生理学的
類似性が証明された。
実施例９ この実施例では、本発明の培養膵臓内分泌細胞を用い
ている外来の材料及び体液の細胞毒性を分析する方法を
説明する。細胞毒性薬剤、一般的に膵臓内分泌細胞に対
して特異的な細胞毒性薬剤、及び糖尿病の臨床症状を有
していない個体中にある自己抗体は、以下の手順を用い
て分析することができる。
糖尿病患者の血清の存在下又はいくつかの他の試験材
料の存在下で、インスリンの基礎放出に関する刺激効果
を測定するために、正常な個体（対照）からの10％血清
か、又は試験対象からの10％血清のいずれかの存在下、
8.3ミリモルのグルコースで、細胞を７日間培養する。
非血清試験材料に関して、試験材料の連続希釈物か、又
は希釈液（対照）のいずれかの存在下で７日間細胞を培
養する。インスリン放出は、標準RIA法を用いて、上澄
み液（supernatant medium）において測定する。
症候性又は前症候性（presymptomatic）の糖尿病患者
から得た血清の存在下、又はいくつかの他の試験材料の
存在下で、高濃度グルコースによって誘発されたインス
リンの急性放出に関する抑制効果を測定するために、正
常な個体（対照）から得た10％血清か、又は試験対象か
ら得た10％血清のいずれかの存在下で、細胞を７日間培
養する。非血清試験材料に関して、試験材料の連続希釈
物か又は希釈液（対照）のいずれかの存在下で７日間細
胞を培養する。７日後に、20ミリモル又は５ミリモルの
グルコースで細胞を攻撃する。インスリン放出は、時間
曲線を得るために攻撃後15分の間隔で、上澄み液におい
て測定する。
抗体依存性細胞障害を測定するために、クロム［51C
r］酸ナトリウムで予め標識された培養膵島細胞を標的
として用いる。50μｌの体積において、５×104個以下
の標識された標的細胞を、96ウエルアッセイ平板におい
て平板培養して４倍加する。正常なドナー（対照）か又
は試験対象のいずれかから得た精製免疫グロブリンの存
在下で、エフェクター細胞（例えば、ヒト末梢単核細
胞）を約100:1−12.5:1（エフェクター：標準細胞）の
割合で加える。次に、前記平板を37℃で４時間培養して
から、上澄み液を取り、ガンマカウンターでカウントす
る。特定の細胞溶解は、以下の式： 細胞溶解（％）＝［観察された放出（cpm）−自然
放出（cpm））×100/全放出（cpm）−自然放出（cpm） （式中、観察された放出はエフェクター細胞及び血清の
存在下で放出された平均放射能であり、自然放出は培地
のみの中で培養された標的細胞から放出された平均放射
能である）を用いて計算することができる。全放出可能
活性は、2.5％トリトンＸ−100で標的細胞を処理した後
で測定することができる。
細胞依存性細胞障害を測定するために、予めクロム［
51Cr］酸ナトリウムで標識された培養膵島細胞を標的と
して用いる。100μｌの体積において、５×104個以下の
標識された標的細胞を、96ウエルアッセイ平板において
平板培養して４倍加する。正常なドナー（対照）か又は
試験対照のいずれかから得た精製免疫グロブリンの存在
下で、エフェクター細胞（例えば、正常ドナーか又は試
験対象のいずれかから得た、ヒト末梢単核細胞又は分化
した（sorted）Ｔ細胞）を約100:1−12.5:1（エフェク
ター：標的細胞）の割合で加える。MHCクラスＩ制限活
性はクラスＩ適合又は不適合培養を用いるか、又は抗ク
ラスＩ阻止抗体の存在下及び非存在下のいずれかで細胞
を試験することによって排除する。次に、前記平板を37
℃で４時間培養してから、上澄み液を取り、ガンマカウ
ンターでカウントする。特定の細胞溶解は、以下の式： 細胞溶解（％）＝［観察された放出（cpm/分）−自
己放出（cpm/分）］×100/全放出（cpm/分） （式中、観察された放出はエフェクター細胞の存在下で
放出された平均放射能であり、自己放出は、エフェクタ
ー細胞を代わりに、２×105個の未標識自己細胞を用い
て培養された標的細胞によって放出された平均放射能で
あり、及び全放出可能活性は標的細胞中に取込まれた放
射能の総量である）を用いて計算することができる。
実施例10 この実施例は血糖レベルを変える必要のある哺乳動物
の血糖レベルを、本発明の培養された膵臓内分泌細胞を
