CN114762697A - 用于治疗糖尿病的药物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于治疗糖尿病的药物及方法。在本发明中，提供了一种来源于胰腺外分泌腺的间充质干细胞或胰腺外分泌腺组织在制备治疗/预防糖尿病药物当中的应用。所述胰腺外分泌腺通过胰腺外分泌腺来源的间充质干细胞异位再生自然分化形成。现有技术普遍认为，细胞治疗糖尿病主要是因为再生了胰岛细胞。本领域技术人员在研究糖尿病的时候，也普遍地将胰岛细胞作为研究目标。而发明人克服本领域的技术偏见，惊奇地发现，将胰腺间充质干细胞异位移植入动物体内，通过再生胰腺外分泌腺而不是胰岛细胞达到治疗糖尿病的作用，对推进糖尿病的研究具有里程碑式的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于治疗糖尿病的药物及方法。
背景技术
糖尿病是由胰岛素不足及其功能丧失而发展成的疾病，一旦发展成糖尿病很难治愈。糖尿病可主要分为I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)两种类型。II型糖尿病是由胰岛素抗性发展成的慢性疾病，它成为与生活习惯有关的问题，例如由于过度进食和不活动引起的肥胖，压力等，II型糖尿病通常在中老年人中发展，并且许多糖尿病患者患有II型糖尿病。I型糖尿病是由自身免疫性疾病，病毒感染等破坏胰腺细胞(也称作胰岛素产生细胞)以终止体内胰岛素分泌而引起的慢性疾病。
近年来，糖尿病发病率呈上升趋势，而且趋于年轻化，糖尿病已成为严重危害人类健康的常见内分泌代谢性疾病。不同类型的糖尿病都会导致胰腺内的β细胞不能产生足量的胰岛素以降低血糖的浓度，导致高血糖症的发生。目前治疗的手段主要采用药物治疗，药物治疗虽能降低血糖，无法对糖尿病进行根治；使用胰岛素进行治疗可以控制症状，但是长期使用会产生对胰岛素的耐受。胰岛移植手术风险小，是治愈糖尿病的有效手段，但供体相对不足及移植后的免疫排斥反应等严重阻碍了该疗法的广泛应用。糖尿病由于其广泛的流行性以及缺乏可治愈的方法而成为主要的公共卫生问题。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了来源于胰腺外分泌腺的间充质干细胞或胰腺外分泌腺组织在制备治疗/预防糖尿病药物当中的应用。
一些实施方案中，所述的胰腺外分泌腺组织由胰腺外分泌腺的间充质干细胞生成。一些实施方案中，所述的胰腺外分泌腺的间充质干细胞药物为注射制剂。
一些实施方案中，所述的胰腺外分泌腺的间充质干细胞药物为肾囊膜下注射制剂。
一些实施方案中，本发明提供了促进形成胰腺外分泌腺的物质在制备治疗/预防糖尿病药物当中的应用，所述胰腺外分泌腺通过胰腺外分泌腺来源的间充质干细胞异位再生自然分化形成。
胰腺具有内分泌腺(内分泌细胞)和外分泌腺(外分泌物细胞)，并且是在这两种分泌细胞中起重要作用的器官。外分泌物细胞主要起到分泌胰脂肪酶，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，胰淀粉酶等消化酶的作用。
一些实施方案中，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗治疗/预防糖尿病的系统，包含胰腺外分泌腺的间充质干细胞，以及植入装置。一些实施方案中，所述的植入装置用于将胰腺外分泌腺的间充质干细胞植入患者体内定点部位。
一些实施方案中，所述的介入装置为穿刺器。
一些实施方案中，所述的定点部位为包括肾囊膜下、皮下、或肠系膜。
一些实施方案中，所述的系统还包含超声装置或内窥镜装置，所述超声装置或内窥镜装置用于引导所述穿刺器的定位。
一些实施方案中，所述植入为肾囊膜下植入。
一些实施方案中，所述异位再生的位置包括肾囊膜下、皮下。
其中，Ⅰ型糖尿病患者体内胰岛β细胞坏死，不产生胰岛素，目前无治愈手段。近来国内外均有研究报道MSC可促进胰岛细胞再生，MSC移植有望成为糖尿病治疗的新方法，尤其是针对1型糖尿病的治疗。也就是说，目前普遍都认为间充质干细胞通过再生胰岛β细胞达到治疗糖尿病的作用。例如2008年，同济大学附属第十人民医院宋振顺团队发现胰腺干细胞可分化为分泌胰岛素的胰岛样结构，胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植对大鼠糖尿病有治疗作用。他们还发现具有多向分化潜能的MSC在体内也可分化为产胰岛素细胞(insulin-producing cell，IPC)和血管内皮细胞，MSC及其来源的IPC移植明显促进了受体残余胰岛周围新生血管的生成，进而使残余胰岛得到增殖，这一研究得到Barky等的证实。此外，Arzouni等的研究也发现MSC移植后可通过释放膜联蛋白A1(ANXA1)和细胞外基质改善人胰岛功能。一些研究还表明，自体来源的MSC和胰岛共同移植可提高胰岛移植的成功率和安全性，有效减轻异体移植免疫排斥反应及早期因炎症反应引起的移植物损失，或可为1型糖尿病治疗提供新的方案。再例如DaisongWang等的研究提到，胰岛祖细胞可形成胰岛样组织，其中胰岛β细胞在组织中占主要的。这种组织长期培养可以逆转糖尿病。
可见，现有技术普遍认为，细胞治疗糖尿病主要是因为再生了胰岛细胞。本领域技术人员在研究糖尿病的时候，也普遍地将胰岛细胞作为研究目标。
而发明人克服本领域的技术偏见，惊奇地发现，将胰腺间充质干细胞异位移植入动物体内，通过再生胰腺外分泌腺而不是胰岛细胞达到治疗糖尿病的作用，并且其治疗非常显著。
此外，我们使用基因敲除小鼠模型显示缺乏IL-6会导致STZ诱导的1型糖尿病的严重性增加，并且对PMSC植入的治疗有抵抗力，从而证实了PMSC作用于IL-6保护β细胞。
一些实施方案中，本发明还提供了一种获得胰腺外分泌腺的组织的方法，所述的胰腺外分腺的组织通过植入间充质干细胞而形成。
在一些实施方案中，所述的胰腺外分腺的组织通过向动物体内异位植入间充质干细胞而形成。在一些实施方案中，所述动物选自猪、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、马、狗、猩猩、猴。在一些实施方案中，所述动物选自小鼠。
在一些实施方案中，所述植入包括肾囊膜下植入、皮下植入、肠系膜植入等。
在一些实施方案中，所述植入为肾囊膜下植入。
