JP2005533746A - ランゲルハンス島の幹細胞および真性糖尿病の処置におけるその使用 - Google Patents

ランゲルハンス島の幹細胞および真性糖尿病の処置におけるその使用 Download PDF

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Abstract

種々の膵島細胞（インスリン産生性β細胞を含む）ならびに肝細胞に分化し得る新規に同定された幹細胞を用いて、Ｉ型インスリン依存型真性糖尿病および他の状態を治療するための方法および組成物が記載される。ネスチンおよびＡＢＣＧ２は、膵臓幹細胞に対する分子マーカーとして同定されているが、一方サイトケラチン−１９は、異なるクラスの島の導管細胞に対するマーカーとして役立つ。それによってネスチンおよび／またはＡＢＣＧ２ポジティブな幹細胞は、膵島から単離および培養されて、さらなる幹細胞または偽島様構造を獲得し得る方法が記載される。膵臓幹細胞のエキソビボ分化についての方法が開示される。それによって膵臓幹細胞は単離され、拡張され、そしてそれを必要とする患者に同種異系、同系または異種のいずれかとして移植されて、失われたかまたは損傷を受けたインスリン分泌性細胞または他の細胞に対する代替を提供し得る方法が記載される。

Description

（優先権）
本出願は、２００１年９月２６日に出願された米国出願番号０９／９６３，８７５号、２００２年４月１１日に出願された米国出願番号１０／１２０，６８７号、および２００２年５月２日に出願された米国出願番号１０／１３６，８９１号に対する優先権を主張する。
（発明の技術分野）
本発明は、幹細胞およびその分化に関する。特に、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞およびネスチンポジティブな肝臓幹細胞、および幹細胞または前駆細胞からのそれらの分化、ならびに移植における膵臓の幹細胞、前駆細胞および分化したβ細胞、またはネスチンポジティブな肝臓の幹細胞または前駆細胞の使用に関する。
（発明の背景）
本発明は、少なくとも部分的に国立衛生研究所によって与えられた米国政府基金、助成金番号ＤＫ３０４５７、ＤＫ３０８３４、ＤＫ５５３６５、ＤＫ６０１２５を用いてもたらされ、従って米国政府は、本発明において特定の権利を保持し得る。
胚発生および成熟哺乳動物の両方の間における膵島細胞の起源は、集中的な研究にもかかわらず不明なままである。特定の導管上皮細胞は、分化または分化転換のいずれかを生じ、β細胞および成熟した島に見出される他の細胞型を形成し得る（Ｂｏｕｗｅｎｓ、１９９８）。単離された島由来の導管細胞は、培養物において増殖し得、そして動物に移植される場合に機能的なβ細胞に分化し得る（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓら、１９９７）。
ｅｘｅｎｄｉｎ−４（長時間作用型ＧＬＰ−１アゴニスト）が、ラットに投与される場合に、導管前駆細胞からのβ細胞の分化（新生）およびβ細胞の増殖の両方を刺激することが実証されている。２型糖尿病の部分膵切除ラットモデルにおいて、膵切除後１０日間のｅｘｅｎｄｉｎ−４の毎日の投与は、糖尿病の発達を減じた。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、β細胞の新生および増殖によって、膵臓の再生およびβ細胞集団の拡張を刺激することがまた実証されている（Ｘｕら、１９９９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２２７０〜２２７６）。
Ｒａｍｉｙａらは、成体の前糖尿病性ＮＯＤマウスの膵管から単離された多能性幹細胞からインビトロで作製された島が分化して、糖尿病性ＮＯＤマウスに被包を伴うかまたは伴わずに移植された後にインスリン依存型糖尿病を逆転し得るグルコース反応性の島を形成することを実証した（Ｒａｍｉｙａら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、６：２７８〜２８２）。
腸管によって産生されるインスリン指向性ホルモン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、膵臓の発生およびインスリン遺伝子の転写調節に重大なホメオドメイン転写因子ＩＤＸ−１の膵臓発現を増強する。付随して、糖尿病性マウスに投与されるＧＬＰ−１は、インスリン分泌を刺激し、そしてその血糖レベルを効果的に低下させる。ＧＬＰ−１はまた、β細胞の新生および島のサイズを増強する（Ｓｔｏｆｆｅｒｓら、２０００、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４９：７４１〜７４８）。
Ｆｅｒｂｅｒらは、マウス肝臓へのＰＤＸ−１（また、ＩＤＸ−１として公知である）導入遺伝子のアデノウイルス媒介性のインビボ移植が、肝細胞部分集団のβ細胞表現型への超転換（ｔｒａｎｓｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）をもたらすことを実証した。ＰＤＸ−１アデノウイルスベクターを用いたマウスの静脈内注入後に、肝細胞の６０％までがＰＤＸ−１を合成したことが実証されている。肝細胞の６０％がアデノウイルスに感染し、そしてＰＤＸ−１を発現するようになったが、これらの細胞の５〜８％の部分集合のみが、インスリン発現性β細胞に変化した。免疫反応性のインスリン濃度は、処置マウスの肝臓および血清において増大した。ＰＤＸ−１で処置されたマウスは、ストレプトゾトシン誘導性の糖尿病を乗り切り、そして血糖を標準的にさえし得る（Ｆｅｒｂｅｒら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、６：５６８〜５７２）。
単離された島から得られた導管細胞培養物は、インスリン分泌性細胞を生じさせ得る細胞を含むようであるが、これらの細胞が真の幹細胞を表すか、または単に分化転換を受ける導管上皮細胞を表すかどうかは不確かなままである。たとえこのような調製物が本物の幹細胞を含んだとしても、どの画分が幹細胞を表し、そしてどの汚染細胞型が存在し得るかは未知である。当該分野において、膵臓組織から特定の細胞型を単離する必要性が存在し、この細胞型は、分子マーカーを用いて幹細胞として特徴付けられ、そして多能性かつ長期間増殖することが実証される。
神経組織およびグリア組織に分化し得る多能性の幹細胞は、脳において同定されている。神経幹細胞は、特にネスチン（中間径フィラメントタンパク質）を発現する（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０；Ｄａｈｌｓｔｒａｎｄら、１９９２）。ネスチンは、発生中のラット胚の神経管においてＥ１１日に発現され、大脳皮質においてＥ１６日に最大レベルの発現に到達し、そして成体皮質において減少し、上衣細胞の集団に限定されるようになる（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０）。発生中の神経細胞および膵島細胞は、一般的な細胞性マーカーによって特徴付けられる表現型の類似性を示す。
本発明は、神経幹細胞および肝臓幹細胞に類似し、そして島のα細胞（グルカゴン）およびβ細胞（インスリン）に分化する膵島幹／前駆細胞（ＩＰＣ）の集団に関する。本発明はまた、ネスチンポジティブな肝細胞に関する。本発明に従ったＩＰＣは、免疫学的にサイレント／免疫特権（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）であり、そして自己として移植レシピエントによって認識される。本発明に従ったＩＰＣは、同種異系障壁および異種障壁を越えた移植について使用され得る。
当該分野において、同種異系障壁および異種障壁を越えて幹細胞を移植する方法に対する必要性が存在する。
島、ネスチンポジティブな膵臓幹細胞またはネスチンポジティブな肝臓幹細胞が、同種異系障壁または異種障壁を越えてレシピエントに移植され、そして移植片拒絶が生じないＩ型真性糖尿病を治療する方法に対する必要性が当該分野においてまた存在する。
島、ネスチンポジティブな膵臓幹細胞またはネスチンポジティブな肝臓幹細胞が、同種異系障壁または異種障壁を越えてレシピエントに移植され、そして移植片拒絶が生じない哺乳動物への移植の方法に対する必要性が当該分野においてまた存在する。
（発明の要旨）
真性糖尿病および他の障害の処置における使用について、哺乳動物の膵臓幹細胞または肝臓幹細胞を提供することが本発明の目的である。膵臓幹細胞を同定し、局在化しそして単離するための方法を提供することがまた本発明の目的である。膵臓幹細胞を分化させ、インスリンおよび他のホルモンを産生する細胞を獲得するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。哺乳動物の膵臓幹細胞または肝臓幹細胞を利用する哺乳動物への移植のための方法を提供することがまた本発明の目的である。本発明のこれらの目的および他の目的は、以下に記載される１以上の実施態様によって提供される。
本発明の一実施態様は、真性糖尿病を有する患者を治療する方法を提供する態様である。ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離される。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離される。別の実施態様において、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３および／またはＳＳＴ−Ｒ４に対してポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離される。この幹細胞は患者に移植され、ここでこの幹細胞は、インスリン産生性細胞に分化する。
別の実施態様は、糖尿病を有する患者を治療する別の方法を提供する態様である。ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そしてエキソビボで拡張されて前駆細胞を産生する。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そしてエキソビボで拡張されて前駆細胞を産生する。この前駆細胞は患者に移植され、ここでこの前駆細胞は、インスリン産生性β細胞に分化する。別の実施態様は、糖尿病患者を治療するなお別の方法を提供する。ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そして拡張されて前駆細胞を産生する。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そして拡張されて前駆細胞を産生する。この前駆細胞は培養物中で分化して、患者に移植される偽島様集合体を形成する。
別の実施態様は、真性糖尿病を有する患者を治療する別の方法を提供する態様である。ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そしてエキソビボで培養されて前駆細胞を産生する。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そしてエキソビボで培養されて前駆細胞を産生する。この前駆細胞は患者に移植され、ここでこの前駆細胞は、インスリン産生性β細胞に分化する。
これらの実施態様において、この患者はまた、自ら膵島組織のドナーとなり得、細胞の同系移植片細胞または分化した組織を提供する。
別の好ましい実施態様において、移植ステップの前に、この幹細胞は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン（betacellulin）、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子でエキソビボで処理される。
別の好ましい実施態様は、この移植ステップは、内視鏡的逆行性注入または膵動脈への注入によって行われる態様である。
別の好ましい実施態様は、真性糖尿病を有する患者を治療する方法は、免疫抑制剤でこの患者を治療するステップをさらに含む態様である。
別の好ましい実施態様は、この免疫抑制剤は、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡＤ６５抗体からなる群より選択される態様である。
別の実施態様は、幹細胞を膵臓のランゲルハンス島から単離する方法を提供する。膵島がドナーから取り出され、そしてそこから細胞が培養される態様である。ネスチンポジティブな幹細胞クローンが、この培養物から選択される。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞のクローンが、この培養物から選択される。必要に応じて、この島は、非島細胞と結合するコンカナバリンＡでコーティングされた容器中での培養によって非島細胞を最初に除去する。
好ましい実施態様において、幹細胞を単離する方法は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つの因子での処理によって、このクローンを拡張するさらなるステップをさらに含む。
さらなる実施態様は、ネスチンポジティブな膵臓幹細胞の膵臓前駆細胞への分化を誘導する方法を提供する態様である。別の実施態様は、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞の分化を誘導する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、「分化」は、細胞が特定の細胞型（例えば特殊化された細胞型）へと変化するプロセスをいう。この幹細胞は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子で処理される。この幹細胞は、引き続いて膵臓前駆細胞に分化する。
好ましい実施態様は、この膵臓前駆体は、引き続いて偽島様集合体を形成する態様である。
なお別の実施態様は、単離されたネスチンポジティブなヒト膵臓幹細胞または単離されたネスチンポジティブなヒト肝臓幹細胞を提供する態様である。なお別の実施態様は、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない単離された膵臓幹細胞を提供する態様である。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、β細胞、α細胞、偽島様集合体または肝細胞のいずれかに分化する。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は免疫特権を持つ。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩ ＭＨＣ抗原を発現しない。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩＩ ＭＨＣ抗原を発現しない。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩ ＭＨＣ抗原もクラスＩＩ ＭＨＣ抗原も発現しない。
なお別の実施態様は、膵臓細胞を幹細胞として同定する方法を提供する態様である。細胞は、標識されたネスチン特異的抗体と接触される。この細胞が抗体で標識されるようになる場合、この細胞が幹細胞として同定される。別の実施態様において、膵臓幹細胞は、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２のうちのいずれかに特異的な抗体とこの細胞を接触させることによって幹細胞として同定され、ここで抗体で標識されるようになる細胞が、幹細胞として同定される。さらなる任意のステップは、この細胞をサイトケラチン１９に対する抗体およびＩＶ型コラーゲンに対する抗体と接触させるステップを有する。この細胞は、サイトケラチン１９抗体またはＩＶ型コラーゲン抗体のいずれでも標識されない場合に幹細胞として同定される。
別の実施態様において、膵臓幹細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちのいずれかに特異的な抗体とこの細胞を接触させることによって幹細胞として同定され、ここでこの細胞は、これらの抗体のいずれでも標識されない場合に幹細胞として同定される。
別の実施態様は、肝細胞に分化するようにネスチンポジティブな膵臓幹細胞を誘導する方法を提供する態様である。このネスチンポジティブな膵臓幹細胞は、肝細胞または肝細胞に分化する前駆細胞に分化するようにこの幹細胞を誘導する有効量の因子で処理される。好ましい実施態様において、この因子はサイクロパミン（cyclopamine）である。別の実施態様は、肝細胞または肝細胞に分化する前駆細胞に分化するようにこの幹細胞を誘導する有効量の因子での処理によって、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞を肝細胞に分化するように誘導する方法を提供する態様である。
なお別の実施態様は、肝臓疾患を有する患者を治療する方法を提供する態様である。ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そして患者に移植され、ここでこの幹細胞は肝細胞に分化する。別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない膵臓幹細胞が、ドナーの膵島から単離され、そして患者に移植され、ここでこの幹細胞は肝細胞に分化する。
関連実施態様において、この幹細胞は、エキソビボで前駆細胞に拡張され、この前駆細胞は患者に移植され、そしてさらに肝細胞に分化する。
別の関連実施態様において、この幹細胞は、エキソビボで前駆細胞に分化し、この前駆細胞は患者に移植され、そしてさらに肝細胞に分化する。別の関連実施態様において、この幹細胞はエキソビボで肝細胞に分化し、この肝細胞は患者に移植される。
これらの実施態様において、この患者はまた、膵島組織のドナーとして役立ち得、細胞の同系移植片または分化した組織を提供する。
なお別の実施態様は、単離されたネスチンポジティブなヒト肝臓幹細胞を提供する態様である。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は免疫特権を持つ。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩ ＭＨＣ抗原を発現しない。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩＩ ＭＨＣ抗原を発現しない。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、クラスＩ ＭＨＣ抗原もクラスＩＩ ＭＨＣ抗原も発現しない。
なお別の実施態様は、神経幹細胞ではない単離されたネスチンポジティブなヒト幹細胞を提供し、この幹細胞は、移植片対宿主拒絶を引き起こさずに動物に移植され得る態様である。この実施態様のバージョンにおいて、この幹細胞は、主要組織適合複合体クラスＩでもクラスＩ拘束性でもない。なお別の実施態様は、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない単離されたヒト幹細胞を提供し、この幹細胞は、神経幹細胞ではなく、移植片対宿主拒絶を引き起こさずに動物に移植され得る。