使用して変化させる方法を説明する。
本発明の後期継代培養された島細胞を細胞（偽島細
胞）の合着凝集物または懸濁細胞として、ゲル化された
動物コラーゲン性マトリックス中でインキュベートする
ことにより宿主動物への移植に適した偽組織を形成し
た。特に、PDL＃19−21のHPSL−８細胞を、３時間37℃
でゲル化された等張の中性コラーゲン溶液に懸濁し、そ
れにより、各々の細胞総数約6.5×106の細胞タイプ偽組
織を形成した。PDL＃23のHPSL−８細胞も、懸濁された
細胞をエルレンマイヤーフラスコ中で37℃で３日間穏や
かに回転させることにより自発的に再凝集させた。この
３日間に、上記細胞は約20−約250の細胞からなる群に
なって再凝集し、緊密に粘着した島様球状塊である偽組
織を形成した。これらの塊をさらに上記のようにコラー
ゲンゲル中に埋没させ、偽島様偽組織として。
複合型免疫欠損症（SCID）遺伝子座において同型接合
でありその血糖レベルが58日までの期間で検定された重
度の複合型免疫欠損症（SCID）マウスを使用して上記偽
組織をインビボで処理して正常血糖に戻した。第６図に
示す。図中ｙ軸の単位は、血糖測定のためのmg％±s.e.
m.であり、ｘ軸の単位は日である。血糖測定は週に約２
回各マウスの尾静脈を切って得た血液に一滴についてAm
es GlucostixおよびAmes Glucometer IIを使用して行っ
た。まず、該マウスを、新しく調製したストレプトゾト
シン（第６図中“STZ"）溶液投与により糖尿病にした。
これは、インシュリン生産膵臓β細胞を優先的に殺すこ
とによって実験的にマウスを糖尿病にする確立された方
法である。これらのマウスを約２週間観察して、それら
の血糖レベルを糖尿病範囲、すなわち100ml当たり300mg
を越えるように上昇するのを確認した。次いで、これら
のマウスの背側脂肪パッドの部分（肩ブレードの間）に
本発明のヒト膵臓培養細胞（PDL＃19−21のHPSL−８細
胞）皮下移植片を移植した。
細胞タイプ偽組織に結合された培養されたヒト島細胞
の移植片を使用した、宿主マウス24Sについての結果
（第6A図）は大きく増大したヒト島細胞の成功した移植
片の明確な例である。上記血糖は非常に急速に正常レベ
ルに戻り少なくとも３週間、すなわち実験の間維持され
た。偽島タイプ偽組織の移植片を移植された宿主マウス
20Sは、それほど深くはないが、移植がうまく行ったよ
うに見える（第6A図参照）。このマウスは糖尿病状態を
誘発させるのにさらにストレプトゾトシンの投与を必要
とした。しかし、実験の間、偽組織の移植片を移植後、
血糖レベルが調節されたことは明らかである。
宿主マウス24Sの膵臓の死後検査によると、予想のと
おり、非常に少ないβ細胞が生き残った。この検査はス
トレプトゾトシン処理の56日後に行われた。標準的組織
学的技術を使用した。つまり、宿主マウスの膵臓の組織
学的切片のインシュリンを免疫組織化学的に染色した。
移植片（移植時に含ませた青色入れ墨インクのマーカー
によって皮下の位置が分かる）において、インシュリン
を濃く染色され移植された組織に入り込んだ毛細血管の
周りに密集したヒト細胞を見ることが可能であった。ヒ
トβ細胞を島の毛細血管に直接適用することが知られて
いるが、マウスおよびブタの島細胞においては、上記β
細胞は通常、上記毛細血管から取り出された１つまたは
２つの細胞層である。ヒト細胞は、ヒトクラスＩ組織適
合性抗原に対するモノクローナル抗血清を使用する間接
的免疫蛍光によって明確に同定された。これらの観察
は、該移植片のヒト細胞は過剰のインシュリン合成およ
び貯蔵を確立でき、細胞培養物がおおよそ1,000,000倍
膨張後でさえも毛細血管に関して特徴的に組織できたこ
とをはっきりと示している。上記移植片のヒト細胞は、
あきらかに、移植直後のマウスに見られる正常血糖を回
復させる手段であった。
実施例11 この実施例は本発明によって正常なヒト甲状腺細胞を
培養しクローニングする方法を説明する。
クーン（Coon）の4506.035またはクーンの4506.07培
地を実施例１のようにして調製した。ただし、MgCl2の
濃度を0.48mMに調整し、ハイドロコーチゾンの濃度を0.