在另一些实施例中，所述的胰腺外分腺的组织以非活体的组织模型植入。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞包括胰腺间充质干细胞、骨髓间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞为胰腺间充质干细胞。
在一些实施方案中，发明人研究发现，与静脉内输注PMSCs相比，PMSCs的肾囊膜下植入在STZ诱导的小鼠中显示出显著的持续治疗效果。本发明揭示了外分泌胰腺再生在保护β细胞方面的未知作用，并证明了1型糖尿病治疗的土壤拯救种子策略。
在一些实施方案中，所述的间充质干细胞为游离的间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述的间充质干细胞无需处理直接植入。而在目前的现有技术中，用间充质干细胞治疗糖尿病，间充质干细胞一般都会先在体外进行处理激活。例如BEHROUSDAVANI等人研究人胰岛来源的间充质干细胞用于治疗I型糖尿病时，从胰岛取得细胞后，使用生长培养基进行体外扩增，向扩增后的间充质干细胞中加入分化诱导液进行诱导(诱导液成分如下：CMRL-1066培养液加入2mM L-glutamine,1％(wt/vol)bovine serumalbumin(BSA)，Fraction V Fatty Acid Free(MP Biomedicals,Irvine,CA,http://www.mpbio.com),and 1×insulin-transferrinselenium-A(Gibco))。诱导4天后，间充质干细胞形成了上皮细胞簇，将上皮细胞簇移通过肾囊膜下植入后，形成了胰岛样的细胞聚集体(BEHROUS DAVANI，et al.Human Islet-Derived Precursor Cells Are MesenchymalStromal Cells That Differentiate and Mature to Hormone-Expressing Cells InVivo.Stem Cells,2007,25:3215–3222.)。再例如Daisong Wang等通过流式分选Procr+胰腺干细胞与内皮细胞在体外共培养、扩增一段时间后植入体内，形成胰岛组织，移植小鼠体内，逆转糖尿病(Daisong Wang，et al.Long-Term Expansion of Pancreatic IsletOrganoids from Resident Procr+Progenitors.Cell,2020,180:1198–1211.)。
而本发明则可以直接将体外常规培养的间充质干细胞，消化成单个游离的细胞之后，直接植入动物体内即可达到治疗效果。
在一些实施例中，所述的培养扩增的胰腺来源的间充质干细胞(PMSC)表达了多种胰腺祖细胞标记PDX1，Nkx6.1，Ptf1a，Hnf1b和Ngn3。
在一些实施方案中，所述获得胰腺外分泌腺的组织的方法包括以下步骤：(1)用培养液培养间充质干细胞；(2)去掉步骤(1)中的间充质干细胞的培养液，收集间充质细胞；(3)将步骤(2)中收集到的间充质干细胞用PBS或生理盐水(但又不限于此)混悬后，植入动物肾囊膜下、皮下或肠系膜上，从而获得胰腺外分泌组织。
在一些实施方案中，所述PBS为微量的PBS。
一些实施方案中，所述的间充质干细胞可以与明胶海绵等支架材料混合。
在一些实施方案中，步骤(1)中的培养液的成分包括FBS，谷氨酰胺(200mM)，2-ME和α-MEM。
在一些实施方案中，步骤(1)中的培养液的成分包括FBS，青霉素/链霉素溶液，谷氨酰胺(200mM)，2-ME(55mM)，α-MEM。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞培养至P1-P3代，但又不限于此。
在一些实施方案中，本发明提供了一种胰腺外分泌腺的组织，所述的胰腺外分泌腺的组织通过所述的方法获得。
在一些实施方案中，本发明提供了所述的胰腺外分泌腺的组织在胰腺相关疾病的治疗药物的发现筛选、或胰腺相关疾病治疗药物的毒性测定、或胰腺胚胎学、或胰腺细胞谱系和分化途径的研究、或基因表达研究、或参与胰腺损伤和修复的机制研究、或胰腺的炎症性疾病研究、或治病机制研究中的体外用途。
在一些实施方案中，所述的胰腺外分泌腺的组织在重组基因表达中的应用。
在一些实施方案中，所述的胰腺外分泌腺的组织在制备用于治疗胰腺病症或胰腺疾病的药物中的应用，或者在制备用于再生医学的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的胰腺疾病包括糖尿病。
在一些实施方案中，所述的糖尿病优选为Ⅰ型糖尿病。
附图说明
图1为鼠PMSC的鉴定。(A)流式细胞仪分析证实CD105+PMSCs共表达β细胞标记物胰岛素，腺泡细胞标记物淀粉酶，导管细胞标记物CK19和胰腺祖细胞标记物Ngn3，Ptf1a，Hnf1β，PDX1和Nkx6.1。(B)流式细胞仪分析显示，PMSC表达间充质干细胞表面标志物Sca-1，CD105，CD73，CD44，而血液细胞标志物CD34和CD45呈阴性。(C,D)PMSCs具有成骨和成脂分化潜能,n＝3。(E)PMSCs显示出形成CFU-F的能力，并且比BMMSCs具有更高的增殖速率,n＝3。(F)免疫荧光染色显示CD105+PMSCs表达胰岛细胞标志物胰岛素(insulin)，胰腺外分泌腺细胞标志物淀粉酶(amylase)，导管细胞标记物CK19，胰腺祖细胞标记物Ngn3，Ptf1a，Hnf1β，PDX1和Nkx6.1。(G)流式细胞仪分析表明PMSCs表达了间充质干细胞表面标记CD44，并共表达β细胞标记胰岛素，腺泡细胞标记淀粉酶和胰腺祖细胞标记Ngn3，Ptf1a，Hnf1β，PDX1和Nkx6.1。