本明細書中で使用される場合、「幹細胞」は、インビボまたはエキソビボのいずれかで本質的に無制限に増殖し得、そして他の細胞型に分化し得る未分化細胞である。これは、単離された組織に存在する特定の分化した細胞型、運命づけられた細胞型、未熟な細胞型、前駆細胞型もしくは成熟細胞型か、または劇的に分化した細胞型（例えば、共通の前駆細胞に由来する赤血球およびリンパ球のような）か、あるいはこの幹細胞が得られる組織とは完全に異なる組織の任意の段階の細胞型でさえあり得る。例えば、血液幹細胞は脳細胞または肝細胞になり得、神経幹細胞は血液細胞になり得、その結果幹細胞は多能性であり、そしてそれらの環境から適切なシグナルを受けると、これらの幹細胞は体内で任意の組織に分化し得る。
一実施態様において、本発明に従った「幹細胞」は、免疫学的にブラインドであるかまたは免疫特権である。本明細書中で使用される場合、「免疫学的にブラインド」または「免疫特権」は、免疫応答を誘導しない細胞をいう。本明細書中で使用される場合、「免疫応答」は、外来物質に対して免疫系によって引き起こされる応答をいう。本明細書中で使用される場合、免疫応答は、移植拒絶または移植片拒絶、抗体産生、炎症および抗原に対する抗原特異的リンパ球の応答を含むがこれらに限定されない。免疫応答は、当該分野で周知の方法に従って、そして本明細書中において「移植片拒絶の分析」という表題の節で規定されるように、例えば移植された物質が首尾よく移植されたかまたは拒絶されたかを決定することによって検出される。一実施態様において、本発明に従った「免疫学的にブラインドな幹細胞」または「免疫特権の幹細胞」は、移植拒絶を伴わずに同種移植または異種移植され得、そして移植レシピエントまたは宿主において自己として認識される。
移植物質または移植片物質は、宿主が移植された物質に免疫寛容である場合を除いて、または免疫抑制剤が拒絶を妨げるように使用される場合を除いて、移植レシピエントまたは宿主の免疫系によって拒絶され得る。
本明細書中で使用される場合、本発明に従った「免疫寛容」である宿主は、本明細書中で規定されるように、免疫応答を開始できない。一実施態様において、「免疫寛容」である宿主は、移植された物質を拒絶または破壊しない。一実施態様において、「免疫寛容」である宿主は、抗原に結合し得る抗体を産生することによって抗原に反応しない。
本明細書中で使用される場合、「拒絶」とは、宿主の免疫系による移植された物質の拒絶をいう。一実施態様において、「拒絶」とは、宿主の免疫応答に応答して、移植された物質の９０％を超える細胞または組織のネクローシスの発生を意味する。別の実施態様において、「拒絶」とは、宿主の免疫応答に応答して、移植された物質の生存能力が、移植前の移植された物質の生存能力と比較して９０％を超えて減少するような生存能力の減少を意味する。生存能力の減少は、当該分野で周知の方法（トリパンブルー排除染色を含むがこれに限定されない）によって決定され得る。別の実施態様において、「拒絶」とは、移植された物質が増殖できないことを意味する。増殖は、当該分野で公知の方法（ヘマトキシリン／エオシン染色が挙げられるがこれに限定されない）によって測定され得る。移植拒絶の発生および／または拒絶が移植後に生じる速度は、因子（移植された物質（すなわち、細胞型または細胞数）あるいは宿主（すなわち、この宿主が免疫寛容であるか否か、および／または免疫抑制剤で処置されているか否か）が挙げられるがこれらに限定されない）に依存して変化する。本明細書中で使用される場合、「移植片対宿主拒絶」または「移植片対宿主応答」とは、移植された物質のＴ細胞が宿主の抗原と反応する細胞媒介性反応をいう。
本明細書中で使用される場合、「宿主対移植片拒絶」または「宿主対移植片応答」とは、宿主の免疫系の細胞が外来の移植片物質または移植物質を攻撃する細胞媒介性反応をいう。
本発明の別の実施態様において、特定の抗体（例えば、移植された物質に対する抗原に特異的に結合する抗体、すなわち外来物質または外来物質の産物に特異的に結合する抗体）の産生が、当該分野で周知の免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ、免疫染色、免疫沈降法およびウェスタンブロット分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって検出される場合に、免疫応答が生じる。
幹細胞は、細胞表面上で形態形成ホルモンレセプターまたは成長ホルモンレセプターを発現し、そして例えば傷害関連因子を検知し得、次いで組織傷害の部位に局在化し、そしてこの部位にとどまるか、またはその局所的な微環境を検知し得、そして適切な細胞型に分化する。
「本質的に無制限な増殖」は、例えば、単離された幹細胞が、細胞培養系において少なくとも５０の細胞分裂、好ましくは１００の細胞分裂、そして２００以上までさえの細胞分裂を通じて増殖する能力によって決定され得る。幹細胞は「全能」であり得、これは、生殖細胞の場合のように、生物のすべての細胞を誘発し得ることを意味する。「全能」はまた、胚および栄養芽層の両方を誘発し得る受精卵を意味する。幹細胞はまた「多能性」であり得、多くの異なる細胞型（生物のすべての細胞ではない）を誘発し得ることを意味する。「多能性」はまた、胚のみを誘発し、栄養芽層を誘発しないことを意味する。幹細胞が分化する場合、これは一般的には、より成熟した細胞型を誘発し、この細胞型は、ある程度分化した細胞（例えば前駆細胞）、分化細胞または最終分化細胞であり得る。幹細胞は極めて運動能力を有し得る。
「ネスチン」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６５９６４（図７）に開示される配列を有する中間径フィラメントタンパク質をいう。
「ＡＢＣＧ２」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０３２４２４（図１８）に開示される配列を有するＡＴＰ結合カセット多剤耐性輸送体Ｇ２をいう。当業者は、ＡＢＣＧ２をコードするＤＮＡ配列が変化し得るが、コードされたアミノ酸配列は同じままである等価物が存在することを認識する。
「Ｏｃｔ３／４」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ ０１３６３３に開示される配列を有するＰＯＵ／ホメオドメイン転写因子をいう。
「ＧＬＰ−１Ｒ」は、図２１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０１１５６）に示される核酸配列によってコードされ、そしてまた図１７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０１１５６）に示されるアミノ酸配列を有するグルカゴン様ペプチド１レセプターをいう。当業者は、ＧＬＰ−１ＲをコードするＤＮＡ配列が変化し得るが、コードされたアミノ酸配列は同じままである等価物が存在することを認識する。
「ラトロフィリン（２型）」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ１３１５８１に開示される配列を有するＧタンパク質共役レセプターをいう。
「Ｈｅｓ−１」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５５２４に開示される配列を有するｂＨＬＨ転写因子をいう。
インテグリンは、α鎖およびβ鎖から構成される完全な細胞表面タンパク質である。特定の鎖は、異なるインテグリンをもたらす複数のパートナーと結合し得る。例えばα６は、ＴＳＰ１８０といわれるインテグリンにおいてβ４と結合し得るか、またはインテグリンＶＬＡ−６においてβ１と結合し得る。
インテグリンサブユニット「α６」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２１０に開示される配列を有するヒトインテグリンα６ ｃＤＮＡをいう。
インテグリンサブユニット「β１」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０７９７９に開示される配列を有するヒトβ１ ｃＤＮＡをいう。
「ｃ−Ｋｉｔ」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０６１８２に開示される配列を有する細胞表面レセプターチロシンキナーゼをいう。
「ＭＤＲ−１」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９２７に開示される配列を有する多剤耐性輸送体１をいう。
「ＳＳＴ−Ｒ２」「ＳＳＴ−Ｒ３」および「ＳＳＴ−Ｒ４」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０８５７４５（ＳＳＴＲ−２）；ＮＭ＿００１０５１（ＳＳＴＲ−３）；ＸＭ＿００９５９４（ＳＳＴＲ−４）に開示される配列を有するソマトスタチンレセプターをいう。
「ＳＵＲ−１」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０４２７４０に開示される配列を有するヒトスルホニル尿素レセプターをいう。
「Ｋｉｒ６．２」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２１１３９に開示される配列を有するヒト内向き整流カリウムチャネルをいう。
「ＣＤ３４」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７３に開示される配列を有する膜貫通糖タンパク質をいう。
「ＣＤ４５」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｙ００６３８に開示される配列を有する白血球共通抗原をいう。
「ＣＤ１３３」は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６０１７に開示される配列を有する５回膜貫通造血幹細胞抗原をいう。
「膵臓の」幹細胞は、膵臓組織から単離されている幹細胞、および／またはネスチンポジティブ染色、ネスチン遺伝子発現、サイトケラチン−１９ネガティブ染色、培養物における長期間の増殖および培養物において偽島に分化する能力という特性のすべてを有する細胞を意味する。
「膵臓の」幹細胞はまた、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、および／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１つもしくはすべてを発現しない幹細胞をいう。
一実施態様において、「膵臓の」幹細胞はまた、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３および／またはＳＳＴ−Ｒ４に対してポジティブな幹細胞をいう。
「肝臓の」幹細胞は、肝臓組織から単離されている幹細胞、および／またはネスチンポジティブ染色、ネスチン遺伝子発現および培養物における長期間の増殖という特性のすべてを有する細胞を意味する。
「前駆細胞」は、分化によって幹細胞から派生し、そしてより成熟した細胞型にさらに分化し得る細胞である。
本明細書中で使用される場合、用語「インスリン産生性β細胞」は、ヒト膵臓におけるランゲルハンス島のβ細胞によって産生および分泌されるインスリンと類似の量でインスリンを産生および分泌し得る任意の細胞をいう。好ましくは、インスリン産生性β細胞によるインスリンの分泌はまた、in situでのヒトβ細胞によるインスリン分泌の調節と類似の様式で調節される。例えば、インスリン分泌は、インスリン産生性β細胞周囲の溶液のグルコース濃度の増加によって刺激されるはずである。
「偽島様」集合体は、膵臓のランゲルハンス島と形態および機能が類似するインスリン分泌性細胞の人工的集団である。偽島様集合体は、細胞培養条件下でエキソビボで作製される。これは、直径およそ５０〜１５０μｍ（in situの島についての平均直径１００μｍと比較して）であり、そして球状である。
幹細胞の「単離」は、組織サンプルから幹細胞を取り出し、そして組織の幹細胞ではない他の細胞を分離するプロセスをいう。単離された幹細胞は、一般的に他の細胞型による汚染がなく、そして一般的に、単離された組織の成熟細胞を産生する増殖能および分化能を有する。しかし幹細胞の蓄積物（例えば幹細胞の培養物）を扱う場合、１００％純粋な幹細胞の蓄積物を獲得することは事実上不可能であることが理解される。従って単離された幹細胞は、他の分化した細胞型の分析または産生についてこの幹細胞の利用を妨げない他の細胞型の小画分の存在環境下で存在し得る。単離された幹細胞は、一般的に少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。好ましくは、本発明に従った単離された幹細胞は、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。
幹細胞は、培養物中で増殖され、そして細胞分裂によって他の幹細胞および／または前駆細胞を誘発する場合に「拡張」される。幹細胞の拡張は、幹細胞が培養物中で増殖する場合に自発的に生じ得るか、あるいは特定の成長条件（例えば最小細胞密度、すなわち培養容器表面上の細胞コンフルエント状態）、または化学的因子（例えば増殖因子、分化因子もしくはシグナリング因子）の付加を必要とし得る。
幹細胞、前駆細胞または分化細胞が患者に培養容器から移植される場合に、哺乳動物にそれらの細胞が「移植」または「導入」されることになる。本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、およびこの幹細胞を哺乳動物または患者に移植するステップを有し得る。移植は、哺乳動物または患者に細胞懸濁液を注入することによって、哺乳動物または患者の組織または器官への細胞集団の外科的移植によって、あるいは細胞懸濁液での組織または器官の灌流によって、哺乳動物または患者に幹細胞を移植するステップを含み得る。幹細胞の移植経路または移植経路は、細胞が特定の組織または器官に存在する必要性、ならびに細胞が所望の標的組織または器官を見出す能力および所望の標的組織または器官によって保持される能力によって決定される。移植された細胞が特定の場所に存在するべき場合、組織または器官に外科的に配置され得るか、あるいは細胞が所望の標的器官に移動する能力を有する場合には単に血流に注入され得る。
本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、ならびにこの幹細胞を培養するステップおよび哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、この幹細胞を分化するステップ、および哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、この幹細胞を分化および拡張するステップ、ならびに哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。
免疫抑制剤での処置は、その処置を必要とする患者に、所望の免疫応答（例えば移植された細胞、組織または器官の拒絶）の発生を妨げるか、その応答を遅らせるかあるいはその応答の強度を減少させる任意の因子を投与することによって達成され得る。
本明細書中で使用される場合、「免疫抑制」は、本明細書中で規定されるような「免疫応答」が検出不可能であるような免疫応答の阻止（例えば、本明細書中で規定されるような「免疫抑制剤」の投与による）をいう。本明細書中で使用される場合、免疫応答の「阻止」は、免疫応答が検出不可能であることを意味する。免疫応答（例えば、移植拒絶または抗体産生）は、当該分野で周知の方法および本明細書中で規定される方法に従って検出される。
本発明に従った「免疫抑制」はまた、免疫抑制剤を受けていない移植レシピエント、あるいは本明細書中で規定されるような「免疫学的にブラインド」または「免疫特権」ではない物質を移植されている移植レシピエントのうちのいずれか一方と比較した場合の免疫応答の発生の遅延を意味する。免疫応答の発生の遅延は、短い遅延（例えば１時間〜１０日間、すなわち１時間、２日間、５日間または１０日間）であり得る。免疫応答の発生の遅延はまた、長い遅延（例えば１０日間〜１０年間（すなわち、３０日間、６０日間、９０日間、１８０日間、１年間、２年間、５年間または１０年間））であり得る。
本発明に従った「免疫抑制」はまた、免疫応答の強度の減少を意味する。本発明に従って、免疫応答の強度は、免疫抑制剤を受けていない移植レシピエント、あるいは本明細書中で規定されるような「免疫学的にブラインド」または「免疫特権」ではない物質を移植されている移植レシピエントのうちのいずれか一方の免疫応答の強度よりも５〜１００％少なく、好ましくは２５〜１００％少なく、そして最も好ましくは７５〜１００％少ないように減少され得る。この免疫応答の強度は、移植された物質が拒絶される時点を決定することによって測定され得る。例えば、移植後１日目の移植された物質の拒絶を含む免疫応答は、移植後３０日目の移植された物質の拒絶を含む免疫応答よりも強度が大きい。この免疫応答の強度はまた、移植された物質に結合し得る特定の抗体量を定量することによって測定され得、ここで抗体産生のレベルは、免疫応答の強度に直接相関する。あるいは、この免疫応答の強度は、移植された物質に結合し得る特定の抗体が検出される時点を決定することによって測定され得る。
種々のストラテジーおよび因子が、免疫抑制について利用され得る。例えば、リンパ球の増殖および活性は、例えばＦＫ−５０６またはシクロスポリンあるいは他の免疫抑制剤のような因子で一般的に阻害され得る。別の可能なストラテジーは、抗ＧＡＤ６５モノクローナル抗体のような抗体、または移植された細胞上の表面抗原をマスクし、従って実質的にこの細胞を宿主の免疫応答に認識されなくする別の化合物を投与することである。
「免疫抑制剤」は、宿主における外来細胞（特に移植された細胞）に対する免疫反応の発生を妨げるか、この発生を遅延するか、またはこの反応の強度を減少させる任意の因子である。非自己として免疫系によって同定される細胞に対する細胞媒介性免疫応答を抑制する免疫抑制剤が好ましい。免疫抑制剤の例は、シクロスポリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、デキサメタゾン、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノラート、サリドマイド、ＦＫ−５０６、全身性ステロイド、ならびに広範囲の抗体、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニスト、および当業者に公知のような他のこのような因子が挙げられるがこれらに限定されない。
「マイトジェン」は、因子が加えられる細胞の有糸分裂および細胞増殖を刺激する任意の因子である。
「分化因子」は、幹細胞または前駆細胞を別の細胞型に分化させる任意の因子である。分化は、通常幹細胞または前駆細胞の１以上の遺伝子の発現を変更することによって達成され、そしてその構造および機能を変更する細胞をもたらす。
本明細書中で使用される場合、「シグナリング因子」は、同じ細胞または異なる細胞に対する効果を有する細胞によって分泌される因子である。例えばシグナリング因子は、その細胞自身、近隣の細胞、または生物中で遠い位置にある細胞の成長、増殖または分化を阻害または誘導し得る。シグナリング因子は、例えば組織における位置情報を伝達し得るか、パターン形成を媒介し得るか、または種々の解剖学的構造のサイズ、形状および機能に影響を与え得る。