01mMに調整し、第１セレン酸の濃度を2ng/mlにし、三ヨ
ウ化チロニンの濃度を3pg/mlにし、牛胸腺抽出物を添加
して最終濃度75μg/mlにし、牛脳下垂体抽出物を添加し
て最終濃度５μg/mlにした。
甲状腺組織のすべての調製物と処理は、Ambisi−Impi
ombatoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3455−3459（19
80）に報告されたラット細胞に使用の方法に類似した滅
菌条件下に行った。器官提供者からの正常なヒト甲状腺
を粘着性結合組織から取り出し、直径1mm未満の小片に
カットし、Ca++やMg++を含まないハンク（Hank）の平衡
塩類溶液（HBSS）中500xgで５分間遠心分離により洗
い、酵素で分解した。酵素分解は、Coon、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,55,66−73（1966）の方法によって行った。
このために、Ca++やMg++を含まないHBSS中20U/mlコラゲ
ナーゼ、CLSPA（ニュージャージー州、フリーホルド、
ワシントン）、0.75mg/mlトリプシン、1:300および２％
加熱不活性化され透析されたニワトリの血清（ジブコ
（Gibco））からなる溶液（以後CTC溶液と称する）を調
製した。この分解は震盪水浴中で37℃で２時間行った
後、組織はほとんど細胞懸濁液になった。より大きな断
片を２分間1xgで沈殿させた。上清を集め、細胞および
小胞の小片を100mm可塑性組織培養皿（ニュージャージ
ー州、ファルコン、ベクトンヂッキンソン、リンカーン
パーク）当たり105個の細胞の密度で接種した。
二次培養物は、Ca++やMg++を含まないHBSS中で洗った
後、CTC溶液中の単一層を37℃で約25分インキュベート
することによって作った。クローニングのために、単一
細胞懸濁液を100mm皿当たり102−104個の細胞となるよ
うに平板化した。クローニング平板に12mlの新鮮な培地
を“非経口”塊状細胞集団の密集した平板中で24時間プ
レインキュベートすることによって調整した培地を加え
た。個々の、前以てマークした単一細胞から得られたよ
く単離された上皮細胞コロニーをクローニングシリンダ
ーを使用して選択的にトリプシン処理した。
これらの培養工程および培地により、異なるヒトドナ
ーからの増殖する甲状腺細胞培養物を得た。６％FCS、
唾液腺抽出物単独、あるいは胸腺抽出物単独を存在させ
なくとも、ヒト甲状腺細胞の増殖を持続させるに十分で
あった。血清の存在下では、上記抽出物なしには、ある
いはそれらのいずれか１つのみでは、細胞は分割できず
（少なくとも認めうる程には）、細胞質は膨張し非常に
薄くなった。各培養物は、膵臓島細胞に比較して唾液腺
抽出物の要求において目立つ相違を示した。ほとんどの
場合、50μg/mlの唾液腺抽出物は明らかに過剰であっ
た。位相差顕微鏡下での観察のように、細胞は徐々に大
きくなり、明らかなストレスファイバーを含み、最終的
に死んだ。唾液腺抽出物を５μg/mlの濃度の支持が弱い
（less supported）健康に見える培養物に添加した。
実施例12 この実施例は本発明の甲状腺細胞培養物の特性をしら
べるのに使用される検定を説明し、そのような検定およ
びHNTB−2Kクローン細胞株に関する一般的観察の結果を
提供する。
サイログロブリン（Tg）生産を、市販のキット（ドイ
ツ、ベルリン、ヘニング製）をメーカーの指示にもとづ
いて使用して上清において標準的放射性免疫検定方法に
よって測定した。
染色体数については、培地を変えて２時間後、細胞を