图2为胰腺干细胞再生异位外分泌胰腺。(A)野生型小鼠异位再生胰腺的H&E染色和免疫荧光染色。(B)代表性H&E和免疫荧光图像显示，野生型小鼠中肾囊膜下植入的PMSCs异位再生外分泌胰腺，其含有数量有限的胰岛素阳性细胞。比例尺，500μm。(C，D)代表性H&E和免疫荧光图像显示，免疫缺陷小鼠中肾囊膜下植入的PMSCs异位再生外分泌胰腺，其含有数量有限的胰岛素阳性细胞。免疫荧光显示异位再生胰腺中胰岛素和淀粉酶均呈双重染色。右图是左H&E图像中来自方框区域的免疫染色图像的更高放大倍数视图。黑色虚线表示肾脏和再生的外分泌胰腺的交界处。黄色虚线表示外分泌胰腺腺泡。Kidney：肾，EP：异位胰腺。(E)野生型小鼠的正常和异位再生胰腺的H&E和免疫荧光染色。异位再生胰腺的H&E染色显示外分泌胰腺区室的典型染色，与正常胰腺相似。免疫荧光检测显示，异位再生的胰腺其内分泌细胞标志物，例如β细胞的胰岛素、α细胞的胰高血糖素、δ细胞的生长抑素和PP细胞的胰腺胰多肽染色均呈阴性；但腺泡和导管细胞标志物如淀粉酶、胰蛋白酶、胰脂酶和CK19染色呈阳性。右图是左H&E和免疫染色图像中方框区域的较高放大率视图。白色虚线表示肾脏与再生的外分泌胰腺的交界处。黄色虚线表示外分泌胰腺腺泡。黑色虚线表示导管。EP：异位胰腺。比例尺，低放大倍数为200μm，高放大倍数为50μm。(F)定量分析表明植入的80.0％PMSCs在肾囊膜下再生了外分泌胰腺；在再生的外分泌胰腺中，仅检测到12.5％的胰岛素阳性细胞。所有结果是代表至少三个独立实验中产生的数据。
图3为PMSCs介导的肾囊膜下胰腺再生改善了STZ诱导的I型糖尿病。(A)与BMMSC植入组相比，肾囊膜下植入PMSCs可以显著降低1型糖尿病小鼠的血糖水平。用多次低剂量链脲佐菌素(STZ，五剂50mg/kg体重)注射液诱导野生型小鼠糖尿病。使用尾静脉血液样本(n＝5)测量指定组小鼠的血糖水平。(B)PMSC植入挽救了葡萄糖清除能力。植入后2个月使用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠葡萄糖清除能力，n＝3。(C,D)PMSC植入增强了血清C肽和胰岛素水平。其中植入后2个月通过ELISA测量血液C肽和胰岛素水平，n＝5。(E)代表性的H&E和免疫荧光图像显示了在1型糖尿病小鼠中，PMSCs的肾囊膜下植入再生了异位外分泌胰腺，此再生胰腺中检测不到胰岛素阳性的细胞。(F)植入PMSCs显著提高了免疫缺陷小鼠单次高剂量注射STZ(200mg/kg体重)诱导的1型糖尿病的存活率。糖尿病小鼠的Kaplan-Meier生存分析表明，与BMMSC植入相比，PMSC植入显著改善了小鼠的寿命(STZ和BMMSC-KC组为n＝4，PMSC-KC组为n＝5)。(G)PMSC植入可显著降低1型糖尿病小鼠的血糖水平。通过收集尾静脉血样植入来测量指定组中每只小鼠的血糖水平(STZ和BMMSC-KC组为n＝4，PMSC-KC组为n＝5)。(H)PMSC植入挽救了葡萄糖清除能力。植入后2个月使用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠葡萄糖清除能力，n＝3。(I)具有代表性的H&E和免疫荧光图像显示，在1型糖尿病小鼠中，PMSCs的肾囊膜下植入可以再生无法检测到产胰岛素细胞的异位外分泌胰腺。KC：MSCs的肾囊膜下植入。(J-L)与全身输注PMSCs相比，PMSCs的肾脏囊膜下植入在葡萄糖清除率，血清C肽和胰岛素水平方面获得了更大的改善。在植入后2个月，在IPGTT测试期间测量血糖水平，n＝3。在植入后2个月，通过ELISA测量血液C肽水平，n＝5。(M)与通过尾静脉全身注入PMSCs相比，PMSCs的肾囊膜下植入对1型糖尿病小鼠产生了长期的血糖改善。使用尾静脉血液样本(n＝5)测量指定组小鼠的血糖水平。PMSC-systemic：PMSC的全身性输注。比例尺，50μm。所有结果代表至少三个独立实验中产生的数据。误差线＝平均值±SD。使用带有Dunnett检验的双向ANOVA(two-wayANOVA)或带有Bonferroni校正的单向ANOVA(one-way ANOVA)对数据进行分析，以比较多个组。在一个组内，将每个时间点与时间＝0组进行比较；在组之间，将每个组与STZ组进行比较。NS，无统计学差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图4为PMSCs的肾囊膜下植入可挽救1型糖尿病小鼠受损的原位胰腺/胰岛。(A)接受了PMSCs的肾囊膜下植入的1型糖尿病小鼠的原位胰腺/胰岛的代表性H&E图像。黑色虚线表示1型糖尿病小鼠胰腺中的胰岛。(B)免疫荧光染色显示，来自1型糖尿病小鼠的胰腺中的胰岛素和淀粉酶共染色。黑色虚线表示1型糖尿病小鼠的胰岛。(C)Ki67和胰岛素共同染色显示，植入PMSCs显著增加了1型糖尿病小鼠受损的胰岛β细胞的增殖。(D)代表性的H&E图像显示，与全身输注PMSCs相比，PMSCs的肾囊膜下植入可大大挽救1型糖尿病小鼠的胰岛受损。右图显示了胰岛面积的定量，n＝5。(E)免疫荧光染色显示1型糖尿病小鼠胰腺中胰岛素和淀粉酶共染色。黑色虚线表示1型糖尿病小鼠胰腺中的胰岛。右图显示了胰岛素阳性细胞的定量，n＝5。(F)Ki67和胰岛素共染色显示，与全身性输注PMSCs相比，PMSCs可显著增强1型糖尿病小鼠胰岛β细胞受损的增殖。右图显示Ki67和胰岛素双阳性细胞的定量，n＝5。PMSC-KC：PMSCs的肾囊膜下植入，PMSC-systemic：PMSCs的系统性输注。所有结果代表至少三个独立实验中产生的数据。使用带有Dunnett检验的双向ANOVA(two-way ANOVA)或带有Bonferroni校正的单向ANOVA(one-way ANOVA)对数据进行分析，以比较多个组。在一个组内，将每个时间点与时间＝0组进行比较；在组之间，将每个组与STZ组(a，b，f，g)进行比较。NS，无统计学差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图5为胰腺外分泌腺特异性标志物胰蛋白酶和胰脂肪酶与β细胞标志物胰岛素的共染色。(A，B)免疫荧光染色显示1型糖尿病小鼠胰腺中的胰岛素与腺泡细胞标志物胰蛋白酶和胰脂酶共染色。与BMMSCs植入或全身输注PMSCs相比，PMSCs的肾囊膜下植入可显著挽救STZ诱导的受损的胰岛素阳性β细胞以及胰蛋白酶和胰脂肪酶阳性的腺泡细胞。比例尺，50μm。所有结果代表至少三个独立实验中产生的数据。
图6为PMSC表达高水平的IL-6以保护胰岛β细胞。(A)PMSCs分泌的IL-6水平明显高于BMMSCs。来自小鼠PMSC和BMMSC的培养上清液的细胞因子阵列分析。取等体积的PMSC和BMMSC培养上清液用于细胞因子阵列(n＝3)。(B-D)ELISA，PCR和Western blot分析证实，PMSCs表达的IL-6水平高于BMMSCs。