本明細書中で使用される場合、哺乳動物は、任意の哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、サル、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ウマ、ウシまたはブタを含むがこれらに限定されない）をいう。
本明細書中で使用される場合、「非ヒト哺乳動物」は、ヒトではない任意の哺乳動物をいう。
本明細書中で使用される場合、「同種異系」は、同じ種の遺伝学的に異なるメンバーをいう。
本明細書中で使用される場合、「同系」は、同一の遺伝学的組成をいう。
本明細書中で使用される場合、「異種」は、異なる種のメンバーをいう。
本明細書中で使用される場合、「培養」は、細胞生存能力または細胞増殖を支持する環境およびこのような条件下で一定期間インキュベートすることによる細胞、細胞の蓄積物、組織または器官の増殖または育成をいう。培養は、本発明に従った細胞、細胞の蓄積物、組織または器官を拡張および増殖させるステップのうちの１以上を有し得る。
本明細書中で使用される場合、「免疫寛容状態のあらかじめの誘導または免疫寛容状態の誘導」は、ドナー由来の器官、組織または細胞の移植の際に、レシピエントの免疫系が、ドナーの組織を自己として認識し、従って「移植片対宿主」応答を開始しないような移植ドナーに由来する幹細胞での潜在的な移植レシピエントの処置をいう。好ましい実施態様において、この幹細胞は、ネスチンポジティブな幹細胞である。
本明細書中で使用される場合、「寛容」は、特定の外来抗原がこの免疫系の細胞によって自己として認識される免疫系状態をいう。
本明細書中で使用される場合、「レシピエント」は、ドナーから取り出された器官、組織または細胞を受け取る哺乳動物をいう。
本明細書中で使用される場合、「ドナー」は、器官、組織または細胞がレシピエントへの移植について取り出される哺乳動物をいう。
本発明はまた、生理学的に適合性のキャリアと混合された本発明の単離された幹細胞を含む薬学的組成物を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、幹細胞の機能的特性および分子特性を有する哺乳動物の膵臓のランゲルハンス島から特定のサブクラスの導管細胞を同定し、そして単離した。特に、これらの新規に発見された膵臓幹細胞は、１以上の以下（そして好ましくは以下のうちのすべて）によってとりわけ特徴付けられる：ネスチンポジティブ染色、ネスチン遺伝子発現、ＧＬＰ−１Ｒポジティブ染色、ＧＬＰ−１Ｒ遺伝子発現、ＡＢＣＧ２ポジティブ染色、ＡＢＣＧ２遺伝子発現、Ｏｃｔ３／４ポジティブ染色、Ｏｃｔ３／４遺伝子発現、ラトロフィリン（２型）ポジティブ染色、ラトロフィリン（２型）遺伝子発現、Ｈｅｓ−１ポジティブ染色、Ｈｅｓ−１遺伝子発現、インテグリンサブユニットα６およびβ１ポジティブ染色、インテグリンサブユニットα６およびβ１遺伝子発現、Ｃ−ｋｉｔポジティブ染色、Ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現、ＭＤＲ−１ポジティブ染色、ＭＤＲ−１遺伝子発現、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４ポジティブ染色、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４遺伝子発現、ＳＵＲ−１ポジティブ染色、ＳＵＲ−１遺伝子発現、Ｋｉｒ６．２ポジティブ染色、Ｋｉｒ６．２遺伝子発現、ＣＤ３４ネガティブ染色、ＣＤ４５ネガティブ染色、ＣＤ１３３ネガティブ染色、ＭＨＣクラスＩネガティブ染色、ＭＨＣクラスＩＩネガティブ染色、サイトケラチン−１９ネガティブ染色、培養物における長期間の増殖ならびに培養物において偽島に分化する能力。本発明者らはまた、ネスチンポジティブ染色を示す肝細胞を同定した。
一実施態様において、本発明は、Ｉ型インスリン依存型糖尿病および糖尿病の他の形態に対する細胞置換療法、ならびに種々の糖尿病状態、ホルモン異常、および遺伝子疾患または状態（例えば特定の生理学的状態もしくは病理学的状態との多型の関連）の発症および進行を研究するための研究手段の開発を含むがこれらに限定されない種々の適用について幹細胞を提供する。本発明の幹細胞がまた使用されて、同系移植片移植、同種移植片移植または異種移植片移植において内分泌膵臓組織または他の組織の遺伝子治療を行い得る。さらに、本明細書中で記載される幹細胞が使用されて、培養物中で組換え細胞、人工組織および置換器官を産生し得る。これらはまた、インスリンおよび他のホルモンのエキソビボ産生について使用され得る。本発明者らによって発見された膵臓幹細胞の分子特性（例えばネスチンポジティブ染色、ＧＬＰ−１Ｒポジティブ染色、ＡＢＣＧ２ポジティブ染色、Ｏｃｔ３／４ポジティブ染色、ラトロフィリン（２型）ポジティブ染色、Ｈｅｓ−１ポジティブ染色、インテグリンサブユニットα６およびβ１ポジティブ染色、Ｃ−ｋｉｔポジティブ染色、ＭＤＲ−１ポジティブ染色、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４ポジティブ染色、ＳＵＲ−１ポジティブ染色、Ｋｉｒ６．２ポジティブ染色ならびにサイトケラチン−１９ネガティブ染色、ＣＤ３４ネガティブ染色、ＣＤ４５ネガティブ染色、ＣＤ１３３ネガティブ染色、ＭＨＣクラスＩネガティブ染色およびＭＨＣクラスＩＩネガティブ染色）または肝臓幹細胞の分子特性（例えばネスチンポジティブ染色）が、種々の診断手順、病理学的手順または研究手順において使用されて、患者または実験動物由来の組織において幹細胞を同定、局在化および定量し得る。
（膵島における幹細胞の同定）
以前の研究者らは、島の内分泌細胞の新生に対する幹細胞の潜在的な供給源として、膵島の導管上皮細胞または外分泌組織に焦点を合わせていた。ネスチンは、Ｒ．４０１と命名されたモノクローナル抗体を用いて、Ｅ１５ラット胚からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによってクローニングされた中間径フィラメントタンパク質である（ＨｏｃｋｆｉｅｌｄおよびＭｃＫａｙ、１９８５；Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０）。ネスチンは、神経上皮幹細胞において第一に見出され、そして発生中の中枢神経系において発現される。最大レベルがラット胚においてＥ１６で到達された後、ネスチン発現は、成体の大脳皮質においてほとんど検出不可能なレベルまで低下し、これは初期のネスチン発現性前駆細胞の最終分化と一致する（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０）。ネスチンは、胚の発生中の脳および骨格筋の幹細胞において独占的に当初見出された（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０）。後の研究は、成体の哺乳動物前脳の上衣下層においてネスチンポジティブな神経幹細胞を同定した（Ｍｏｒｓｈｅａｄら、１９９４）。ネスチンポジティブな幹細胞は、成体のマウスまたはラットの脳から単離された場合でさえ多能性を示していた。例えば、ネスチンポジティブな幹細胞は、培養物中で神経細胞のあらゆる３つの主要なクラス（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）を作製し得る（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９６）。ネスチンポジティブな神経幹細胞は、アストロサイトに分化する遊走細胞の増殖および変性によって脊髄損傷に反応し、瘢痕形成に関与し（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９９）、そして照射を受けたマウスへの注入後に骨髄の造血細胞を回復させる（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、１９９９）。
（幹細胞のキャラクタリゼーション）
本発明に従った幹細胞は、例えば、ＦＡＣＳ、免疫細胞化学染色、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンノーザンブロット分析およびウェスタンブロット分析、ならびに当業者に公知のような細胞同定の他のこのような技術によって、ネスチンおよび／またはＧＬＰ−１Ｒ、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４、ＳＵＲ−１ならびにＫｉｒ６．２のこれらの発現によって同定され得る。
例えば免疫細胞化学染色は、以下の方法に従って行われる。膵臓または肝臓ならびに細胞から調製された凍結切片（６μＭ）を、ホスフェートにおける４％ パラホルムアルデヒドで固定する。細胞を、第一に３％ 正常ロバ血清で３０分間室温でブロックし、そして目的のタンパク質に対する一次抗血清とともに４℃で一晩インキュベートする。この抗血清をＰＢＳですすぎ、そして適切な蛍光標識された二次抗血清とともに室温で１時間インキュベートする。次いでスライドをＰＢＳで洗浄し、そして蛍光封入剤（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で覆う。蛍光像を、ＩＰ Ｌａｂ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ分析ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｖｉｅｎｎａ、ＶＡ）をインストールされたＰｏｗｅｒＭａｃ ７１００と接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＴＥＣ−４７０ ＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を備えたＺｅｉｓｓ Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡を用いて獲得する。
本発明に従って有用な抗血清は以下を有する：ヒトサイトケラチン１９に対するマウスモノクローナル抗体（クローンＫ４．６２、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ラットネスチンに対するウサギポリクローナル抗血清およびラットＩＤＸ−１に対するウサギポリクローナル抗血清（それぞれ精製ＧＳＴ−ネスチン融合タンパク質でのウサギの免疫、またはラットＩＤＸ−１の最後の１２アミノ酸でのウサギの免疫によって調製された）（ＭｃＭａｎｕｓら、１９９９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：９００４〜９０１５）、ＧＬＰ−１Ｒに対するウサギポリクローナル抗血清（Ｈｅｌｌｅｒら、１９９７、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６：７８５１）、ＡＢＣＧ２に対する抗血清（ＭＡＢ４１４６、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ））、インテグリンαＧに対する抗血清（ＳＣ−６５９７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、インテグリンβ１に対する抗血清（ＳＣ−６６２２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＨＥＳ１に対する抗血清（ＡＢ５７０２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＣＤ４５に対する抗血清（３１２５２Ｘ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ＣＤ３４に対する抗血清（ＭＳ−３６３−ＰＯ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ））、ＭＨＣ Ｉに対する抗血清（ＭＳ−５５７−ＰＯ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、ＭＨＣ ＩＩに対する抗血清（ＭＳ−１６２−ＰＯ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、ＭＤＲ−１（ｐ１７０）に対する抗血清（ＭＳ−６６０−ＰＯ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、Ｏｃｔ３／４に対する抗血清（ＳＣ−５２７９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（ＳＣ、ＣＡ））、ＳＵＲ−１に対する抗血清（ＳＣ−５７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＫＩＲ６．２に対する抗血清（ＳＣ−１１２２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＡＢＣＧ２に対する抗血清（ＳＣ−１８８４１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｃ−ｋｉｔに対する抗血清（ＳＣ−１４９３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＳＴＲ２に対する抗血清（ＳＣ−１１６０６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＳＴＲ３に対する抗血清（ＳＣ−１１６１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＳＴＲ４に対する抗血清（ＳＣ−１１６１９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｌｉｎｃｏ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯから得られるモルモット抗インスリン抗血清および抗膵臓ポリペプチド抗血清、ならびにそれぞれＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）から購入したマウス抗グルカゴン抗血清およびウサギ抗ソマトスタチン抗血清、マウス抗ヒトガラニン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）、ＩＶ型コラーゲン抗血清（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、マウス抗ラットＭＨＣクラスＩ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃｋ）ならびに抗ラットＭＨＣクラスＩＩ血清。本発明は、このようなマーカーを示す他の抗血清が入手可能であるか、または開発されることを意図する。このような他の抗血清は、本発明の範囲内にあるとみなされる。
ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析は、以下の方法に従って行われる。ラット島またはヒト島から調製された全細胞性ＲＮＡが逆転写され、そして以前に記載されるように（Ｄａｎｉｅｌら、１９９８、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３９：３７２１〜３７２９）増幅の所望の程度に依存しておよそ３５サイクルのＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲについてのプライマーまたはアンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）として使用されるオリゴヌクレオチド、および引き続くサザンブロットハイブリダイゼーションについてのプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは以下である：
ラットネスチン：フォワード、５’ｇｃｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｇｔｇａｃｔａｃ３’；
リバース、５’ａｇｇｃａａｇｇｇｇｇａａｇａｇａａｇｇａｔｇｔ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａｇｃｔｇａａｇｃｃｇａａｔｔｔｃｃｔｔｇｇｇａｔａｃｃａｇａｇｇａ３’。
ラットケラチン１９：フォワード、５’ａｃａｇｃｃａｇｔａｃｔｔｃａａｇａｃｃ３’；
リバース、５’ｃｔｇｔｇｔｃａｇｃａｃｇｃａｃｇｔｔａ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｔｇｇａｔｔｃｃａｃａｃｃａｇｇｃａｔｔｇａｃｃａｔｇｃｃａ３’。
ラットＮＣＡＭ：フォワード、５’ｃａｇｃｇｔｔｇｇａｇａｇｔｃｃａａａｔ３’；
リバース、５’ｔｔａａａｃｔｃｃｔｇｔｇｇｇｇｔｔｇｇ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａａｃｃａｇｃａｇｃｇｇａｔｃｔｃａｇｔｇｇｔｇｔｇｇａａｃｇａｔｇａｔ３’。
ラットＩＤＸ−１：フォワード、５’ａｔｃａｃｔｇｇａｇｃａｇｇｇａａｇｔ３’
リバース、５’ｇｃｔａｃｔａｃｇｔｔｔｃｔｔａｔｃｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｇｃｇｔｇｇａａａａｇｃｃａｇｔｇｇｇ３’
ヒトネスチン：フォワード、５’ａｇａｇｇｇｇａａｔｔｃｃｔｇｇａｇ３’；
リバース、５’ｃｔｇａｇｇａｃｃａｇｇａｃｔｃｔｃｔａ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｔａｔｇａａｃｇｇｇｃｔｇｇａｇｃａｇｔｃｔｇａｇｇａａａｇｔ３’。
ヒトケラチン：フォワード、５’ｃｔｔｔｔｃｇｃｇｃｇｃｃｃａｇｃａｔｔ３’；
リバース、５’ｇａｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｃ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａｃｃａｔｇａｇｇａｇｇａａａｔｃａｇｔａｃｇｃｔｇａｇｇ３’。
ヒトグルカゴン：フォワード、５’ａｔｃｔｇｇａｃｔｃｃａｇｇｃｇｔｇｃｃ３’；
リバース、５’ａｇｃａａｔｇａａｔｔｃｃｔｔｇｇｃａｇ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｃａｃｇａｔｇａａｔｔｔｇａｇａｇａｃａｔｇｃｔｇａａｇｇｇ３’；
ヒトＥ−カドヘリン：フォワード、５’ａｇａａｃａｇｃａｃｇｔａｃａｃａｇｃｃ３’
リバース、５’ｃｃｔｃｃｇａａｇａａａｃａｇｃａａｇａ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｔｃｔｃｃｃｔｔｃａｃａｇｃａｇａａｃｔａａｃａｃａｃｇｇｇ３’
ヒトトランスチレチン：フォワード、５’ｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃａｔｃａａｔｇｔｇ３’
リバース、５’ｇｔｔｇｇｃｔｇｔｇａａｔａｃｃａｃｃｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｃｔｇｇａｇａｇｃｔｇｃａｔｇｇｇｃｔｃａｃａａｃｔｇａｇｇ３’
ヒト膵臓アミラーゼ：フォワード、５’ｇａｃｔｔｔｃｃａｇｃａｇｔｃｃｃａｔａ３’
リバース、５’ｇｔｔｔａｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇｇａａｃ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｔｔｇｃａｃｔｇｇａｇａａｇｇａｔｔａｃｇｔｇｇｃｇｔｔｃｔａ３’
ヒトプロカルボキシペプチダーゼ：フォワード、５’ｔｇａａｇｇｃｇａｇａａｇｇｔｇｔｔｃｃ３’
リバース、５’ｔｔｃｇａｇａｔａｃａｇｇｃａｇａｔａｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ａｇｔｔａｇａｃｔｔｔｔａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃｔｃａ３’
ヒトシナプトフィジン：フォワード、５’ｃｔｔｃａｇｇｃｔｇｃａｃｃａａｇｔｇｔ３’
リバース、５’ｇｔｔｇａｃｃａｔａｇｔｃａｇｇｃｔｇｇ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｇｔｃａｇａｔｇｔｇａａｇａｔｇｇｃｃａｃａｇａｃｃｃａｇａ３’
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）：フォワード、５’ｇｃａｔｃａａａｔｇｔｃａｇｃｃｃｔｇｇ３’
リバース、５’ｃａａｃｇｃｔｇａｃａｔｇｇａａｔｔｃｃ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｔｃｇａｇｇｔｃｔｃａｔｇｇａｔｃａｔａｃａｇａａｔｃａｇｇ３’
ヒトｃＭＥＴ（ＨＧＦ−レセプター）：フォワード、５’ｃａａｔｇｔｇａｇａｔｇｔｃｔｃｃａｇｃ３’
リバース、５’ｃｃｔｔｇｔａｇａｔｔｇｃａｇｇｃａｇａ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｇｇａｃｔｃｃｃａｔｃｃａｇｔｇｔｃｔｃｃａｇａａｇｔｇａｔ３’
ヒトＸＢＰ−１：フォワード、５’ｇａｇｔａｇｃａｇｃｔｃａｇａｃｔｇｃｃ３’
リバース、５’ｇｔａｇａｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｃｔｃｃｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｃｇｃａｇｃａｃｔｃａｇａｃｔａｃｇｔｇｃａｃｃｔｃｔｇｃａ３’
ヒトＧｌｕｔ−２：フォワード、５’ｇｃａｇｃｔｇｃｔｃａａｃｔａａｔｃａｃ３’
リバース、５’ｔｃａｇｃａｇｃａｃａａｇｔｃｃｃａｃｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ａｃｇｇｇｃａｔｔｃｔｔａｔｔａｇｔｃａｇａｔｔａｔｔｇｇｔ３’
ヒトインスリン：フォワード、５’ａｇｇｃｔｔｃｔｔｃｔａｃａｃａ３’
リバース、５’ｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇｃａｃｃａ３’
ハイブリダイゼーション、５’ａｇｇｃａｇａｇｇａｃｃｔｇｃａ３’
他のこのような配列が可能であり、そしてこのような配列は、当該分野の範囲内にあることが考慮される。本発明は、以下からなる群より選択されるマーカーのうちのいずれかとして、ＰＣＲについてのプライマーまたはアンプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド、およびサザン分析についてのプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドを有する：ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ。一般的な指針として、プライマーは２つの異なるエキソンから選択され、そして少なくとも１つのイントロン配列を包含する。さらに、ＲＴマイナスコントロールが、大半のサンプルについて行われる。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、その後の９４℃で１０秒間、５８／５６℃で１０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、および７２℃で２分間で達成される。このアニーリング温度は、ラットネスチンについては５８℃であり、そして残存プライマー対については５６℃である。
ラットでもヒトでもない哺乳動物から単離されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲについて、分析されている哺乳動物種由来の増幅核酸に特異的なオリゴヌクレオチドが調製される。このようなプライマーの選択および使用は、当業者に公知である。
サザンハイブリダイゼーションについて、オリゴヌクレオチドプローブは、従来技術を用いて適切な放射性核種（例えばγ３２Ｐ ＡＴＰ）で標識される。放射能標識されたプローブは、３７℃で１時間ナイロン膜に転移されたＰＣＲ産物とハイブリダイズされ、次いで１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳにおいて５５℃で１０〜２０分間、または０．５×ＳＣＣおよび０．５％ ＳＤＳにおいて４２℃でヒトＰＣＲ産物について洗浄される。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのネスチン）
本発明者らは、成体哺乳動物（ヒトを含む）の膵臓がネスチンを発現する細胞を含むことを現在予期せず発見した。重要なことには、膵臓におけるネスチンポジティブな細胞の分布は、ホルモン産生細胞の分布と一致しない。例えば、インスリンまたはグルカゴンと特異的に反応性の蛍光標識された抗体は、それぞれ島のβ細胞およびα細胞を標識するが、一方本発明者らは、マウス、ラットおよびヒトにおいて、蛍光標識されたネスチン抗体は、小管上皮の特定の細胞のみに局在し、そして膵島におけるα細胞、β細胞、δ細胞および膵臓ペプチド産生細胞に局在しないことを観察した（図１）。本発明者らはまた、ＩＶ型コラーゲンに特異的な抗体（脈管内皮細胞に対するマーカー）、ガラニンに特異的な抗体（神経終末のマーカー）およびサイトケラチン１９に特異的な抗体（導管細胞に対するマーカー）が、ネスチン抗体と共局在しないことを観察した。さらに本発明者らは、ネスチンポジティブな島細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンまたは膵臓ポリペプチドに対する抗体と共標識しないことを見出した（図１）。これは、これらのネスチン含有細胞が、内分泌細胞、導管細胞、神経細胞または脈管内皮細胞ではないが、以前に記載されていない島内部のまったく独特の細胞型を示し得ることを示唆する。本発明者らは、島において、ならびに膵管の局在化領域において、そして外分泌膵臓の房心領域内にネスチンポジティブな細胞を見出した。
単離された島におけるネスチンｍＲＮＡの発現は、単離されたラット島由来のＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して検出された（図２）。ネスチンポジティブな膵臓細胞の機能的性質は、細胞培養技術を用いて、そして島からのネスチンポジティブな細胞の単離によって研究され、これらの両方は以下に記載される。
本発明者らはまた、ラットの肝臓がネスチンを発現する細胞を含むことを発見した（図１３）。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）多剤耐性輸送体（ＡＢＣＧ２（Ｂｒｃｐ１）およびＭＤＲ−）
ヒト島由来ＮＩＰは、ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１およびネスチンを共発現するＳＰ細胞の実質的分集団を含む（ＡＢＣＧ２発現は、染料ヘキスト３３３４２の排除に基づいて、骨髄における多能性幹細胞のＳＰ表現型を規定する）。ＭＤＲ−１は、ＳＰ細胞に複製能を与える。ＳＰ細胞（ＣＤ３４低／ネガティブ）は増殖せず、従ってインビトロでは拡張されることができない。ＣＤ３４低ネガティブなＳＰ細胞におけるＭＤＲ−１の強制発現は、このＳＰ細胞の増殖を引き起こす（Ｂｕｎｔｉｎｇら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：９０２）。ＮＩＰはまた、ＣＤ３４低／ネガティブである。従ってＮＩＰは、そのＡＢＣＧ２発現に基づいてＳＰ細胞としてここで規定され、そして髄由来ＳＰ細胞とは異なって、ＮＩＰはＭＤＲ−１を発現し、従って増殖し得、移植の目的についてエキソビボでＮＩＰ ＳＰ細胞の拡張を可能にする。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのＯｃｔ３／４）
ＮＩＰはＯｃｔ３／４を発現する。Ｏｃｔ３／４は、Ｐｏｕホメオドメインタンパク質のファミリーに属する転写因子である（Ｎｉｗａら、２００２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１５２６；Ｎｉｗａら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３２８；Ｎｉｗａ、２００１、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ ２６：１３７；Ｓｈｉｍａｚａｋｉら、１９９３、ＥＭＢＯ １２：４４８９；Ｗａｎｇら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７４：５７９；Ｎｉｃｈｏｌｓら、１９９８、Ｃｅｌｌ ９５：３７９）。これは重要な発見である。なぜならＯｃｔ３／４の発現は、厳密に幹／前駆細胞に限定されるからである（Ｎｉｗａら、２００２、上記；Ｎｉｗａら、２０００、上記；Ｎｉｗａ、２００１、上記）。ＮＩＰは、強力にＯｃｔ３／４を発現し、それによってそれ自身を幹／前駆細胞であると規定する。これは、Ｏｃｔ３／４発現が完全に幹／前駆細胞に限定され、そしてＯｃｔ３／４がＮＩＰにおいて発現される場合、ＮＩＰは幹／前駆細胞である。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのインテグリンサブユニットα６およびＢ１）
ＮＩＰは、インテグリンサブユニットαおよびＢ１を発現する。α６／Ｂ１インテグリンはラミニンレセプターである（ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０２８）。ＥＳ細胞は、ラミニンでコーティングされた培養皿において増殖され得、そして支持細胞層上での成長を必要としないことが最近示されている（Ｘｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１年１０月、１９：９７１）。この細胞表面発現性インテグリンは、細胞成長および発達の維持に不可欠である（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉら、上記を参照のこと）。このα６／Ｂ１レセプターは、ラミニンの認識に特異的であり、ラミニンは、胚盤胞において発現される本質的なタンパク質である。従ってα６／Ｂ１は、ＥＳ細胞（幹／前駆細胞）のマーカーである。ＮＩＰは、インテグリンサブユニットα６およびＢ１を発現する。従ってＮＩＰは、この点ではＥＳ細胞に類似する。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのＨｅｓ−１）
側方抑制のδ／ノッチシグナリング経路は、胚発生に重大である。ノッチシグナリングの重要性について多く記載されている。ノッチシグナリングはまた、ＮＩＰにおいて重要である。ノッチシグナリングは、膵臓の発生に絶対的に必要とされる（Ａｐｅｌｑｕｉｓｔら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４００：６７４７；Ｌａｍｍｅｒｔら、２０００、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．９４：；Ｊｅｎｓｅｎら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２４：３６；Ｊａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０００、４９：１６３）。Ｎｇｎ−３は、内分泌膵臓系統の発生に必要とされる重要なｂＨＬＨ転写因子決定基である。Ｈｅｓ−１は、Ｎｇｎ−３発現の強力なサプレッサーである。ＮＩＰは、強力にＨｅｓ−１を発現する。従ってＮＩＰは、内分泌細胞への分化を妨げる前駆細胞である。従ってＮＩＰにおいてＨｅｓ−１発現をブロックする方法は、内分泌細胞（β細胞）へのその分化を導く。Ｈｅｓ−１発現をブロックするためのこのような方法は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＨｅｓ−１ ＲＮＡを発現する発現プラスミドのいずれかを使用することによる、トランスフェクトされたアンチセンスＲＮＡの使用であり得る。
（膵臓幹細胞のマーカーとしてのＧＬＰ−１Ｒ）
本発明者らは、成体哺乳動物（ヒトを含む）の膵臓が、グルカゴン様ペプチド−１レセプター（ＧＬＰ−１Ｒ）を発現する細胞を含むことをさらに発見した。本発明は、ＧＬＰ−１Ｒポジティブな細胞が、ネスチンポジティブな細胞と共局在し得るという発見にさらに基づく。本発明はまた、ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＧＬＰ−１Ｒポジティブな細胞と共局在し得るという逆の発見に基づく。グルカゴン遺伝子は、多機能性プログルカゴンをコードし、これは、膵臓および腸管におけるプロホルモン転換酵素による特異的なプロセスであって、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）を生じる。ＧＬＰ−１は、膵β細胞に見出されるＧタンパク質共役レセプターに特異的に結合して、ｃＡＭＰ依存性経路を介してインスリン分泌を刺激することが示されている（ＫｉｅｆｅｒおよびＨａｂｅｎｅｒ、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：８７６；Ｄｒｕｃｋｅｒ、１９９８ Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７：１５９）。本発明は、上記のように、膵島および膵管に見出されるネスチンポジティブな幹細胞がまたＧＬＰ−１Ｒポジティブであるという発見に一部基づく。
ネスチンポジティブな島前駆細胞（ＮＩＰ）は、ヒト島組織から単離され、そして上記で略述された一般的な免疫細胞化学手順に従って、ＧＬＰ−１Ｒに対するウサギポリクローナル抗血清と反応した（Ｈｅｌｌｅｒら、上記）。レセプターの免疫反応性は、試験されたＮＩＰの６０％を超えて検出された（図２２Ａ）。ＮＩＰにおけるＧＬＰ−１Ｒの免疫細胞化学同定をさらに確認するために、ＲＴ−ＰＣＲが、ＮＩＰ細胞から調製されたｍＲＮＡに対して行われた。増幅プライマー、５’ｇｔｇｔｇｇｃｇｇｃｃａａｔｔａｃｔａｃ３’（フォワード）；５’ｃｔｔｇｇｃａａｇｔｃｔｇｃａｔｔｔｇａ３’（リバース）を用いたＮＩＰ ｍＲＮＡの増幅は、予期された３４６ｂｐ産物を産生し（図２２Ｂ）、ＧＬＰ−１Ｒタンパク質の発現に加えて、ＮＩＰがＧＬＰ−１Ｒを産生する生合成能を有することを示した。従って、ネスチンに加えてＧＬＰ−１Ｒは、本発明において膵臓幹細胞に対するマーカーとして有用である。
（導管上皮細胞の異なる集団に対するマーカーとしてのサイトケラチン−１９）
サイトケラチン−１９（ＣＫ−１９）は、別の中間径フィラメントタンパク質である。ＣＫ−１９および関連するサイトケラチンは、膵管細胞において発現されることが以前に見出されていた（Ｂｏｕｗｅｎｓら、１９９４）。しかし本発明者らは、ＣＫ−１９発現は確かに小管に限定される一方で、ＣＫ−１９に特異的な蛍光性抗体は、ネスチン特異的抗体で標識された細胞とは異なる導管細胞を標識することを発見した。これは、島におけるネスチンポジティブな細胞は、ＣＫ−１９ポジティブな細胞とは異なる細胞型の導管細胞であり得ることを示唆する。
（ＮＩＰはＣＤ３４低／ネガティブである）：
ＮＩＰのＳＰ画分（図１９Ｂの左下ゲート）は、低レベルからゼロのレベルのＣＤ３４を発現する。この発見は重要である。なぜならＣＤ３４ポジティブなＳＰ細胞と対照してみると、ＣＤ３４低ネガティブな髄由来のＳＰ細胞はきわめて多能性であるからである（Ｇｏｏｄｅｌｌ、１９９９、Ｂｌｏｏｄ、９４：１２５４５を参照のこと）。髄由来のＣＤ３４低／ネガティブなＳＰ細胞は、たとえあったとしても増殖能が限定される（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７；Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３：１３３７）。ＣＤ３４低／ネガティブなＮＩＰはインビトロで増殖しない。なぜならこのＮＩＰはＭｄｒ−１を発現するからである。
（膵臓幹細胞のさらなるマーカー）
本発明はまた、以下からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対してポジティブな膵臓幹細胞を提供する：ラトロフィリン（２型）（Ｓｕｄｈｏｆ、２００１、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：９３３）、Ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）（Ｇｉｂｓｏｎら、２００２、Ａｄｖ Ａｎａｔ Ｐａｔｈｏｌ ９：６５）、ＳＳＴＲ−２，３および４（ソマトスタチンレセプター）（Ｓｃｈｕｌｚら、２０００、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐａｒｉｓ ９４：２５９）、ＳＵＲ−１（スルホニル尿素（ｓｕｌｏｎｙｌｕｒｅａ）レセプター）（Ｗｉｎａｒｔｏら、２００１、Ａｒｃｈ Ｈｉｓｔｏｌ Ｃｙｔｏｌ ６４：５９；Ｌａｎｄｇｒａｆ、２０００、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ、１７：４１１）、ならびにＫｉｒ６．２（ＳＵＲ−１を含む内向き整流Ｋ＋チャネルサブユニット）（Ｗｉｎａｒｔｏら、上記；Ｌａｎｄｇｒａｆ、上記）。
本発明はまた、以下のうちの少なくとも１つに対してネガティブな膵臓幹細胞を提供する：ＣＤ４５（Ｓａｓａｋｉら、２００１、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３：１０４１）、ＣＤ１３３（Ｋｏｂａｒｉら、２００１、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １０：２７３）、ＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ。
（膵島由来の単離された幹細胞およびその使用）