10μg/mlデメコルシン（カルフォルニア州ラヨラのカル
ビオケム（Calbiochem）製のコルセミド（Colcemid））
で３時間処理し、実施例11で述べたようにCTC溶液で酵
素処理して解離し、遠心分離し、低張溶液（４部の5.6g
/lのKClおよび１部の7.3g/lのCaCl2・2H2O）に再懸濁し
た。15分後、細胞懸濁液に0.1ml、0.2mlおよび0.5mlの
固定剤（容量上3:1のメタノール／酢酸）を徐々に加
え、1000xgで５分遠心分離し、上清を傾瀉あるいは吸引
して取り除くことにより細胞を固定した。次いで、穏や
かに震盪させつつ、5mlまでの新しい固定剤を滴加し、
上述のように遠心分離し、上清を除去した。さらに、上
記手順で３回固定サイクルを繰り返した。固定した細胞
を次いで顕微鏡スライドに広げ、25段階の分裂中期の細
胞を位相差光学顕微鏡およびドローイングアタッチメン
ト（drawing attachment）を使用して観察した。
単独あるいはインシュリンの存在下での細胞増殖を促
進するTSHの能力を、3H−チミジン取り込みによって試
験した。TSH−誘導3H−チミジン取り込みを、FRTL5 Tod
ay−Proceedings Of The First International Worksho
p On Characterization And Standardization Of An In
Vitoro Thyroid Cell System,（Ambesi−Impiobato an
d Perrild eds.,Elsevier Science Publishers,1989）
（以下“FRTL5 Today"と称する）に記載の方法を以下の
ようにわずかに変形して検定した： 正常ヒト甲状腺細胞（HNTB−2X）および培養されたラ
ット甲状腺細胞（FRTL5）を24穴滴板に５×104および４
×105の密度で各々完全培地に接種した。24時間後、細
胞を３回Ca++やMg++を含まないHBSS中で洗い、0.5％FCS
抽出物を含まぬ培地にTSHを添加することなく移した。
７−14日後、細胞をCa++やMg++を含まないHBSS中で２回
洗い、0.5ml/穴の培地（ここで該培地は、チミジンを含
まず、0.1％牛血清アルブミン（BKA）（ベルギー、オレ
ン、ヤンセン（Janssen製）、2.5μCi/mlの3H−チミジ
ン（イリノイ州、アーリントンハイツ、アマーシャム
（Amersham）製）を含み、インシュリンを含まないか４
μg/mlのインシュリンを含み、TSHを含まないかウシTSH
（シグマ（Sigmi）製）を10-7M〜10-13Mの濃度で含む）
中で72時間37℃でインキュベートした。インキュベート
終了時、細胞をCa++やMg++を含まないHBSS中で２回、0.
5ml/穴の氷冷10％トリクロロ酢酸で２回洗った。上清を
除去後、0.5ml/穴の２％ドデシル硫酸ナトリウムを加
え、10分後、上清を取り込まれた3H−チミジンについて
液体シンチレーションスペクトロスコピーで分析した。
TSH−誘発cAMP蓄積をFRTL5 Todayに記載された方法を
少し変えて下記のように検定した： HNTB−2KおよびFRTL5細胞を96穴滴板に５×104および
２×105の密度で各々完全培地に接種した。24時間イン
キュベートした後、細胞を３回Ca++やMg++を含まないHB
SS中で洗い、0.5％FCS抽出物を含まぬ培地にTSHを添加
することなく移した。７−14日後、細胞をクレブスーリ
ンゲル緩衝液中で２回洗い、0.1ml/穴の同じ緩衝液（0.
1％牛血清アルブミン（BSA）、2mg/mlのグルコース、0.