图7为代表性的免疫荧光图像显示，肾囊膜下植入IL-6敲除的PMSC无法挽救1型糖尿病小鼠的受损原代胰岛(如胰岛素和Ki67染色)。黑色虚线表示胰岛。右图是标记物+细胞的定量，n＝5。比例尺，200μm，低倍放大。
图8为PMSC表达高水平的IL-6以保护β细胞。(A)流式细胞仪分析表明，大多数CD105+PMSC表达IL-6。(B)胰腺组织的免疫染色显示在外分泌和内分泌组织中均检测到IL-6。(C,D)PMSC在体外保护MIN6β细胞免受STZ诱导的细胞凋亡。在5-10mg/mL STZ处理24小时后，将MIN6β细胞与PMSC或BMMSC共培养。通过用annexinV和7AAD标记，测量MIN6细胞的凋亡，n＝3。在培养24小时的活(C)或凋亡(D)的MIN6β细胞上门控的代表性流式细胞仪图。MIN6组：STZ处理MIN6β细胞24小时后，继续培养；PMSC+MIN6：STZ处理MIN6β细胞24小时后，与PMSC共培养；BMMSC+MIN6：STZ处理MIN6β细胞24小时后，与BMMSC共培养(直接接触，BMMSC对β细胞有杀伤作用)。
图9为探讨IL-6在STZ诱导的糖尿病小鼠的PMSC介导的治疗中发挥关键作用。(A,B)与野生型PMSC植入相比，IL-6基因敲除的PMSC的肾囊膜下植入未能改善1型糖尿病表型。植入后1个月使用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠葡萄糖清除能力，n＝3。使用尾静脉血液样本随时间测量指定组小鼠的血糖水平。(C)肾囊膜下植入的IL-6基因敲除的PMSCs局部再生了腺泡结构，可检测到胞内散在分布嗜碱性染色的腺泡样细胞。(D，E)组织学和免疫染色分析进一步证实，IL-6基因敲除的PMSC植入不能挽救STZ诱导的糖尿病小鼠胰腺组织中受损的胰岛，胰岛素阳性细胞的数量。
图10为PMSC表达高水平的IL-6以保护β细胞。IL-6敲除的PMSCs在体外保护MIN6β细胞免受STZ诱导的细胞凋亡的能力下降。在5-10mg/ml STZ处理24小时后，将MIN6β细胞与野生型或IL-6敲除PMSCs共培养。通过使用流式细胞术用annexin V和7AAD标记来测量MIN6细胞的凋亡。
图11为PMSCs的肾囊膜下植入提高了IL-6的水平。(A)PMSCs的肾囊膜下植入表达高水平的IL-6。代表性的免疫荧光染色显示野生型PMSCs植入组中具有强烈的IL-6免疫染色。在IL-6敲除的PMSCs植入组中没有观察到IL-6染色。(B)ELISA分析显示，PMSCs植入后2周和4周血清IL-6水平升高。虚线表示对照组小鼠的基础血清IL-6水平。(C)植入IL-6敲除的PMSCs未能抑制IL-17的水平。其中，在植入后4周，采用ELISA方法对原位胰腺中的IL-10，IL-17，TGF-β和IL-6进行分析。(D)植入IL-6敲除的PMSCs未能抑制1型糖尿病小鼠的系统中Th17细胞的激活。通过流式细胞仪分析显示1型糖尿病小鼠脾脏CD4+IL-17+Th17细胞和CD4+T细胞中的CD25+Foxp3+Treg细胞。所有结果代表至少三个独立实验中产生的数据。
图12为IL-6敲除的小鼠表现出对PMSCs植入疗法的抵抗力。(A-B)IL-6敲除小鼠STZ诱导的1型糖尿病的严重程度增加，并对PMSC植入疗法产生抗药性。(C，D)1型糖尿病IL-6敲除小鼠接受PMSCs的肾囊膜下植入后的宿主原位胰腺/胰岛的代表性H&E图像。所有结果均代表在至少三个独立实验中产生的数据。误差线＝平均值±SD。使用单向方差分析和Bonferroni校正或独立的非配对两尾学生t检验分析数据。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
“土壤挽救种子”策略：尽管胰腺外分泌腺来源的间充质干细胞(PMSC)表达了多种胰腺祖细胞标记，包括PDX1，Nkx6.1和Ngn3，但当植入肾囊时，它们主要再生胰腺外分泌腺(土壤)，再生组织中仅有极少量的胰岛素分泌细胞(种子)。这些异位PMSC植入物不产生胰岛素，但能够通过拯救受体受损的β细胞来改善1型糖尿病表型。从机理上讲，我们发现PMSCs通过表达高水平的IL-6来抑制IL-17，从而改善胰腺免疫微环境(土壤)，进而挽救受损的胰岛β细胞(种子)。此外，我们发现与静脉内注射PMSCs相比，PMSCs的肾囊植入在STZ诱导的小鼠中显示出显著且持续的治疗效果。PMSC介导的外分泌胰腺再生可挽救1型糖尿病小鼠胰岛β细胞的受损。这项研究揭示了外分泌胰腺再生在保护β细胞方面的重要作用，并提供了1型糖尿病治疗的新的“土壤拯救种子”的策略。
“STZ”表示链脲佐菌素(streptozotocin)。
所述“胰蛋白酶”和“胰脂肪酶”为胰腺外分泌腺特异性标志物，所述“胰岛素”为胰岛β细胞标志物。
所述腺泡和导管细胞标志物如淀粉酶、胰蛋白酶、胰脂酶和CK19等。
以下对应实验结果图的实验方法如未特别说明都是按照商品化试剂盒或现有技术的实验标准流程进行，相关的实验方法举例如下所述，以下实施例中涉及到的实验技术方法如未特别说明，都是通用的。
实验动物：雌性C57BL/6J，NU/j，NOD/SCID，IL-6基因敲除，小鼠用于本实验。在所有实验中均使用具有相同背景的年龄匹配的8至10周龄的雌性小鼠。所有动物实验均根据机构批准的用于动物研究的方案进行(中山大学SYSU-IACUC#2020000122和宾夕法尼亚大学IACUC#805478)。在MSC植入后按照各实验所显示的时间对小鼠实施安乐死。为了破坏内源性胰岛细胞诱导1型糖尿病，使用200mg/kg体重的单次高剂量或50mg/kg连续五天底剂量的腹膜内(ip)注射链脲佐菌素(STZ)，用0.01M柠檬酸钠在pH4.5下溶解STZ，注射于8周大小鼠。使用OptiumXceed血糖仪，取小鼠尾静脉血液样本测量循环葡萄糖水平。连续两次测量的非空腹血糖≥300mg/dl被认为表明是显著的糖尿病特征(77)。为了进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)，将动物禁食5小时，然后腹膜内注射。注射20％葡萄糖溶液(每公斤体重2克葡萄糖)。注射后0、30、60、90和120分钟测量血糖。
流式细胞术：