幹細胞は、膵臓組織の調製物（例えば糖尿病患者由来の組織の生検サンプルから得られた島）から単離され得る。次いでこの幹細胞はエキソビボで拡張され得、そしてこの得られる細胞は、同系移植片としてドナーに戻して移植され得る。ドナーの内部において、この細胞は分化して、インスリン分泌性細胞（例えばβ細胞）を提供し、糖尿病を引き起こした自己免疫攻撃に奪われたβ細胞の代わりとなり得る。このアプローチは、組織（例えばドナーとして役立ち得る別の個体由来の島）の移植から生じる免疫拒絶の問題を克服し得る。本発明の一実施態様において、同系移植された幹細胞の使用により、別の技術が免疫拒絶を防ごうと努力して行われ得る（すなわち、移植された細胞を免疫攻撃（例えば１型糖尿病を有する個体に存在する自己免疫）に対して抵抗性にする移植細胞の遺伝子治療）。島全体にわたる幹細胞の使用のさらなる利点は、移植された幹細胞がインサイチュで分化し得、そして宿主環境により良く適応し得る（例えば適切な微小循環および宿主の生理的要求に応答する異なる島細胞型の補体を提供する）ことである。本発明の別の実施態様は、例えば前駆細胞を形成するためにエキソビボで部分的に分化した幹細胞の使用を意図し、この前駆細胞は引き続いて宿主に移植され、さらなる分化が宿主内で必要に応じて生じる。幹細胞の同系移植片の使用、前駆細胞の同系移植片の使用または偽島の同系移植片の使用が好ましい。別の実施態様は、別の個体または別の種の哺乳動物から得られた幹細胞の同系移植片の使用、前駆細胞の同系移植片の使用または偽島の同系移植片の使用を意図する。
本発明のなお別の実施態様において、この幹細胞は、免疫学的にブラインドであるかまたは免疫特権である。本発明のこの局面の一実施態様において、免疫特権の幹細胞は、十分な量のクラスＩおよび／またはクラスＩＩの主要組織適合抗原（別名ＨＬＡまたはヒト白血球抗原）を発現せず、宿主からの免疫応答を惹起する。例えば、同種異系供給源または異種供給源から得られるこれらの幹細胞は、免疫応答性の移植レシピエントにおいて宿主対移植片応答を起こさない。
本発明のこの局面の別の実施態様において、免疫特権の幹細胞は、クラスＩ ＭＨＣ抗原および／またはクラスＩＩ ＭＨＣ抗原を発現しない。同種異系供給源または異種供給源から得られるこれらの幹細胞は、免疫応答性の移植レシピエントにおいて宿主対移植片応答を起こさない。
本発明の別の実施態様において、幹細胞を含むヒト組織移植片は、ヒト特異的なクラスＩ ＭＨＣ抗原およびクラスＩＩ ＭＨＣ抗原の両方を発現するが、免疫応答性のマウスによって自己として認識され、そして宿主対移植片拒絶を受けない。同種異系供給源または異種供給源から得られるこれらの幹細胞は、免疫応答性の移植レシピエントにおいて宿主対移植片応答を起こさない。
本発明はまた、異種ドナーから幹細胞を単離する方法、および得られる細胞を異種移植片として別の種の哺乳動物に移植する方法（例えば、マウス幹細胞が、ヒト（例えば糖尿病性ヒト患者）に移植される）を提供する。
本発明は、ネスチンポジティブな幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこの幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）培養される。本発明はまた、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこの幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）培養される。
本発明はまた、ネスチンポジティブな幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこの幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）拡張されて、細胞分裂によって他の幹細胞または前駆細胞を生じさせる。
本発明はまた、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこの幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）拡張される。
本発明はまた、幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこのネスチンポジティブな幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子での処理によって前駆細胞へ分化するように誘導される。
膵臓幹細胞の場合において、この幹細胞は、引き続いて膵臓前駆細胞に分化する。
本発明はまた、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞の同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでこの幹細胞は、移植前に一定期間（例えば２〜４時間、４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間）、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子での処理によって前駆細胞へ分化するように誘導される。膵臓幹細胞の場合において、この幹細胞は、引き続いて膵臓前駆細胞に分化する。
本発明は、同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでネスチンポジティブな幹細胞は、移植前に培養もされないか、拡張もされないか分化もされず、あるいはここでネスチンポジティブな幹細胞は、移植前に培養されるかそして／または拡張されるかそして／または分化される。
本発明はまた、同系移植、同種異系移植または異種移植を行う方法を提供し、ここでＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞は、移植前に培養もされないか、拡張もされないか分化もされず、あるいはここでＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞は、移植前に培養されるかそして／または拡張されるかそして／または分化される。
ネスチンポジティブな細胞は、単離された膵島由来の培養物中で増殖され、そして引き続いて単離されて、本質的に無限に増殖し得る幹細胞系統を形成し得る。
別の実施態様において、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＳＴ−Ｒ２、ＳＳＴ−Ｒ３、ＳＳＴ−Ｒ４、ＳＵＲ−１、Ｋｉｒ６．２のうちの少なくとも１つに対してポジティブであり、そして／あるいはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのうちの１もすべても発現しない幹細胞は、単離された膵島由来の培養物中で増殖され、そして引き続いて単離されて、本質的に無限に増殖し得る幹細胞系統を形成し得る。
本発明者らは、ネスチンを発現する細胞が培養された島を離れて成長し、そして培養物中でおよそ４日と同じくらい早期に島の周囲での成長が観察され得ることを発見した。これらの細胞は、ニューロン様形態を有し（図３）、ネスチンポジティブ染色を示し、そしてネスチンｍＲＮＡを発現する。ネスチンポジティブな細胞を含む島は、島の懸濁液をコンカナバリンＡに暴露することによって、培養された島から増殖する他の細胞（例えば線維芽細胞）から分離され得る。ネスチンポジティブな幹細胞を含む島は、コンカナバリンＡでコーティングされた培養容器に接着せず、例えば島は単にデカントされ得、一方他の細胞型はこの容器に接着したままである。次いでこの島は、コンカナバリンＡコーティングを有さないウェル上にプレーティングされ、ここで島は接着する。培養手順および単離手順の詳細は、以下の実施例１においてラット細胞について記載される。類似の結果がヒト細胞を用いて得られている。
（培養物中での偽島および導管構造の形成）
本発明の一実施態様は、幹細胞または前駆細胞に、不十分な島細胞集団を有する患者に移植され得る偽島様集団を形成させて、ホルモン療法を伴わずに生理学的制御を維持することによる幹細胞または前駆細胞の移植の代案を提供する。島由来の幹細胞は、上記で示されるように培養された島から調製され得るか、または増殖中の幹細胞系統から得られ得る。次いでこの幹細胞は、これらを種々の増殖因子に暴露することによって分化するように誘導され得る。このプロセスは、実施例２および３に例示される。
（幹細胞または前駆細胞の島細胞への分化）
膵臓幹細胞の分化を誘導し得る増殖因子としては、ＥＧＦ−２、塩基性ＦＧＦ、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド−１をいう。高グルコースは、幹細胞の培養に通常使用される濃度よりも高いグルコース濃度をいう。例えば幹細胞は、およそ５．６ｍＭ グルコースにおいて一般に培養および増殖され得、そして高グルコース濃度は、５．６ｍＭを超える別の濃度をいう。好ましい実施態様において、１６．７ｍＭの濃度が意図される。実施例２において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）を使用する１つの可能な増殖因子処理が記載される。
培養細胞の培地に添加される増殖因子に加えて、さらなる増殖因子が、幹細胞が動物またはヒトに移植される場合に分化を引き起こすもととなり得る。この局面において、公知または未知のいずれかの多くの増殖因子が、内因性の細胞によって分泌され得、そしてインサイチュで幹細胞に暴露され得る。移植された幹細胞は、所望の結果（すなわち、最終分化した細胞型（単数または複数）および形成された解剖学的構造（例えば組織または器官））に適合した内因性の増殖因子および外因的に投与される増殖因子の任意の組み合わせによって分化するように誘導され得る。
一実施態様は、分化を刺激するアプローチを提供し、これは増殖因子の下流エフェクターを投与することか、あるいはこのようなエフェクターをコードする核酸分子を用いて幹細胞または前駆細胞をトランスフェクトすることである。一例はＩＤＸ−１であり、これはＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４によって誘導される転写因子である。ＩＤＸ−１のようなエフェクターの導入は分化を誘発して、内分泌性島細胞を形成し得る。
（移植片拒絶の分析）
本発明は、移植された物質の生存を評価するためのインビボ手順を提供する。実験的な移植拒絶は、免疫抑制された哺乳動物または免疫抑制されない哺乳動物に本発明に従った幹細胞または偽島様集団を移植することによって分析される。
例えば免疫抑制されないＣ５７ＢＬ／６マウスは、本発明に従ったヒト幹細胞を移植される（例えば腎被膜下で）。移植片拒絶は、移植レシピエントを屠殺しそして生存能力について染色するか、または適切な移植後の時点で移植された物質の部位（すなわち移植された物質の部位に存在する器官または組織）で免疫細胞化学染色を行うかによって分析される。移植された物質の部位の染色（例えばヘマトキシリン／エオシン染色または免疫染色）が行われる時点は、例えば平均生存時間または移植された物質の期待される生存時間に従って変化し得る。移植片の部位は、例えば移植後１日〜１０年（すなわち、１日、５日、１０日、３０日、１００日以上、１年、２年、５年または１０年）、好ましくは移植後１０日〜１年、そして最も好ましくは移植後１０〜１００日での染色によって分析される。例えば、移植された物質がマウスの腎被膜下で導入される場合、移植されたマウスの腎臓が精査される。移植された物質は、この移植された物質がなお検出可能であるか、そして／またはこの移植された物質が組織集団に増殖した場合に首尾良く移植される（すなわち拒絶されない）。
移植された物質の検出および移植された物質の増殖は、例えば移植部位（すなわち腎臓）から調製される凍結切片のヘマトキシリン／エオシン染色、および移植レシピエントに由来しない（すなわち宿主の腎臓に由来しない）新しい成長の検出によって決定される。異種移植の場合において、移植された物質は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される免疫細胞化学染色の方法に従った、移植された物質が由来する種由来の抗原に特異的な抗血清での特異的な免疫染色がポジティブな細胞を同定する場合に首尾良く移植される。あるいは、異種移植が行われる実施態様において、移植された物質は、移植された種（すなわち移植された物質が由来する種）由来の分子（すなわちタンパク質または抗原）が移植レシピエントの血液において検出される場合に首尾良く移植される。
本明細書中で使用される場合、「拒絶」は、宿主の免疫系による移植された物質の拒絶をいう。一実施態様において、「拒絶」は、宿主の免疫応答に応答して、移植された物質の９０％以上の細胞または組織のネクローシスの発生を意味する。別の実施態様において、「拒絶」は、移植された物質の生存能力が、宿主の免疫応答に応答して、移植前の移植物質の生存能力と比較して９０％以上減少するような生存能力の減少を意味する。生存能力の減少は、当該分野で周知の方法（トリパンブルー排除染色が挙げられるがこれに限定されない）によって決定され得る。別の実施態様において、「拒絶」は、移植された物質が増殖できないことを意味する。増殖は、当該分野で公知の方法（ヘマトキシリン／エオシン染色が挙げられるがこれに限定されない）によって測定され得る。移植拒絶の発生および／または拒絶が移植後に生じる速度は、移植された物質（すなわち細胞型もしくは細胞数）または宿主（すなわち宿主が免疫寛容であるか否か、そして／もしくは宿主が免疫抑制剤で処置されているか否か）が挙げられるがこれらに限定されない因子に依存して変化する。
（移植の方法）
本発明は、哺乳動物への移植の方法を提供する。幹細胞、前駆細胞または分化した細胞は、培養容器から患者へ移植される場合に哺乳動物へ「移植」または「導入」される。
本発明に従った移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、およびこの幹細胞を哺乳動物または患者に移植するステップを有し得る。本発明に従った移植は、細胞懸濁液の哺乳動物または患者への注入、哺乳動物または患者の組織または器官への細胞集団の外科的移植、あるいは組織または器官の細胞懸濁液での灌流によって、幹細胞を哺乳動物または患者に移植するステップを含み得る。幹細胞の移植経路または移植経路は、細胞が特定の組織または器官に存在する必要性、ならびに細胞が所望の標的組織または器官を見出す能力および所望の標的組織または器官によって保持される能力によって決定される。移植された細胞が特定の場所に存在するべき場合には組織または器官に外科的に配置され得るか、あるいは細胞が所望の標的器官に移動する能力を有する場合には単に血流に注入され得る。本発明に従った移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、ならびにこの幹細胞を培養するステップおよび哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。別の実施態様において、本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、この幹細胞を分化させるステップ、および哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。本明細書中で使用される場合、移植は、本発明に従って幹細胞を単離するステップ、この幹細胞を分化および拡張するステップ、ならびに哺乳動物または患者にこの幹細胞を移植するステップを有し得る。
（膵臓幹細胞を用いたインスリン依存型糖尿病を治療する方法）
幹細胞は、１型糖尿病患者由来の失われたβ細胞の置換、または２型糖尿病患者におけるβ細胞の総数の増大に有用である。糖尿病患者は、好ましくは幹細胞、前駆細胞または偽島様集団を産生するために使用される膵臓組織のドナーとして役立つ。幹細胞は、成体の膵島ならびに膵管内に存在する。糖尿病患者が膵臓生検を受けた後、島は生検組織から単離され、そしてエキソビボで好ましくは２４時間の範囲で培養の準備をされる。幹細胞は、上記の方法によって２〜３週間の範囲で増殖および単離され得る。幹細胞は、単離後直接患者に戻して移植され得るか、または増殖因子によって誘導される分化の期間後に移植され得る。島は、実施例２に記載されるように継代培養によって産生され得る。外科的な膵臓生検および移植のプロセス全体は、およそ３０日の期間以内に行われ得る。
本発明の一実施態様において、多能性幹細胞が使用される。これらの細胞は、免疫学的にブラインドまたは免疫特権であり、その結果同種異系移植または異種移植において、これらの細胞はレシピエントによって自己として認識され、そしてクラスＩ抗原またはクラスＩＩ抗原によってＭＨＣ拘束されない。本発明のこの実施態様の一局面において、これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原および／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現しない。
本発明の別の実施態様において、移植のレシピエントは、他の移植された細胞の宿主対移植片拒絶を実証し得、この拒絶は、例えば自己抗原（例えばＧＡＤ６５）に対する遮断抗体の投与、本明細書中で記載される１以上の免疫抑制剤の投与、あるいは自己免疫拒絶を妨げるかまたは改善するための当該分野で公知の任意の方法によって闘われ得る。
あるいは、本発明に従って非ヒト哺乳動物から単離された幹細胞が、ヒト糖尿病患者に移植される。移植ステップの前に、この幹細胞は培養され得るかそして／または拡張され得るかそして／または分化され得る。
（膵臓幹細胞を用いて肝臓疾患を患う患者を治療する方法）
膵臓幹細胞または膵臓前駆細胞が分化転換して肝細胞を形成する能力は周知である（ＢｉｓｇａａｒｄおよびＴｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ、１９９１）。本発明の膵臓幹細胞が使用されて、肝臓組織の機能的集団が減少している肝臓疾患（例えば肝硬変（ｃｉｒｒｏｓｉｓ）、肝炎または肝臓癌）を患う患者に肝細胞を提供し得る。本発明の幹細胞はまた、遺伝子治療によって処置されて遺伝子欠陥を修正し得、そして患者に導入されて肝臓機能を回復させ得る。ネスチンポジティブな幹細胞は、１以上の増殖因子を加えることによって、または他の処理（例えば核酸分子を用いたトランスフェクション）によって培養物中またはインビボのいずれかで分化され得、これは幹細胞の肝細胞への分化をもたらす。一実施態様において、本発明は、例えばソニックヘッジホッグを抑制するためのサイクロパミンの使用を意図し、これは肝細胞形成をもたらす。本発明の別の実施態様において、この幹細胞は、任意のエキソビボ処理を受けずに移植され得、そして適切な増殖因子が、インサイチュで患者の体内に提供され得る。なお別の実施態様において、この幹細胞は、増殖因子または他の因子でエキソビボ処理され得、そして引き続いて部分的に分化した状態または最終分化した状態で患者に移植され得る。幹細胞または前駆細胞をトランスフェクトする方法、投与の投薬量および経路、薬学的組成物、ドナー−同系移植片プロトコル、ならびに免疫抑制方法を含む本発明の他の局面は、膵臓組織への分化の場合とまったく同様に肝細胞への分化転換によって行われ得る。
本発明は、同系幹細胞、同種異系幹細胞または異種幹細胞、あるいはそれらの任意の組み合わせの患者への移植を特に意図する。