5mM3−イソブチル−１−メチルキサンチンおよびウシTS
H（シグマ（Sigmi）製）を10-7M〜10-13Mの濃度で含
む）中で１時間37℃でインキュベートした。この反応は
インキュベーション培地を取り除き0.1ml/穴の70％エタ
ノールを添加することによって停止された。室温で20分
後、平板を遠心分離し、上清をプラスチック管に移し、
エタノールを40℃で蒸発させた。cAMPの量を市販の放射
性免疫検定キット（カルフォルニア州、ロスアンジェル
ス、ダイアグノスチックプロダクトコーポレイション
製）によってメーカーの指示にしたがって測定した。
下記チャートは正常ヒトドナーから得られた甲状腺の
異なるクローンによるサイログロブリン生産を示す： 細胞株 PDL TG（ng/細胞／日） HNTB−１ 20 1317 HNTB−1CL Ａ 20 18 HNTB−1CL Ｄ 20 25 HNTB−1CL Ｆ 20 21 HNTB−1CL Ｇ 18 22 HNTB−1CL Ｇ 20 28 HNTB−1CL Ｋ 15 92 HNTB−1CL Ｊ 20 19 HNTB−２ 18 1267 HNTB−2CL Ａ 15 28 HNTB−2CL Ｂ 15 46 HNTB−2CL Ｃ 15 77 HNTB−2CL Ｅ 15 18 HNTB−2CL Ｆ 15 44 HNTB−2CL Ｈ 15 18 HNTB−2CL Ｉ 15 20 HNTB−1CL Ｋ 15 1234 HNTB−2CL Ｋ 20 1262 HNTB−2CL Ｊ 15 22 HNTB−2Kのクローン形態学的特徴は位相差顕微鏡で関
西した場合、均一ではなく細胞の増殖状態に影響され
た：非融合性対数期培養物は最も長い薄目の細胞を示
し、融合培養物ではより古典的上皮細胞らしくなり、細
胞内に濃い細胞質と多くの分泌顆粒を示した。カウント
されたすべての分裂中期において核型は正常の２倍体染
色体数であった。完全培地において、HNTB−2Kクローン
の細胞数を２倍にする時間は58時間であった。
試験したすべての濃度において、TSHは、それ単独あ
るいはインシュリンの存在下に急性的には3H−チミジン
取り込みを促進できなかった。これは、TSHがマイトジ
ェン因子であると報告されている場合のラット径（FRTL
5）とは対照的である。第７図は、FRTL5によって急性的
に促進された3H−チミジン取り込み（対照；交叉孵化さ
せたバー）、およびHNTB−2K（斑点のあるバー）細胞に
よる種々の濃度のTSHの存在下、単独または５μg/mlの
インシュリン共存の場合の応答の欠如を示している。数
値は対照を越える組織として表した。
急に添加されたTSHは用量依存性の、10倍まで増加し
たcAMP蓄積をHNTB−2K細胞において誘発し得た。非常に
低濃度（10-11M）でさえも１時間以内に促進されること
が明らかである。この検定でのHNTB−2K細胞の行動は同
じ検定におけるラット甲状腺細胞の行動と著しく類似し
ている。第８図はFRTL5（対照；閉じたサイクル）およ
びHNTB−2K（開いたサークル）細胞におけるcAMP蓄積の
TSH促進用量依存性増加を示している。種々の濃度のTSH
を受けた細胞を総タンパク質mg当たりcAMPの濃度につい
て検定し、第８図のｙ軸に示した。
HNTB−2K細胞は、形質転換された細胞の通常の状態を
何ら示さないので形質転換されないように見える：
（１）軟寒天において細胞該は増殖しない；（２）該細
胞は２倍体核型を保持した；（３）該細胞は増殖のため
に血清または抽出物要求の減少を示さなかった；（４）
もう１つの実験の１部として、HNTB−2Kは、２匹のSCID
マウスに５×106および107個の細胞を移植した45日後で
も腫瘍をつくらなかった；そして（５）クローニング効
率は培養の継代につれて低下しなかった。
実施例13 この実施例は本発明の耳下腺細胞の培養を説明する。
培養培地は実施例１に従って調製した。正常耳下腺の
２つの提供された器官試料（≦2g）、および該耳下腺の
正常に見える部分から外科的に取った２つの試料を、、
全耳下腺が癌治療のために切除される時取り出した。異
なる大人のヒトからの明らかに健康な耳下腺の４つの試
料すべての耳下腺細胞の培養は成功した。これらの組織
試料は患者から取り出して３時間以内に培養開始した。
各場合、これらの細胞を培養に移す方法は実質的に同