对于CD4、Foxp3染色，收获脾细胞并在冰上用抗CD4-PerCP和CD25-APC抗体染色30分钟。接下来，使用Foxp3染色缓冲液试剂盒(eBioscience，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)用抗Foxp3-PE抗体对细胞染色，以进行细胞固定和通透化。对于IL-17A等细胞因子染色，用500ng/mlPMA和500ng/ml离子霉素(Peprotech，RockyHill，NJ，美国)处理脾细胞5小时，并加入布雷菲德菌素A(BFA；5μg/ml，Peprotech)，在培养的最后4小时内。随后，将细胞用抗CD4-PerCP抗体染色，然后使用染色缓冲液试剂盒用抗IL17APE抗体染色。所有抗体均购自BioLegend(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。用FACScalibur流式细胞仪(BD Bioscience，SanJose，CA，USA)分析样品。
组织学：
将解剖的胰腺和肾脏样品固定在4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)中，然后石蜡包埋。石蜡切片(5μm)用苏木精和曙红(H&E)染色。为了进行免疫组织化学染色，将石蜡包埋的切片用5％BSA封闭，与针对IL-6的一抗在4℃下孵育过夜，然后使用VECTASTAIN UNIVERSALEliteABC试剂盒以及ImmPACT VIP过氧化物酶底物试剂盒(VECTOR)，按照制造商的说明进行染色。
免疫荧光：
为了制备冷冻切片样品，将切开的胰腺在4℃的4％PFA中固定4个小时，用PBS洗涤3次，然后包埋在最佳切割温度(OCT)化合物中。将组织切片与一抗在4℃孵育过夜，然后在PBST(PBS+0.1％Triton X-100)中洗涤，再与二抗和DAPI在室温下孵育2小时，然后洗涤并固定以进行共聚焦成像。为了进行全壁染色，将胰岛在4℃的4％PFA中固定1小时，用PBS洗涤3次，然后在室温下用全壁封闭缓冲液封闭1小时。封闭缓冲液在PBST中含有10％FBS。将一抗稀释于封闭缓冲液中，并在4℃下孵育过夜，然后用PBST洗涤3次，然后将二抗和DAPI在4℃下孵育过夜。使用激光共聚焦显微镜拍摄照片。
细胞因子阵列分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
根据制造商的说明，使用购自R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)的ELISA试剂盒测量了小鼠的血清及组织样品中的各细胞因子及C-peptide水平。
细胞因子阵列分析。根据制造商的说明，使用Mouse Cytokine Array Panel AArray Kit(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，取等体积的BMMSC和PMSC进行分析。使用ImageJ软件对结果进行扫描和分析，以计算印迹强度。
蛋白质印迹(Western blotting):
将细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche，巴塞尔，瑞士)蛋白提取试剂(Thermo，Waltham，MA，美国)中裂解，并使用蛋白浓度测定法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，美国加利福尼亚州)测定蛋白浓度。使用SDS-PAGE胶垂直电泳分离20μg蛋白质，并转印到0.2μm硝酸纤维素膜上(Millipore，Burlington，MA，美国)。将膜用5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20封闭1小时，然后根据制造商的说明，将第一抗体在封闭溶液中稀释过夜。然后将膜在封闭液中以1：10,000稀释的HRP偶联二抗(SantaCruz)中于室温孵育1小时。使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo)和Bio-Rad ChemiDocTM成像仪(Hercules，CA，美国)检测蛋白表达。
实时定量PCR(Real-Time PCR.)：
使用TRIzol试剂盒(Life Technologies，Invitrogen)从不同的细胞中分离提取总RNA。RNA样品(1μg)在逆转录系统(QIAGEN)中逆转录。PCR实验所使用的引物为：小鼠IL-6上游引物GGCGGATCGGATGTTGTGAT，下游引物GGACCCCAGACAATCGGTTG。PCR条件为：95℃5分钟，(95℃ 10秒，50℃45秒)×40和90℃ 10秒。
体外CD4+IL-17A+Th17细胞诱导：
根据制造商的说明，使用BDIMagTM抗小鼠CD4 Particles-DM(BD Bioscience)从脾细胞中分离出CD4+T淋巴细胞。用结合抗CD3e抗体的培养板(克隆145-2C11，5μg/ml，BioLegend)和可溶性抗CD28抗体(克隆37.51，5μg/ml，BioLegend)预刺激CD4+T细胞2天。对于Th17细胞(T辅助细胞17)的诱导，将活化的T细胞(1×106)加入重组人TGF-β1(2μng/ml；R&DSystems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国)的0.2×106MSCs小鼠IL-6(25μng/ml；Peprotech)，重组小鼠IL-23(20μng/ml；Peprotech)和重组小鼠IL-β1(20ng/ml；Peprotech)(89)。3天后，收集悬浮液中的细胞用于IL-17A抗体染色，并用FACScalibur(BDBioscience)分析。
实施例1胰腺间充质干细胞(PMSCs)的分离培养与鉴定
分离培养的步骤包括：