（幹細胞のトランスフェクションの方法）
種々の方法が、膵臓幹細胞への遺伝子移植に利用可能である。リン酸カルシウム沈殿化ＤＮＡが使用されているが、特に非接着細胞について低い形質転換効率を提供する。加えて、リン酸カルシウム沈殿化ＤＮＡ方法は、しばしば多数の縦列反復配列の挿入をもたらし、内因性ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡのいずれかの遺伝子機能の混乱の可能性を増大する（Ｂｏｇｇｓ、１９９０）。陽イオン脂質の使用（例えばリポソームの形態）がまた、真核生物細胞のトランスフェクションについてＤＮＡをパッケージングする有効な方法であり、そして陽イオン脂質のいくつかの市販された調製物が入手可能である。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウムプロトコルを超える改善された形質転換効率を提供する。これは、ゲノムの単一の部位で単一のコピーインサートを提供する利点を有する。細胞の核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションは、遺伝子移植のなお別の方法である。これは、短期トランスフェクションについてほぼ１００％の効率を提供し、そして安定なＤＮＡ組込みについては２０％の効率を提供することが示されている。マイクロインジェクションは、細胞質への外因性ＤＮＡの時折問題の多い細胞輸送を回避する。このプロトコルは、少量の物質を必要とする。これは、細胞当たり公知の量のＤＮＡの導入を可能にする。実質的に純粋な集団の幹細胞を得る能力は、膵臓幹細胞の標的化遺伝子修飾に対するマイクロインジェクションアプローチの実現可能性を改善する。しかしマイクロインジェクションは、長く極めて専門的なプロトコルである。このプロトコルの真の特質は、任意の所定の時に注入され得る細胞数を限定し、大規模産生におけるその使用を限定する。レトロウイルス方法を用いた膵臓幹細胞への遺伝子挿入が、好ましい方法である。レトロウイルスは、極めて高いトランスフェクション効率でランダムな単一コピーの単一部位のインサートを提供する。他のこのようなトランスフェクション方法が当業者に公知であり、そして本発明の範囲内にあるとみなされる。
（膵臓幹細胞のレトロウイルス形質転換）
膵臓細胞についての遺伝子移植プロトコルは、「ヘルパーウイルス」（すなわち、目的の外来遺伝子を保有するが、完全なウイルス粒子を形成することができない外殻被包（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）欠損ウイルスゲノム）としてレトロウイルスベクターを含み得る。他のキャリア（例えばＤＮＡ媒介性移植、アデノウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクター）がまた利用され得る。いくつかの因子が、感染について適切なベクターを選択する際に考慮されるべきである。スプライシングされたサブゲノムＲＮＡに頼るよりはむしろ外来遺伝子を発現するためにウイルスの末端反復配列または強力な内部プロモーターを使用することが時折好ましい。
幹細胞形質転換の２つの主な方法は、共培養および上清感染である。上清感染は、ウイルス上清への幹細胞の繰り返される暴露を含む。共培養は、幹細胞および感染された「パッケージ細胞株」（以下を参照のこと）の２４時間〜４８時間の混合を含む。共培養は、代表的には、幹細胞形質転換については上清感染よりも効率的である。共培養後、感染された幹細胞は、しばしばさらに培養されて、長期培養（ＬＴＣ）を確立する。
ヘルパーウイルスを含む細胞株は、パッケージ細胞株といわれる。種々のパッケージ細胞株が現在利用可能である。このパッケージ細胞株の重要な特徴は、複製能のあるヘルパーウイルスを産生しないことである。
本発明の一実施態様において、幹細胞が収集される動物または患者は、抽出の前に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理され得る。５−ＦＵ処理された幹細胞は、未処理の細胞よりもレトロウイルス感染を受けやすい。しかし５−ＦＵ幹細胞は、クローン原性前駆体の数を劇的に減少する。
別の実施態様において、収集された幹細胞は、種々の増殖因子（例えば膵臓幹細胞の増殖または分化を促進するために利用される増殖因子）に暴露され得る。増殖因子は、感染前、感染の間または感染後に培養物中に導入されて、細胞の複製および形質導入を改善し得る。研究は、増殖因子の使用が、形質転換効率を３０％から８０％に増大することを報告する。
（代表的なレトロウイルス形質転換プロトコル）
哺乳動物の膵臓幹細胞のエキソビボ形質導入、ならびに有効な移植およびその子孫細胞を含む種々の組織における遺伝子発現を得るに十分な非切除レシピエントへの引き続く移植が、マウスにおいて示されている。この標的細胞は、レシピエントへ注入される前に、目的の遺伝子を含む適切なベクターの存在環境下で２〜４日間培養される。
具体的には、骨髄幹細胞を雄性ドナー（４〜８週齢）のＢＡＬＢ／ｃ ＡｎＮＣｒマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から収集した。この細胞を、１０ｃｍ皿当たり１〜２×１０７細胞の密度でプレーティングし、そして以下を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において４８時間培養した：１０％ 熱不活化ウシ胎仔血清、グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）および細胞成長を刺激するための幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎら、１９９５）。
同時に、ウイルスパッケージ細胞株を２４時間培養した。Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎらによって使用されたパッケージ細胞株は、ＧＰ＋Ｅ８６であり、そしてこのウイルスベクターは、ＬＮシリーズのレトロウイルスベクターに基づいたＬＧレトロウイルスベクターであった。
適切なインキュベーション期間後、１〜２×１０７の幹細胞を、ウイルスパッケージ細胞を含む１０ｃｍ皿上にプレーティングし、そして８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在環境下、およびドナーの幹細胞と同じ増殖因子刺激条件下で４８時間共培養した。次いでこの幹細胞を収集し、増殖培地で洗浄し、そして複数の注入について（合計５回の注入、毎日または毎週のいずれかで）１回の注入当たり２×１０７細胞の投薬量でレシピエントマウスに注入した。
首尾良い幹細胞の形質導入および幹細胞の移植は、例えばＰＣＲ分析、免疫細胞化学染色、サザンノーザンブロッティングまたはウェスタンブロッティング、あるいは当業者に公知の他のこのような技術によって決定され得る。
（哺乳動物）
本発明に従って有用な哺乳動物は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、サル、ウマ、ハムスター、ブタまたはウシ）を有する。本発明に従った非ヒト哺乳動物は、ヒトではない任意の哺乳動物であり、マウス、ラット、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、サル、ウマ、ハムスター、ブタまたはウシが挙げられるがこれらに限定されない。
（投与の投薬量および様式）
例えば本明細書中で記載されるような膵臓幹細胞を必要とする患者は、以下のように処置され得る。本発明の細胞が、好ましくは生物学的に適合性の溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクル中で、経口摂取、注入、吸入または任意の数の他の方法によって患者に投与され得る。好ましい方法は、内視鏡的逆行性注入である。別の好ましい方法は、膵動脈への注入である。別の好ましい方法は、細胞または偽島様集団の腎被膜下空間への注入または配置である。投与される投薬量は、患者毎に変化する。「治療有効用量」は、例えば限定されないが、機能（例えばインスリン産生または血漿グルコースレベル）の増大のレベルによって決定され得る。幹細胞導入のレベルのモニタリング、このような移植によって影響を及ぼされる特定の遺伝子発現のレベルのモニタリング、および／またはコードされる産物の存在もしくはレベルのモニタリングによってまた、当業者は投与される投薬量を選択および調整し得る。一般的には、幹細胞を有する組成物は、体重１ｋｇ当たり１０５〜１０８細胞の範囲、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０６〜１０７細胞の範囲で単回用量で投与される。この投薬量は、毎日、毎週、毎月、毎年または治療する医師によって適切であると考慮されるように繰り返され得る。本発明は、細胞集団がまた患者から取り出され得るか、または別の状況では提供され得、エキソビボで拡張され得、所望であれば治療遺伝子を含むプラスミドを用いて形質導入され得、次いで患者に再導入され得る。
（薬学的組成物）
本発明は、生理学的に適合性のキャリアと混合された本発明に従った幹細胞を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、「生理学的に適合性のキャリア」は、生理学的に受容可能な希釈剤（例えば水、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩水）をいい、そしてさらにアジュバントを有し得る。アジュバント（例えば不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバン）は、当該分野で周知の物質である。
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用され得る適切な薬学的に受容可能なキャリア調製物を含み得る。
経口投与についての薬学的組成物は、経口投与に適切な投薬量で当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、患者による摂取について薬学的組成物が錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。
経口使用についての薬学的調製物は、活性化合物の固形賦形剤との組み合わせを通じて得られ得、所望であれば適切な補助剤の添加後に、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を処理して錠剤または糖剤のコアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質のフィラー（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質）である。所望であれば、崩壊剤または溶解剤（例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム））が添加され得る。
糖剤のコアは、適切なコーティング（例えば濃縮糖溶液）を用いて提供され、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、製品識別のため、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けるために錠剤または糖剤のコーティングに添加され得る。
経口で使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作られるプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンから作られるソフトシールカプセル、およびコーティング（例えばグリセロールまたはソルビトール）が挙げられる。プッシュフィットカプセルは、フィラーまたは結合剤（例えばラクトースもしくはデンプン）、潤滑剤（例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム）および必要に応じて安定剤と混合して活性成分を含み得る。ソフトカプセルにおいて、この活性化合物は、適切な液体（例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）に安定剤とともにまたは安定剤を伴わずに溶解または懸濁され得る。
非経口投与についての薬学的処方物は、活性化合物の水溶液を有する。注入について、本発明の薬学的組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えばハンクス溶液、リンガー溶液または生理的塩類溶液）において処方され得る。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘性を増大する物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。さらに、活性溶媒またはビヒクルの懸濁液は、脂肪油（例えばゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）あるいはリポソームを有する。必要に応じてこの懸濁液はまた、適切な安定剤またはこの化合物の溶解度を増大させる因子を含み、高度に濃縮された溶液の調製を可能にし得る。
鼻投与について、透過されるべき特定の障壁に適した浸透剤が、この処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式において（例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、粒状化プロセス、糖剤作製プロセス、湿式粉砕プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、捕捉プロセスまたは凍結乾燥プロセスの手段によって）製造され得る。
薬学的組成物は、塩として提供され得、そして多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない）とともに形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性溶媒または他のプロトン性溶媒においてより可溶性である傾向がある。他の場合において、好ましい調製物は、使用前に緩衝液と化合される１ｍＭ〜５０ｍＭ ヒスチジン、０．１％〜２％ スクロース、２％〜７％ マンニトールにおける４．５〜５．５のＰｈ範囲での凍結乾燥粉末であり得る。
受容可能なキャリア中で処方される本発明の化合物を含む薬学的組成物が調製された後、この組成物は、適切な容器に配置され得、そして指示された状態の処置について投与の量、頻度および方法を含む情報とともにラベルを貼られ得る。
上記の開示は一般的に本発明を記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得られ得、この実施例は、本明細書中において例示の目的のみについて提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
（実施例１）
（ラット膵臓からのネスチンポジティブな幹細胞の単離）
ラット島を、ＬａｃｙおよびＫｏｓｔｉａｎｏｖｓｋｙによって記載されるコラゲナーゼ消化方法を用いて、２〜３月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの膵臓から単離した。ヒト島を、コラゲナーゼ処理を用いてＤｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬによって提供した。この島を、コンカナバリンＡでコーティングされている１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４３プレート、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、ＮＪ）において３７℃で９６時間培養した。この培養培地は、１０％ ウシ胎仔血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００単位／ｍｌ ペニシリン、０．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）および７１．５ｍＭ βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＲＰＭＩ １６４０であった。
９６時間後、線維芽細胞および他の非島細胞が、コンカナバリンＡでコーティングされた細胞の表面に接着し、そして島は浮遊したままであった（表面に接着しなかった）。この時点で、島を含む培地を取り出し、遠心分離で落とし、そして浄化された島をコンカナバリンＡのコーティングを伴わない１２ウェルプレートに再プレーティングした。次いで島を、２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子２および２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子を補充された上記のＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
島はこのプレートの表面に接着し、そして細胞は外へ向かい、島を離れて単層で成長した。単層を形成するこれらの細胞は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｒ．Ｍａｒｉｏ Ｖａｌｌｅｊｏによって開発されたウサギ抗ラットネスチン抗血清での免疫染色によってネスチンポジティブであった。他のネスチン抗体（例えば、本明細書中上記で記載されるＲ．４０１抗体またはＭＡＢ５３３抗体）が使用され得る。ラット胚脊髄ネスチンに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡＢ３５３、ＡＴＣＣ番号１０２３８８９）は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；１６：１９０１〜１００に記載され、そしてまた、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｎｇｌｅ Ｏａｋ Ｄｒ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ ９２５９０ ＵＳＡから入手可能である。培養の２週間後、いくつか（３〜５個）のネスチンポジティブな単層細胞を、毛細管で突くことによって取り出し（シリンダークローニング）、そして１２ウェルプレート（コンカナバリンＡでコーティングされない）上に再プレーティングし、そしてさらにｂＦＧＦ−２およびＥＧＦを補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。この細胞は速い速度で増殖し、そして培養の６日後にコンフルエントな状態に達した。培養の１２日後、この細胞の単層は波を形成し、これにおいて細胞は、共線様式で積み重なり始めた。培養の１５日目に、細胞の波は凝縮し始め、小球体に移動し始め、そして１７日目までにウェルの表面は、これらの小球体（直径約１００μｍ）、空所および残存する単層細胞のいくつかの領域を含んだ。これらの単層細胞のいくつかを再び拾い上げ、そして再びクローニングし、そして上記で記載されるプロセスを、正確に同じ時間順序で再び行った。