じであった。１ないし2gの健康な組織を切り取り、タイ
トルを付けたペトリ皿の縁で、鈍い先端の“あやめ”バ
サミで繰り返し挟むことにより細かく刻んだ。この組織
を１−2mm3の小片にした場合、トリプシンーコラゲナー
ゼにより分解混合物を２−4ml加え、組織を37℃で１−
４時間、室温（21℃）で12−15時間（一晩）インキュベ
ートした。この分解の間、該組織を単一の細胞および50
−100個の細胞を含む腺組織の小片にした。激しく混合
して塊をさらに壊した後、これらの細胞を新しい培地
（クーンの4506.07）中で洗った。細胞および断片を３
−10mmプラスチックの組織培養ペトリ平板中に広げ、12
mlの培地（クーンの4506.07）中で加湿した５％CO2雰囲
気インキュベーター中で36.5℃で７−10日間培養した。
穿刺生検から得た非常に少量の組織についての別法を
使用して、唾液腺細胞および刻んだ小片（約1mm3）をKl
einmanら、Biochemistry,25、312（1986）に従い再構成
した基底膜から作ったゲルに埋没させた。再構成した基
底膜は、大部分がタイプIVのコラーゲンで構成されるEH
Sマウスの軟骨肉腫の抽出物からなる。正常な基底膜ま
たは層板の生化学的組成に類似の組成を有する細胞外物
質の抽出物は上記Kleinmanの文献によって示され広範囲
の上皮細胞の増殖および分別を促進し、ベクトン ディ
ッキンソンの子会社である、ニュージャージー州リンカ
ーンパークのコラボレイチヴバイオメジカル（Collabor
ative Biomedical）から“MatrigelTM"として市販され
ている。
一次培養条件下に、唾液腺細胞を約１または２週間増
殖させ、その時点でトリプシンおよびコラゲナーゼで処
理し、洗い、希釈して新しい二次培養物（継代１あるい
はP1と称する）にした。細胞が平板表面上あるいは再構
成基底膜ゲルの網の下あるいは中に広がった後、トリプ
シンおよびコラゲナーゼを使用して最小限の細胞損失で
解離でき、クローニングのために新しい平板に２−10な
いし１の分割比で接種しあるいは500,1000,2500,5000細
胞/100mm平板の割合で希釈し広げた。平板培養効率はド
ナーによって0.01％の低い値から0.1％の高い値まで変
化した。均一ならし培地（CM）中で２ないし３週間培養
後、コロニーを単離し、増殖させ細胞集団（クローン細
胞株）にし、該集団に規則的に週当たり２回新しい培地
4506.07と完全に入れ換えた。これらの細胞集団のいく
つかの部分を凍結して公的記録保存とし、残りの細胞を
唾液腺糖蛋白質について検定した：グスチンおよびルミ
カルミン使用間接的免疫細胞化学（すべての試料は明ら
かに陽性であったが、陰性対照、すなわちヒト正常甲状
腺細胞は陰性であった。）酵素検定の結果、継代６（P
6）で試験された細胞が上記培地中に1820IU/mlアミラー
ゼ活性を分泌したことを分かった。アミラーゼは耳下腺
分泌の特徴的マーカーである。これらの３つの主たる唾
液腺蛋白質の発見に基づいて、各培養物は、移植に適す
るであろうよく分別されたヒト耳下腺細胞であることが
分かった。
本明細書で引用した、公報、特許、特許出願などの各
文献の内容はここに参考とし記載されている。
本発明は以上のように記載されたが、多くの方法で変
化させることが可能である。そのような変化は本発明の
趣旨と範囲から逸脱せず、すべてのそのような修飾は当
業者にとり自明であり、請求の範囲の範囲内に含まれる
と考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クルチオ，フランチェスコ イタリア国イー―33010 パニャッコ, ヴィア・デイ・カスターニ 35／１ (56)参考文献 特開 平３−87174（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−74982（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−71487（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−87172（ＪＰ，Ａ) 米国特許5160490（ＵＳ，Ａ) ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ ＶＯ Ｌ．