将小鼠的胰腺组织轻轻地分离，切碎，并用含有2mg/mLI型胶原酶(WorthingtonBiochemical，Lakewood，NJ，美国)和4mg/mL DispaseII(Roche Diagnostics，Basel，瑞士)的磷酸盐缓冲液(PBS)在37℃放置1小时消化。使消化所得细胞悬液通过70μm滤器(BDBiosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)获得胰腺的单细胞悬液。将所有核细胞(ANC)接种到100mm培养皿中，该完全培养基含有α-MEM(Invitrogen)，并添加了20％FBS，2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)，55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)，100U mL-1青霉素和100μgmL-1链霉素(Invitrogen)，然后在37℃和5％CO2下孵育48小时。用PBS洗涤培养物两次以去除非贴壁细胞。将贴壁的细胞在相同条件下在上述完全培养基中再培养12天。
进一步对PMSCs进行鉴定，并证明PMSCs具有自我更新的能力(通过CFU-F评估)和高增殖率(通过Brdu染色评估)：
(1)流式细胞仪分析证实这些胰腺组织来源的CD105+PMSCs共表达β细胞标志物胰岛素(insulin)、腺泡细胞标记淀粉酶(acinar cell marker amylase)、导管细胞标记物(pancreatic progenitor cell markers)CK19、胰腺祖细胞标志物(pancreaticprogenitor cell markers)Ngn 3、Ptf1a、Hnf1β、PDX1和Nkx6.1(图1A)。另外，流式细胞仪分析证实这些胰腺组织来源MSCs阳性表达间充质干细胞表面标记物CD44，CD105，CD73和Sca-1，但不表达血液细胞标记物CD34和CD45(图1B)。
(2)这些MSCs还显示出了多能分化的能力，包括成骨，成脂(图1C，1D)，成骨诱导及染色步骤如下：
1)用常规培养基培养直至细胞融合；2)每周2-3次更换成骨培养基，持续4周或更长时间；3)当观察到矿化的结节时，用茜素红S染色；4)蛋白质收集时间为诱导后1周；5)将1g茜素红S溶于100ml蒸馏水中；6)通过0.22um过滤器过滤并在室温下储存；用PBS清洗培养皿2次；7)在室温下用60％异丙醇固定1分钟；8)用蒸馏水补水2-3分钟；9)在室温下用染色溶液染色3分钟；10)用蒸馏水洗培养皿数次；11)干燥，并在显微镜下观察，使用ImageJ软件计算成骨阳性区域。
其中，成脂诱导和染色同样按照商品化试剂盒的实验标准流程进行。(3)通过CFU-F评估的自我更新能力(图1E左侧)和使用Brdu染色评估细胞增殖率(图1E右侧)。其中，CFU-F评估的实验方法如下：1)将60毫米培养板接种从胰腺中分离出的5×103个单个核细胞(ANC)；
2)14天后，将培养板用0.1％甲苯胺蓝和2％多聚甲醛溶液的混合物染色；
3)将含有＞50个细胞的克隆计数为单个克隆簇，进行CFU-F计数。
BrdU标记法的步骤如下：1)细胞以1×105/mL细胞数接种于12孔板中(内放置一盖玻片)，培养1天，用含0.4％FBS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期；
2)终止细胞培养前，加入BrdU(终浓度为30μg/L)，37℃，孵育40min；
3)弃培养液，玻片用PBS洗涤3次；
4)甲醇/醋酸固定10min；
5)经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。
5％BSA封闭；
6)变性液5min变性核酸；
7)冰浴冷却后PBS洗涤，加一抗即抗小鼠BrdU单抗；
8)荧光二抗染色，在显微镜下随机计数5个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算阳性率。
从检测结果可以看出，相对于BMMSC而言，PMSC具有更强的CFU-F的形成和增殖能力，更强的成骨分化能力以及较低的成脂分化能力。与BMMSC相似，PMSC表达MSC阳性表面标记物Sca-1，CD105，CD44，CD73不表达血液细胞表面标记物CD34和CD45。
免疫荧光染色显示胰腺外分泌腺来源的MSC(PMSCs)表达成熟的胰岛特异性标记，包括胰岛素(insulin)，以及成熟的外分泌腺标记物淀粉酶(amylase)和导管细胞标记细胞角蛋白19(CK19)(图1F)。此外，通过流式细胞术分析(图1A、1G)、免疫荧光染色(S1B)，PMSCs表达了胰腺祖细胞标记物PDX1，Nkx6.1，以及内分泌分化标记物Ngn3，腺泡分化标记物Ptf1a和导管分化标记物Hnf1β。有趣的是，流式细胞术检测显示，高达71.11％的CD105+PMSC表达外分泌标记淀粉酶，而只有11.52％的CD105+PMSC表达胰岛素(图1A)。这些数据显示PMSC具有较低的胰岛素阳性细胞比例和较高的淀粉酶阳性细胞比例，提示PMSCs同时表达成熟的胰腺组织以及分化的细胞和祖细胞的标志物，但是它们表现出外分泌显性的表型。
PMSCs具有一般的MSC特性，包括MSC表面分子的表达以及自我更新和多能分化的能力。我们检测结果显示，与骨髓MSC(BMMSC)相比，PMSC具有克隆形成(CFU-F)能力，并具有较高的增殖率(图1E)。流式细胞仪分析证实，PMSC阳性表达间充质干细胞表面标记物CD44，CD73，CD105和Sca-1，阴性表达血液细胞标记物CD34和CD45(图1B)。PMSCs还显示出多能分化的能力，包括成骨，成脂分化(图1C、1D)。
实施例2胰腺间充质干细胞肾囊膜下植入小鼠体内
于10cm细胞培养皿中培养、扩增胰腺间充质干细胞，常规换液至细胞接触融合，弃掉培养液，消化成单个细胞，收集约4×106个间充质细胞；用约20μL 1×PBS溶液混悬细胞，将其置于冰上待用；或将上述PBS细胞混悬液与小块可吸收明胶海绵混合，将混合物将置于冰上待用。也可选择于10cm细胞培养皿中培养、扩增胰腺间充质干细胞，常规换液至细胞接触融合后继续培养细胞约3-7天周左右，使其细胞基质变厚，用钝tip头或其他方式从培养皿中整体剥离贴壁的PMSC，将其转移至新的24孔板继续培养，1-3天后形成PMSC小球，将PMSC小球置于冰上待用。(几种方式植入肾囊膜下后再生结果并无明显差异。)
将小鼠麻醉后，背部皮肤去毛、消毒备皮。手术剪在皮肤上形成2厘米左右的纵向切口，暴露肾脏。用显微手术剪或显微镊的尖端于肾囊膜下开口，并钝性分离肾囊膜与膜下肾组织，为植入物制作一个口袋。将PMSC+明胶海绵混合物或PMSC小球置于肾囊膜下袋中，或将PMSC细胞混悬液注射入肾囊膜下。使用电刀封闭肾囊膜创口，将肾脏放回原位，缝合手术创口。8周后收集移植物进行相应检测。