（実施例２）
（島を形成するための膵臓幹細胞の分化）
ラット由来の膵島を、コンカナバリンＡでコーティングされた１２ウェルプレートを用いて、１０％ ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地中で第一に培養した。この島を、ウシ胎仔血清によって供給される増殖因子以外に添加された増殖因子の非存在環境下において３日間培地中で維持した。この期間後、島が接着しなかった間、この島をコンカナバリンＡを含まない新しいプレートに移した。次いで幹細胞を、ｂＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）に２４日間暴露することによって、単層として島から出て増殖するように刺激した。２４日間後、この単層はコンフルエントであった。それらの間で、細胞集団は島を囲んだ。この集団由来の細胞を取り出し、そして新しい１２ウェルプレートにサブクローニングし、そして再びｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む培地中で培養した。このサブクローニングされた細胞は、クローン様式で単層に急速に増殖し、中心から周辺へと拡張した。この細胞は６日目でコンフルエントになり、次いで１２日目に重なり合う細胞の波を形成し始めた。１７日目までに、細胞はほとんど完全に小球体構造、ならびに島様構造に類似する管状構造（偽島様集団）および導管様構造（偽導管）に移動した（図４）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、偽島様集団が、ＮＣＡＭ（内分泌細胞に対するマーカー、図５を参照のこと）、サイトケラチン１９（導管細胞に対するマーカー、図５を参照のこと）および転写因子ｂｒａｉｎ−４（β細胞のマーカー）を発現することを明らかにした。増殖因子での処理は、成熟島細胞への最終分化を達成するために必要とされる。
（実施例３）
（ヒト膵島またはラット膵島の単離および培養）
ヒト膵島を単離および培養した。ヒト島組織を、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＪｕｖｅｎｉｌｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡの島分配プログラムから得た。十分に洗浄した島を手でつかみ、１０％ ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧ溶液、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸塩、０．２５ｎｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよび７１．５μＭ βメルカプトエタノールを補充した改変ＲＰＭＩ １６４０培地（１１．１ｍＭ グルコース）中で懸濁し、そしてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）でコーティングされているＦａｌｃｏｎ ３０４３ １２ウェル組織培養プレートに添加した。この島調製物を、９５％ 空気および５％ ＣＯ２とともに３７℃で９６時間インキュベートした。これらの条件において、多くの島は懸濁液中に残存した（浮遊した）が、一方線維芽細胞および他の非島細胞は基底に接着した。９６時間のインキュベーション後、懸濁された島を含む培地を慎重に移し、この島を手動で取り出し、そしてここで各々２０ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）をさらに補充された改変ＲＰＭＩ １６４０培地中に再懸濁した。この島懸濁液（１ウェル当たり２０〜３０の島を含む）を、ＣｏｎＡでコーティングされない１２ウェル組織培養プレートに添加した。この島は、プレートの表面に直ちに接着した。数日以内に、外へ向かい、島を離れて成長する細胞の単層を観察した。特定の場合において、ヒト由来の細胞を、２．５ｍＭ グルコースおよびアクチビン−Ａ（２ｎＭ）、肝細胞増殖因子（１００ｐＭ）またはベータセルリン（５００ｐＭ）を含むいくつかの増殖因子の組み合わせを含む改変ＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞を１０ｍＭ ニコチンアミドでチャレンジした実験において、この培地は血清も増殖因子も含まなかった。
（実施例４）
（膵臓幹細胞の分化に対するグルコースおよびＧＬＰ−１の効果）
血漿グルコース濃度の上昇は、膵臓島サイズの増大を導いた。従って培養培地におけるグルコース濃度の効果を、単離された島を用いて研究し、この島はネスチンポジティブな幹細胞を含んだ。ラット膵島を、高（１６．７ｍＭ）グルコースを含む培地または正常（５．６ｍＭ）グルコースでの培地中で培養した。４日後ＲＴ−ＰＣＲを行って、ネスチンｍＲＮＡのレベルを決定した。この結果は、正常グルコースで培養された島と比較して、高グルコースで培養された島においてネスチンｍＲＮＡレベルを３倍刺激したことを示した（図６）。
同様に、マウスへのグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の注入は、４８時間で島の大きさを２倍に増大したことを見出した。ＧＬＰ−１レセプターに対する崩壊された遺伝子を有するノックアウトマウスを、膵島におけるネスチン発現について試験した。ネキシン抗体を用いた免疫染色は、ＧＬＰ−１レセプターを有する正常マウスと比較して著しく減少されたことを見出した。
（真性糖尿病の動物モデル）
症状の緩和をもたらす真性糖尿病型に対する処置を、糖尿病の症状を示す動物において試験した。動物は、ヒトにおける糖尿病の処置に有用な因子および手順についてのモデルとして役立つことが意図された。従って糖尿病についての潜在的な処置は、潜在的な処置を動物に投与し、そしてその効果を観察し、そして処置された動物を未処置のコントロールと比較することによって、動物モデルにおいて第一に試験され得た。
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、Ｉ型糖尿病またはインスリン依存型真性糖尿病の重要なモデルであり、そしてヒト糖尿病に対して特に適切なモデルであった（本明細書中で参考として援用されるＫｉｋｕｔａｎｏおよびＭａｋｉｎｏ、１９９２、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２：２８５、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。ＮＯＤマウスにおけるＩ型糖尿病の発達は、任意の外部刺激を伴わずに自発的かつ突然に生じた。ＮＯＤマウスが糖尿病を発達する間、このマウスは慢性自己免疫疾患によって引き起こされるβ細胞の進行性破壊を受けた。ＮＯＤマウスにおけるインスリン依存型真性糖尿病の発達は、以下の２つの段階に大まかに分類され得た：自己免疫インスリン炎（膵島におけるリンパ球の炎症）の開始、ならびに島の破壊および明白な糖尿病の増進。糖尿病性ＮＯＤマウスは、正常血糖または正常な血液グルコースレベルから一生を開始するが、およそ１５〜１６週齢までにこのＮＯＤマウスは高血糖となりだし、これは膵β細胞の大多数の破壊、および膵臓が十分なインスリンを産生できない対応する能力を示した。インスリン欠損および高血糖に加えて、糖尿病性ＮＯＤマウスは、急速な体重減少を伴う重篤な糖尿、多渇症（ｐｏｌｙｄｙｐｓｉａ）および多尿を受けた。従って、疾患の原因および進行の両方が、インスリン依存型真性糖尿病に冒されたヒト患者に類似した。自発的な寛解は、ＮＯＤマウスでは滅多に観察されず、そしてこれらの糖尿病性動物は、インスリン療法を受けない限りは糖尿病の発症後１〜２ヶ月以内に死んだ。
ＮＯＤマウスが動物モデルとして使用されて、本発明に従った幹細胞調製物を投与することによって、糖尿病の種々の処置方法の有効性を試験した。それ自体では、幹細胞の投与を介した処置を、Ｉ型糖尿病に対する効果についてＮＯＤマウスにおいて試験した。
幹細胞を、以下の投薬量に従って代表的には腹腔内にＮＯＤマウスに投与した。ＮＯＤマウスに、１匹のマウス当たりおよそ１×１０１〜１×１０４細胞を投与した。細胞の投与を、およそ４週齢のＮＯＤマウスにおいて開始し、そして８〜１０週間、例えば１週間に３回継続した。このマウスを、糖尿病についておよそ１３週齢で開始してモニターし、このマウスは以下に記載される方法に従って１週当たり２回試験された。処置の効果を、処置ＮＯＤマウスおよび未処置ＮＯＤマウスの比較によって決定した。
ＮＯＤマウスにおける糖尿病に対する本発明の処置方法の有効性を、当業者に公知の手段によってＮＯＤマウスにおける糖尿病についてアッセイすることによって、例えば多渇症、多尿、糖尿、高血糖およびインスリン欠損または体重減少についてＮＯＤマウスを試験することによってモニターした。例えば、本明細書中で参考として援用されるＢｕｒｋｌｙ、１９９９、米国特許第５，８８８，５０７号によって記載されるように、尿グルコース（糖尿）のレベルを、Ｔｅｓｔａｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてモニターし得、そして血漿グルコースレベルを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ ３ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）を用いてモニターし得た。これらの方法によって尿グルコースレベルおよび血漿グルコースレベルをモニターすることによって、ＮＯＤマウスを、２つの連続した尿陽性試験が、＋１以上のＴｅｓｔａｐｅ値または２５０ｍｇ／ｄＬを超える血漿グルコースレベルを与えた後に糖尿病であるとみなした（Ｂｕｒｋｌｙ、１９９９、上記）。ＮＯＤマウスにおける糖尿病をアッセイする別の手段は、ＮＯＤマウスにおける膵臓インスリンレベルを試験することであった。例えば、膵臓インスリンレベルはイムノアッセイによって試験され得、そして処置マウスおよびコントロールマウスとの間で比較され得た（Ｙｏｏｎ、米国特許第５，４７０，８７３号、本明細書中で参考として援用される）。この場合において、インスリンをマウス膵臓から抽出し、そしてその濃度を、標準としてマウスインスリンを用いて、その免疫反応性によって（例えば放射線免疫検定法技術によって）決定した。
一般に糖尿病についてＮＯＤマウスをモニターすることに加えて、処置の創意に富んだ方法の効果をまた、投与される幹細胞を異種遺伝子を用いて形質転換またはトランスフェクトする場合、遺伝子特異的効果または遺伝子産物特異的効果についてモニターし、それによって、異種遺伝子の発現と糖尿病に対するその効果との間を相関させ得た。例えば、異種遺伝子産物の存在を、遺伝子産物およびインスリンについてＮＯＤマウスの膵β細胞の免疫組織化学によって試験し得た。ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子およびｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ遺伝子の発現を、ｐａｔｃｈｅｄレセプターおよびｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄレセプターに対するＲＮＡ転写物の検出によって、ＮＯＤマウスの島においてさらに試験した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を公知の手段によって行って、マウスのｐａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡのフラグメントまたはｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ｃＤＮＡのフラグメントを増幅し、そして標準的な手段に従ってアガロースゲル電気泳動によって分析した。増幅されたｃＤＮＡフラグメントの同定を、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子またはｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ遺伝子について放射能標識された内部オリゴヌクレオチドプローブとの増幅フラグメントのハイブリダイゼーションによって、あるいは当業者に公知のような他のこのような方法によって、ｐａｔｃｈｅｄ ＲＮＡまたはｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ＲＮＡに一致するとして確認した。
（実施例５）
（ネスチンポジティブなヒトおよびラットの膵臓幹細胞の免疫細胞化学同定）
膵島を、ネスチン発現について分析した。島および幹細胞を、上記のように単離した。ネスチン発現を、１６日胚（Ｅ１６）のラット膵臓の発達中の島集団内部の細胞の異なる集団において（図８Ａ）、そして成体膵臓（生後６０日）の島において（図８Ｂ）、免疫細胞化学染色によって観察した。免疫細胞化学染色を、以下のように行った。
１６日胚および成体（６０日）のラット膵臓ならびに細胞から調製された凍結切片（６μＭ）を、ホスフェートにおける４％ パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、第一に３％ 正常ロバ血清で３０分間室温でブロックし、そして一次抗血清とともに４℃で一晩インキュベートした。この抗血清をＰＢＳですすぎ、そしてそれぞれＣｙ−３およびＣｙ−２で標識された二次抗血清とともに室温で１時間インキュベートした。次いでスライドをＰＢＳで洗浄し、そして蛍光封入剤（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で覆った。組織切片を、一次抗血清とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで一次抗血清をＰＢＳですすぎ、そしてロバ抗−Ｃｙ３（インドカルボシアニン（ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ））および抗モルモット（インスリン）、抗マウス（グルカゴン）または抗ヒツジ（ソマトスタチン）血清ＤＴＡＦのいずれか（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）との室温で３０分間のインキュベーション前に、スライドを３％ 正常ロバ血清とともに室温で１０分間ブロックした。次いでスライドをＰＢＳで洗浄し、そして蛍光封入剤（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で覆った。蛍光像を、ＩＰ Ｌａｂ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ分析ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｖｉｅｎｎａ、ＶＡ）をインストールされたＰｏｗｅｒＭａｃ ７１００と接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＴＥＣ−４７０ ＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を備えたＺｅｉｓｓ Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡を用いて獲得した。
このネスチンポジティブな細胞は、β細胞、α細胞、δ細胞およびＰＰ細胞とは異なった。なぜならこれらの細胞は、インスリンホルモンに対する抗血清（図８ＡおよびＢ）、グルカゴンホルモンに対する抗血清、ソマトスタチンホルモンに対する抗血清または膵臓ポリペプチドに対する抗血清と共染色しないからである。このネスチンポジティブな細胞はまた、ＩＶ型コラーゲンに対する抗血清（脈管内皮細胞に対するマーカー）とも（図８Ｃ）ガラニンに対する抗血清（神経細胞に対するマーカー）またはサイトケラチン１９に対するモノクローナル抗体（導管細胞に対する特異的マーカー）とも共染色しなかった（図８）。ネスチンポジティブな染色は、核共染色によって明確に観察される島内部の独特の細胞と関連した（図４Ｄ）。
（実施例６）
（ＲＴ−ＰＣＲによるネスチンポジティブなヒト幹細胞およびラット幹細胞の同定）
膵島におけるネスチン発現の免疫細胞化学同定を確認するために、本発明者らは、新たに単離されたラット島およびヒト島組織から調製された総ＲＮＡを用いて、ネスチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲを、以下の方法に従って行った。
ラット島またはヒト島から調製された細胞性ＲＮＡ全体を逆転写し、そして以前に記載されるように、３５サイクルのＰＣＲによって増幅した（Ｄａｎｉｅｌら、１９９８、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３９：３７２１〜３７２９）。ＰＣＲについてのプライマーまたはアンプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド、および引き続くサザンブロットハイブリダイゼーションについてのプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは以下であった：
ラットネスチン：フォワード、５’ｇｃｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｇｔｇａｃｔａｃ３’；
リバース、５’ａｇｇｃａａｇｇｇｇｇａａｇａｇａａｇｇａｔｇｔ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａｇｃｔｇａａｇｃｃｇａａｔｔｔｃｃｔｔｇｇｇａｔａｃｃａｇａｇｇａ３’。
ラットケラチン１９：フォワード、５’ａｃａｇｃｃａｇｔａｃｔｔｃａａｇａｃｃ３’；
リバース、５’ｃｔｇｔｇｔｃａｇｃａｃｇｃａｃｇｔｔａ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｔｇｇａｔｔｃｃａｃａｃｃａｇｇｃａｔｔｇａｃｃａｔｇｃｃａ３’。
ラットＮＣＡＭ：フォワード、５’ｃａｇｃｇｔｔｇｇａｇａｇｔｃｃａａａｔ３’；
リバース、５’ｔｔａａａｃｔｃｃｔｇｔｇｇｇｇｔｔｇｇ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａａｃｃａｇｃａｇｃｇｇａｔｃｔｃａｇｔｇｇｔｇｔｇｇａａｃｇａｔｇａｔ３’。
ラットＩＤＸ−１：フォワード、５’ａｔｃａｃｔｇｇａｇｃａｇｇｇａａｇｔ３’
リバース、５’ｇｃｔａｃｔａｃｇｔｔｔｃｔｔａｔｃｔ３’
ハイブリダイゼーション、５’ｇｃｇｔｇｇａａａａｇｃｃａｇｔｇｇｇ３’
ヒトネスチン：フォワード、５’ａｇａｇｇｇｇａａｔｔｃｃｔｇｇａｇ３’；
リバース、５’ｃｔｇａｇｇａｃｃａｇｇａｃｔｃｔｃｔａ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｔａｔｇａａｃｇｇｇｃｔｇｇａｇｃａｇｔｃｔｇａｇｇａａａｇｔ３’。
ヒトケラチン：フォワード、５’ｃｔｔｔｔｃｇｃｇｃｇｃｃｃａｇｃａｔｔ３’；
リバース、５’ｇａｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｃ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ａａｃｃａｔｇａｇｇａｇｇａａａｔｃａｇｔａｃｇｃｔｇａｇｇ３’。