126 ＮＯ．４ Ｐ．1895−1903 中井準之助他１名編 「組織培養基礎 と応用」再版 朝倉書店 昭和40年11月 10日 94−126頁 ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ ＶＯＬ．77 Ｎｏ．６ Ｐ Ｐ．3455−3459 ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ ＶＯＬ．86 ＰＰ．1703− 1707 ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ ＶＯ Ｌ．128 ＮＯ．１ ＰＰ．45−57 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/00

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトの腺、肝臓、副腎皮質、口腔粘膜、軟
    骨、内耳、尿道、および膀胱の細胞から成る群より選択
    されるヒトの細胞の増大した非形質転換ヒト細胞培養物
    を製造する方法であって、 （ａ）上記細胞を該細胞を含むヒト組織から選択し； （ｂ）該選択された細胞を濃縮し； （ｃ）該濃縮された細胞を培地中で再懸濁し； （ｄ）該再懸濁された細胞を細胞分裂を持続して行わせ
    る時間および条件下に培養し；そして （ｅ）該培養された細胞を周期的に継代して該培養物を
    増大せしめる 工程を含み、 上記培地が視床下部抽出物、下垂体抽出物、胎盤抽出物
    又は胎盤性乳腺刺激ホルモンからなる群より選択される
    成長因子を含む組織抽出物を追加した基本培地を含み、
    上記培地が細胞分裂を維持している上記のヒト細胞に有
    利であって実質的に線維芽細胞、マクロファージ、及び
    毛細管内皮細胞を含まない増大したヒト細胞培養物を提
    供するように選択されている方法。
  2. 【請求項２】ヒトの細胞が膵臓内分泌腺細胞を含み、培
    地が視床下部および下垂体を含み、さらに胎盤抽出物及
    び／又はヒト胎盤性乳腺刺激ホルモンを含む組織の抽出
    物を追加した基本培地を含む請求項１の方法。
  3. 【請求項３】請求項１の方法によって作られた増大した
    非形質転換ヒト細胞。
  4. 【請求項４】培地が約100−150mg/Lの範囲のマグネシウ
    ム塩濃度により与えられるマグネシウムイオン；約40−
    125mg/Lの範囲のカルシウム塩濃度により与えられるカ
    ルシウムイオン；約0.12−0.40mg/Lの範囲の亜鉛塩濃度
    により与えられる亜鉛イオン；約40−100mg/Lの範囲の
    アスコルビン酸濃度；約300−400mg/Lの範囲の重炭酸塩
    濃度により与えられる重炭酸塩イオン；約200−325mg/L
    の範囲のカリウム塩濃度により与えられるカリウムイオ
    ン；約600−1200mg/Lの範囲の糖濃度；約100−10,000ng
    /mlの範囲のインシュリン濃度；約20−60ml/Lの範囲の
    血清又は血清に由来する成長因子を含む合成溶液；視床
    下部および下垂体を含む成長因子を含有する組織の抽出
    物；を提供する基本培地を含む請求項１の方法。
  5. 【請求項５】細胞培養物が凝集した細胞、非凝集細胞、
    またはそれらの混合物を含む請求項１の方法。
  6. 【請求項６】凝集した細胞または非凝集細胞がマトリッ
    クス埋没させられる請求項５の方法。
  7. 【請求項７】腺細胞が膵臓、耳下腺、甲状腺、前立腺、
    涙腺、上皮小体、汗腺および毛包からなるヒトの腺の群
    より選択される請求項１の方法。
  8. 【請求項８】ヒトの腺、神経芽細胞、肝、副腎皮質、口
    腔粘膜、軟骨、内耳、尿道および膀胱からなる群より選
    択されるヒトの細胞の増大した非形質転換ヒト細胞培養
    物のクローン株を調製する方法であって、以下の工程か
    らなる方法： （ａ）請求項１の方法にしたがって得られた細胞培養物
    を培養し； （ｂ）該培養物を密集細胞層になるまで増殖させ； （ｃ）該細胞を解離させ； （ｄ）該解離させた細胞を第１平板培養のためのならし
    培地を含む培養容器に接種し、該接種した細胞を培養し