实施例3胰腺干细胞异位再生外分泌胰腺
当将PMSCs植入野生型或免疫缺陷小鼠的肾囊膜下时，其在植入后8周即可异位再生无内分泌胰岛的胰腺外分泌腺组织(图2A-D)。与正常的胰腺外分泌腺相似，再生的外分泌胰腺由典型的腺泡和导管组成(图2C-E，)。再生的腺泡显示出外分泌胰腺细胞具有强嗜碱性染色特性，并带有嗜酸性的分泌颗粒，并且导管有上皮样衬里(图2C-E)。免疫荧光染色证实，再生的异位胰腺表达外分泌标志物淀粉酶，胰蛋白酶和胰脂肪酶，以及导管标志物CK19(图2E)。大约80％比例的PMSC植入物表现出外分泌胰腺结构，只有12.5％比例的PMSC植入物含有少量散布的产生胰岛素的β细胞(图2A-2F)。在植入物中未检测到其他种类的内分泌细胞，例如产生胰高血糖素的α细胞，产生生长抑素的δ细胞和产生胰多肽的PP细胞(图2A、2E)。这些数据表明大多数PMSC再生植入物形成外分泌胰腺，而没有大量胰岛素产生。
实施例4 PMSC介导的肾囊膜下胰腺再生改善了STZ诱导的I型糖尿病
为了检测PMSC再生的异位外分泌胰腺对糖尿病的治疗效果，我们首先使用多次低剂量链脲佐菌素(STZ)注射液在野生型小鼠中诱导了1型糖尿病。我们比较了PMSC和BMMSC植入肾囊膜下的效果，并发现PMSC植入而非BMMSC植入可显著降低1型糖尿病小鼠的血糖水平(图3A)。此外，与BMMSC组相比，PMSC植入挽救了葡萄糖的清除能力，并提高了血清C肽和胰岛素的水平(图3B-D)。在STZ诱导的糖尿病小鼠肾囊膜下PMSC植入组可检测到再生的外分泌腺泡细胞和腺泡(图3E)。免疫荧光染色证实，PMSC再生的异位胰腺细胞表达外分泌标记淀粉酶(图3E)。为了进一步确认PMSC植入的治疗潜力，我们使用单次大剂量STZ注射诱导了免疫缺陷小鼠的1型糖尿病。与上述结果一致，我们发现植入PMSCs而非BMMSCs可以显著提高1型糖尿病小鼠的存活率(图3F)。PMSC植入后，糖尿病小鼠的寿命从40天延长到120天(图3F，图3G)。PMSC组在植入后60天血糖水平显著降低，而BMMSC组则没有降低(图3G，图3H)。此外，与BMMSC组相比，PMSC植入挽救了葡萄糖清除能力(图3H)。这些数据表明PMSC植入能够拯救STZ诱导的1型糖尿病表型，这可能不依赖于胰岛素的产生。
为了进一步证实PMSC介导的外分泌胰腺再生可改善糖尿病的表型，我们比较了PMSCs肾囊膜下植入与系统回输(小鼠尾静脉注射)PMSC的功效。在PMSC植入组中观察到了肾囊膜下再生的异位外分泌胰腺，而在全身输注组中则未观察到(图3I)。PMSC给药后7天，PMSC肾囊膜下植入组和系统回输组的血糖水平均降低(图3J)。但是，与接受系统回输的PMSC的组相比，PMSC肾囊膜下植入组在治疗后一个月显示出明显的葡萄糖清除能力恢复和血清C肽水平升高(图3K，L)。有趣的是，PMSC给药后40天，肾囊膜下植入组小鼠保持了血糖改善的效果，但系统回输组未能维持血糖水平的降低(图3M)。我们的数据表明，与静脉输注相比，PMSC肾囊膜下植入介导的异位外分泌胰腺再生在STZ诱导的1型糖尿病小鼠中具有显著持续的治疗作用。
实施例5 PMSCs的肾囊膜下植入可挽救1型糖尿病小鼠受损的原位胰腺/胰岛
为了探索PMSC介导的异位外分泌胰腺再生如何拯救糖尿病表型，我们检测了STZ诱导的糖尿病小鼠的原位胰腺。我们发现，通过H&E染色评估，肾囊膜下PMSC植入显著改善了小鼠原位胰腺组织中胰岛的组织学结构(图4A)。免疫染色显示，胰岛素阳性β细胞以及Ki67和胰岛素双重阳性增殖β细胞的数量均显著增加(图4B，4C)。同样，淀粉酶，胰蛋白酶和胰脂肪酶阳性腺泡细胞也显著增加(图4B，图5A)。从实验结果中看出，是PMSC而非BMMSC的植入挽救了STZ诱导的胰岛β细胞和腺泡细胞的损伤(图4A，4B，4C)。PMSCs经过系统注射，未能显著改善胰岛组织中的胰岛大小，胰岛素阳性细胞数量以及Ki67/胰岛素双阳性增殖β细胞(图4D-F，图5B)。这些数据表明，PMSCs的肾囊膜下植入可以挽救STZ诱导的原发胰腺/胰岛组织损伤，并证明“土壤挽救种子”策略用于1型糖尿病治疗的可行性。
实施例6 PMSC表达升高水平的IL-6以保护β细胞
通过细胞因子阵列分析，ELISA和PCR，Western印迹检测(图6A-D)。我们发现与BMMSCs相比，PMSC显著表达IL-6(一种能够充当促炎或抗炎细胞因子的白介素)(Scheller,J.,Chalaris,A.,Schmidt-Arras,D.&Rose-John,S.The pro-and anti-inflammatoryproperties of the cytokine interleukin-6.Biochim Biophys Acta 1813,878-888,doi:10.1016/j.bbamcr.2011.01.034(2011).)。免疫染色和流式细胞仪分析证实，大多数CD105阳性的PMSC表达IL-6(图7，图8A)。免疫染色分析显示IL-6在胰腺胰岛和外分泌胰腺中均有表达(图8B)。此外，我们发现PMSCs，而不是BMMSCs，可以在体外共培养系统中保护胰腺β细胞系MIN6免受STZ诱导的细胞凋亡(图8C，8D)。
我们将IL-6敲除小鼠来源的PMSC用于肾囊膜下植入治疗，发现与野生型PMSC植入组相比，IL-6敲除小鼠来源的PMSC未能改善STZ诱导的糖尿病表型(图9A-9C)。肾囊膜下植入IL-6基因敲除的PMSCs部分地再生了腺泡结构，可检测到嗜碱性染色的腺泡样细胞，但是其组织学结构与正常腺泡有差别，且荧光染色显示淀粉酶染色散在，不似PMSC再生组织那么均一(图9C)。组织学和免疫染色分析进一步证实，在STZ诱导的糖尿病小鼠中，IL-6基因敲除的PMSC植入未能挽救受损的胰岛，胰岛素阳性细胞和胰腺组织(图9D-9E)。另外，IL-6基因敲除的PMSCs在体外用STZ处理后，抗MIN6β细胞凋亡的能力显著降低(图10)。
实施例7 PMSCs的肾囊膜下植入提高IL-6的水平
移植后2周，在STZ诱导的糖尿病小鼠肾囊膜下移植物中，在野生型PMSC移植组观察到强烈的IL-6染色，但在IL-6基因敲除PMSC移植组中未观察到IL-6表达(图11A)。有趣的是，如通过ELISA所示，在PMSC植入后2和4周时，肾囊膜下植入野生型而非IL-6基因敲除PMSC升高了血清和原位胰腺中IL-6的水平(图11B)，表明异位植入肾囊膜下的PMSCs上调了胰腺和血清IL-6的水平。接下来，我们发现野生型而非IL-6基因敲除的PMSC植入抑制IL-17的水平(图12C)。相应地，IL-6基因敲除的PMSC植入未能挽救STZ诱导的糖尿病小鼠Th17/Treg细胞水平的改变(图11D)。这些数据表明，IL-6是通过抑制IL-17来改善胰腺免疫微环境”这一通路所必需的。
实施例8 IL-6基因敲除小鼠显示出对PMSC植入疗法的抗性
我们发现IL-6基因敲除小鼠在STZ诱导下显示出严重的糖尿病表型，而异位PMSC移植未能挽救IL-基因敲除小鼠的糖尿病表型(图12A-D)。H&E染色显示，来自IL-6敲除小鼠的胰腺组织显示出与野生型小鼠相似的结构，但肾囊PMSC植入未能挽救STZ诱导的敲除小鼠胰岛β细胞的破坏。这些发现证实了IL-6在保护β细胞中的作用。
Claims (10)
1.来源于胰腺外分泌腺的间充质干细胞或胰腺外分泌腺组织在制备治疗/预防糖尿病药物当中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胰腺外分泌腺组织由胰腺外分泌腺的间充质干细胞生成；
优选地，所述的胰腺外分泌腺的间充质干细胞药物为注射制剂；
更优选地，为肾囊膜下注射制剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
4.一种用于治疗治疗/预防糖尿病的系统，其特征在于，包含胰腺外分泌腺的间充质干细胞，以及植入装置；优选地，所述的植入装置用于将胰腺外分泌腺的间充质干细胞植入患者体内定点部位；优选地，所述的介入装置为穿刺器；优选地，所述的定点部位包括肾囊膜下、皮下、或肠系膜；
优选地，所述的系统还包含超声装置或内窥镜装置；
所述超声装置或内窥镜装置用于引导所述穿刺器的定位。
5.一种获得胰腺外分泌腺组织的方法，其特征在于，所述的胰腺外分腺的组织通过植入间充质干细胞而形成；
或优选地，所述植入包括肾囊膜下植入、皮下植入、肠系膜植入；
更优选地，所述植入为肾囊膜下植入；
优选地所述异位植入优选为非活体的组织模型植入。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括胰腺间充质干细胞、骨髓间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞为胰腺间充质干细胞；
或优选地，所述的间充质干细胞为游离的间充质干细胞；
或优选地，所述的间充质干细胞无需处理直接植入。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用培养液培养间充质干细胞；
(2)去掉步骤(1)中的间充质干细胞的培养液，收集间充质干细胞；
(3)将步骤(2)中收集到的间充质干细胞用PBS或生理盐水混悬后，植入动物肾囊膜内或皮下，从而获得胰腺外分泌组织；
优选地，步骤(1)中的培养液的成分包括FBS，谷氨酰胺，2-巯基乙醇和α-MEM；
更为优选地，步骤(1)中，所述间充质干细胞培养至P1-P3代。
8.一种胰腺外分泌腺的组织，其特征在于，所述的胰腺外分泌腺的组织通过权利要求5-7任一所述的方法获得。
9.权利要求8所述的胰腺外分泌腺的组织在胰腺相关疾病的治疗药物的发现筛选、或胰腺相关疾病治疗药物的毒性测定、或胰腺胚胎学、或胰腺细胞谱系和分化途径的研究、或基因表达研究、或参与胰腺损伤和修复的机制研究、或胰腺的炎症性疾病研究、或治病机制研究中的体外用途。
10.权利要求8所述的胰腺外分泌腺的组织在重组基因表达中的应用。
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| CN202111641869.0A Pending CN114762697A (zh) | 2020-12-30 | 2021-12-29 | 用于治疗糖尿病的药物及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114762697A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103194424A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-10 | 于涛 | 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法 |
| KR20180106165A (ko) * | 2017-03-17 | 2018-10-01 | 울산대학교 산학협력단 | 사람 췌장 유래 중간엽줄기세포주 및 이의 제조방법 |
-
2021
- 2021-12-29 CN CN202111641869.0A patent/CN114762697A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103194424A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-10 | 于涛 | 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法 |
| KR20180106165A (ko) * | 2017-03-17 | 2018-10-01 | 울산대학교 산학협력단 | 사람 췌장 유래 중간엽줄기세포주 및 이의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VALERIA SORDI等: "Mesenchymal Cells Appearing in Pancreatic Tissue Culture Are Bone Marrow-Derived Stem Cells With the Capacity to Improve Transplanted Islet Function", STEM CELLS, vol. 28, no. 1, pages 218 - 2 * |
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