    て細胞のコロニーを生産し； （ｅ）個々の細胞コロニーを回収し； （ｆ）該コロニーを第２平板培養のための培養容器に接
    種し、該接種された細胞を培養し；そして （ｇ）段階（ｆ）の細胞を周期的に継代する。
  9. 【請求項９】培地が約100−150mg/Lの範囲のマグネシウ
    ム塩濃度により与えられるマグネシウムイオン；約40−
    125mg/Lの範囲のカルシウム塩濃度により与えられるカ
    ルシウムイオン；約0.12−0.40mg/Lの範囲の亜鉛塩濃度
    により与えられる亜鉛イオン；約40−100mg/Lの範囲の
    アスコルビン酸濃度；約300−400mg/Lの範囲の重炭酸塩
    濃度により与えられる重炭酸塩イオン；約200−325mg/L
    の範囲のカリウム塩濃度により与えられるカリウムイオ
    ン；約600−1200mg/Lの範囲の糖濃度；約100−10,000ng
    /mlの範囲のインシュリン濃度；約20−60ml/Lの範囲の
    血清又は血清に由来する成長因子を含む合成溶液；視床
    下部および下垂体を含む成長因子を含有する組織の抽出
    物を提供する基本培地を含む請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】約100−150mg/Lの範囲のマグネシウム塩
    濃度により与えられるマグネシウムイオン；約40−125m
    g/Lの範囲のカルシウム塩濃度により与えられるカルシ
    ウムイオン；約0.12−0.40mg/Lの範囲の亜鉛塩濃度によ
    り与えられる亜鉛イオン；約40−100mg/Lの範囲のアス
    コルビン酸濃度；約300−400mg/Lの範囲の重炭酸塩濃度
    により与えられる重炭酸塩イオン；約200−325mg/Lの範
    囲のカリウム濃度により与えられるカリウムイオン；約
    600−1200mg/Lの範囲の糖濃度を提供し、約100−10,000
    ng/mlの範囲のインシュリン濃度；約20−60ml/Lの範囲
    の血清又は血清に由来する成長因子を含む合成溶液；ト
    ランスフェリン；トリヨードサイロニン；亜セレン酸；
    ヒドロコルチゾン；ゲンタマイシン；並びに視床下部お
    よび下垂体を含む成長因子を含有する組織の抽出物を追
    加した基本培地を含む培地。
  11. 【請求項１１】請求項１の方法によって作られた膵臓内
    分泌腺細胞、甲状腺細胞、上皮小体細胞又は耳下腺細胞
    の増大した非形質転換ヒト細胞培養物。
  12. 【請求項１２】請求項８の方法によって作られた細胞の
    増大した非形質転換ヒト細胞培養物のクローン株。
  13. 【請求項１３】上記細胞が単一の前駆細胞に由来する請
    求項11の増大した細胞培養物。
  14. 【請求項１４】前記細胞がヒトに由来する請求項13の増
    大した細胞培養物。
  15. 【請求項１５】該細胞培養物が凝集細胞、非凝集細胞ま
    たはそれらの混合物を含む請求項11の増大した細胞培養
    物。
  16. 【請求項１６】該細胞培養物が凝集細胞または非凝集細
    胞がマトリックス埋没されている請求項15の増大した細
    胞培養物。
  17. 【請求項１７】該細胞培養物が凝集細胞または非凝集細
    胞がゲルマトリックスに埋没されている請求項16の増大
    した細胞培養物。
  18. 【請求項１８】請求項１の方法によって作られた増大し
    た非形質転換二倍体ヒト細胞培養物を化学物質又は体液
    試料に対して暴露し且つ該暴露の該培養物の増大した非
    形質転換ヒト細胞に対する作用を評価することを含む細
    胞障害性又は自己免疫原因物質の検出のための検定。
  19. 【請求項１９】前記細胞が膵島細胞、甲状腺小胞細胞、
    上皮小体組織細胞および耳下腺細胞からなる群より選択
    される請求項18の検定。
  20. 【請求項２０】請求項１の方法によって作られた上記膵
    臓内分泌腺細胞の増大した培養物から収穫された増大し
    た非形質転換膵臓内分泌腺細胞を含む膵臓偽組織。
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