ヒトグルカゴン：フォワード、５’ａｔｃｔｇｇａｃｔｃｃａｇｇｃｇｔｇｃｃ３’；
リバース、５’ａｇｃａａｔｇａａｔｔｃｃｔｔｇｇｃａｇ３’；
ハイブリダイゼーション、５’ｃａｃｇａｔｇａａｔｔｔｇａｇａｇａｃａｔｇｃｔｇａａｇｇｇ３’；
プライマーを２つの異なるエキソンから選択し、そして少なくとも１つのイントロン配列を包含した。さらに、ＲＴマイナスコントロールを、大半のサンプルについて行った。ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分間、その後の９４℃で１０秒間、５８／５６℃で１０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、および７２℃で２分間であった。このアニーリング温度は、ラットネスチンについては５８℃であり、そして残存プライマー対については５６℃であった。
サザンハイブリダイゼーションについて、オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ ＡＴＰで放射能標識した。放射能標識されたプローブを、３７℃で１時間ナイロン膜に転移されたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、次いで１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳにおいて５５℃で１０〜２０分間、または０．５×ＳＣＣおよび０．５％ ＳＤＳにおいて４２℃でヒトＰＣＲ産物について洗浄した。
このＲＴ−ＰＣＲは、正確に予測されたサイズの産物を生成し（図８Ｅ、上部のパネル）、そしてサザンブロッティング（図８Ｅ、下部のパネル）およびこの産物のＤＮＡ配列決定によって確認された。これらのデータは、ネスチンを発現し、そして中枢神経系におけるネスチンポジティブな幹細胞と類似の島多能性幹細胞を表し得る膵島の新規の細胞型の同定を実証した。
（実施例７）
（ＡＴＰ依存性輸送体ＡＢＣＧ２は、膵島由来のネスチンポジティブな細胞において発現される）
ヒト島由来ＮＩＰは、ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１およびネスチンを共発現するＳＰ細胞の実質的な部分集団を含んだ。ネスチンは、神経および筋肉の幹／前駆細胞のマーカーとして第一に示された（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０、Ｃｅｌｌ ６０：５８５：Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら；１９９４、Ｎｅｕｒｏｎ １２：１１）。神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア細胞の異なる型を生じさせる高程度の可塑性を特に示した。神経幹／前駆細胞はまた、造血細胞に分化し、これは神経幹／前駆細胞をまさに多能性幹細胞にする（Ｓｈｉｈら、２００１、Ｂｌｏｏｄ ９８：２４１２）。これまでの多能性の成熟幹細胞の最良の例は、骨髄由来の幹細胞、いわゆるＳＰ細胞であった（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８３：１７９７）。ＳＰ細胞は、蛍光生体染料であるヘキスト３３３４２を有効に排除し、そして骨髄再占有（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）細胞の大多数を含むその特性によって同定されていた。ＳＰ細胞は、成体ヒトおよびマウスの骨髄全体の０．０５％を表し、そしてあらゆる造血系統を生じさせることは別として、このＳＰ細胞はまた、骨格筋および心筋、ならびに内皮細胞を生じさせ得た（Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：３９０；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０７：１３９５）。ＡＴＰ結合カセット輸送体ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ１）は、ＳＰ表現型の主要な構成要素であることが実証されており、従って明確にＳＰ細胞を同定する分子手段を提供した（Ｋｉｍら、２００２、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：２２；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ ９９：５０７；Ｚｈｏｕら、２００１、Ｎａｔ Ｍｅｄ ７：１０２８）。特に、骨髄由来のＳＰ細胞は、たとえあったとしてもインビトロでの増殖能は限定されるが（Ｂｕｎｔｉｎｇら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：９０２；Ｓｔｏｒｍｓら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：２１２５）、骨髄細胞におけるＰ糖タンパク質ポンプ（ＭＤＲ−１）機能の増強は、インビトロでのＳＰ幹細胞の拡張およびインビボでの細胞の再占有をもたらした（Ｂｕｎｔｉｎｇら、２００２、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０：１１）。
ＮＩＰ（そのネスチンの発現によって神経幹細胞に関連される）はまた、ヘキスト３３３４２排除アッセイによって同定されるＮＩＰの実質的な部分集団におけるそのＡＢＣＧ２の発現によって、骨髄ＳＰ幹細胞の特性を示した。このＮＩＰのＳＰはまた、ＭＤＲ−１を発現し、これはインビトロでのその持続拡張に寄与した。従ってＮＩＰは、糖尿病被験体への移植のための島組織の産生に有用な成体多能性幹／前駆細胞の可能性のある供給源であり得た。
ヒト膵島を、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）およびＪｕｖｅｎｉｌｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の島分配プログラムから得た。ＮＩＰを、以前に記載されるように単離した（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら、２００１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：５２１）。手短に言えば、ヒト膵島を手でつかみ、１０％ ウシ胎仔血清、１０ミリモル／ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ミリモル／ｌ ピルビン酸ナトリウム、７１．５マイクロモル／ｌ βメルカプトエタノールおよびａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を補充した改変ＲＰＭＩ １６４０培地において、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）でコーティングされた培養皿において、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。９６時間後、浮遊している島を、ＣｏｎＡコーティングを伴わない新しいプラスチック培養皿中の２０ｎｇ／ｍｌ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および２０ｎｇ／ｍｌ 上皮増殖因子（ＥＧＦ）（両方ともＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから）をさらに補充された新鮮な培地に移した。この島は、コーティングされないプラスチック表面に接着し、そして数日以内に、外へ向かい、島を離れて成長する細胞の単層を観察した。単層の周辺由来の細胞、つまりネスチンポジティブな島由来の前駆細胞（ＮＩＰ）を、新しい培養皿に移し、そして上記と同じ条件下でコンフルエントな状態近くまで成長させた。細胞を、さらに２つの培養皿に分配して、ベラパミル（Ｈ３３３４２染料輸送のインヒビター）とともに、およびベラパミルを伴わずにヘキスト３３３４２染料排除アッセイを行った（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、上記）。
ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＣＧ２の発現を実証した（図１９Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲで生成されたＤＮＡ産物を配列決定し、そしてヒトＡＢＣＧ２の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ−０３２４２４、図１８）と一致する（５８６ｂｐ）ことを示した（データは示さず）。クローニングされたＡＢＣＧ２プローブとのサザンブロットハイブリダイゼーションは、正確なｃＤＮＡの増幅を確認した（図１９Ａ）。
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて製造業者のプロトコルに従って、培養されたＮＩＰ、ならびにソートされたＳＰ細胞および非ＳＰコントロール（それぞれ５０００細胞および１０，０００細胞）から単離した。一本鎖ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて作製した。このｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。逆転写酵素を含まないコントロール（−ＲＴコントロール）を、すべてのＰＣＲ反応について行った。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、そして産物の正確な同一性を、配列決定によって確認した。鋳型濃度を、ＧＡＰＤＨについて均一化した（３１サイクル）。ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１およびネスチンを、それぞれ３４サイクル、３８サイクルおよび３６サイクルで増幅した。プライマーは以下であった：ＧＡＰＤＨについては、５’ｔｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｔ３’および５’ｃａｔｇｔｇｇｇｃｃａｔｇａｇｇｔｃｃａｃｃａｃ３’、ネスチンについては、５’ａｇａｇｇｇｇａａｔｔｃｃｔｇｇａｇ３’および５’ｃｔｇａｇｇａｃｃａｇｇａｃｔｃｔｃｔａ３’、ＭＤＲ１については、５’ｔｃｃｔｇｇａｇｃｇｇｔｔｃｔａｃｇａｃ３’および５’ｇｇｇｃｔｔｃｔｔｇｇａｃａａｃｃｔｔｔｔｃａ３’、そしてＡＢＣＧ２については、５’ｇｃｔｇｇｇｇｔｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇａｃｇ３’および５’ｃｔａｃｃｃｃａｇｃｃａｇｔｇｔｃａａｃ３’。ＡＢＣＧ２についてのＰＣＲ産物を、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ；ＧＢ）に転移した。ブロットを、Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて製造業者のプロトコルに従って、放射能標識されてクローニングされたＡＢＣＧ２プローブまたはＭＤＲ１プローブとともにハイブリダイズした。ヒトＡＢＣＧ２の完全なオープンリーディングフレームに対するプライマーは、５’ｔａｔｔａａｇｃｔｇａａａａｇａｔａａａａａｃｔｃｔｃｃ３’および５’ａｔｇｔｇａｇｇａｔａａａｔｃａｔａｃｔｇａａｔ３’（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＸＭ＿０３２４２４の塩基対１７４〜２０２および２１８４〜２２０７）であった。
（実施例８）
（１．５〜２％の培養細胞は、ヘキスト３３３４２染料排除アッセイにおいてＳＰ表現型を有する）
ＮＩＰ（そのネスチンの発現によって神経幹細胞に関連される）はまた、ヘキスト３３３４２排除アッセイによって同定されるＮＩＰの実質的な部分集団におけるそのＡＢＣＧ２の発現によって、骨髄ＳＰ幹細胞の特性を示した。このＮＩＰのＳＰはまた、ＭＤＲ−１を発現し、これはインビトロでのその持続拡張に寄与した。
ＡＢＣＧ２の発現が、培養されたＮＩＰのいくつかにＳＰ表現型を与えるか否かを調べるために、ヘキスト３３３４２染料排除アッセイを、公表されたプロトコル（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、上記）をわずかに改変したプロトコルに従って行った。ヘキスト３３３４２染料の排除（これは、造血幹細胞の多能性ＳＰを規定する）は、ＡＴＰ結合カセット輸送体、ＡＢＣＧ２によって媒介された。ベラパミルを、Ｈ３３３４２輸送の特異的インヒビターとして使用した（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、上記）。
ヘキスト染料排除アッセイを、Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、上記のプロトコルに従って行い、細胞を培養皿に接着させたまま染色を行うという改変を施した。プロトコルにおいてこの変化を伴う細胞生存能力は、細胞を懸濁液中のまま染色する本来のプロトコルと比較してかなり高かった。ヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を、５μｇ／ｍｌの最終濃度で増殖培地に添加し、そして細胞を、３７℃で９０分間インキュベートした。示された場合、ベラパミル（Ｓｉｇｍａ）を、５０マイクロモル／ｌの最終濃度でアッセイの開始１５分前に添加した。分析について、細胞をトリプシン処理し、４０μｍの細胞ストレーナーに注ぎ、そして死細胞の識別について、２μｇ／ｍｌの最終濃度でヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を含む氷冷ハンクス液に再懸濁した。フローサイトメトリーを、ヘキスト３３３４２およびヨウ化プロピジウムの励起に対するＵＶレーザーを用いて、ａ Ｖａｎｔａｇｅ ａｎｄ ａ Ｍｏｆｌｏｗセルソーターで行った。４５０／２０ＢＰ（青）フィルターおよび６３０／２０（赤）フィルターを、線形モードでの分析について使用した。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、明確に認識できるＳＰを示し（図１９Ｂ；２．１％ ゲート細胞）、これはインヒビター、ベラパミルの存在環境下において存在しなかった（図１９Ｃ；０．１％ ゲート細胞）。独立して由来する２つの他のＮＩＰ培養物の分析において、ＳＰポジティブ細胞のパーセンテージは、それぞれ１．５％および２％であった（データは示さず）。本発明者らはまた、ＮＩＰ由来のＡＢＣＧ２の完全なオープンリーディングフレームを増幅した。発現ベクターにおけるクローニングおよびＩＮＳ−１インスリノーマ細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞において有効なヘキスト３３３４２排除をもたらした（データは示さず）。
（実施例９）
（ＳＰ表現型は、ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１およびネスチンの発現に相関する）
ＳＰ細胞および非ＳＰコントロール細胞を、ＦＡＣＳによって培養ＮＩＰから単離した（図２０Ａ；それぞれゲートＲ１およびＲ２）。ＡＢＣＧ２の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ（図２０Ｂ）およびクローニングされたＡＢＣＧ２プローブとのサザンブロットハイブリダイゼーションによって示されるようにＳＰ表現型と良好に相関した。ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロットハイブリダイゼーションは、培養ＮＩＰのＳＰ画分においてＭＤＲ−１（（Ｐ糖タンパク質）、造血幹細胞に存在する別のＡＴＰ結合カセット輸送体（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６６：８５）の発現を実証した（図２０Ｂ）。このＳＰ画分はまた、非ＳＰコントロールよりも著しく高いレベルでネスチンを発現した（図２０Ｂ）。
ヒト膵島由来のネスチンポジティブな細胞は、１．５〜２％のＳＰ細胞を含み、これは、非ＳＰコントロール細胞と比べて高いレベルでＡＢＣＧ２およびネスチンを発現した。ＳＰ表現型とのＡＢＣＧ２発現の相関は、ＡＢＣＧ２活性がＳＰ染料流出の主要な要素であるという発見を確認した（Ｋｉｍら、上記；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇら、上記；Ｚｈｏｕら、上記）。ネスチンおよびＡＢＣＧ２の共発現は、幹／前駆細胞の一般的マーカーとしてのネスチンに対する幅広い役割を示した。
異なる哺乳動物種（ヒトを含む）における骨髄のＳＰ細胞画分は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）の大多数を含んだ（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９７、上記）。骨髄由来のＳＰ細胞の分化は、血液系統に限定されなかった。動物モデルにおいて、ＳＰ細胞はまた、骨格筋および心筋ならびに内皮細胞に分化した（Ｇｕｓｓｏｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：３９０；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０７：１３９５）。さらに骨髄由来の幹細胞は、機能的な脳細胞および肝細胞に分化した（Ｂｒａｚｅｌｔｏｎら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１７７５；Ｌａｇａｓｓｅら、２０００、Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：１２２９）。
ＮＩＰ培養物におけるＳＰ細胞部分（１．５〜２％）は、骨髄において見出される部分（０．０５％）よりも少なくとも２０倍高かった（Ｇｏｏｄｅｌｌら、１９９６、上記）。しかし比較可能なパーセンテージのＳＰ細胞は、筋肉の衛星細胞の培養物において見出され、この衛星細胞は、筋形成前駆体と考えられた（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９６：１４４８２）。分化した筋繊維の生成に加えて、筋肉のＳＰ細胞は、致命的に放射線を照射されたマウスの骨髄を再構成することが示されており、従って思いもよらない程度の可塑性を示した（Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９９、上記）。これらのＳＰ細胞はまた、筋肉に残留する前に骨髄から生じるといういくつかの証拠が存在した（Ｋａｗａｄａら、２００１、Ｂｌｏｏｄ ９８：２００８）。ＳＰ集団はまた、マウスの胚幹細胞において実証されている（Ｚｈｏｕら、２００１、上記）。ＡＢＣＧ２神経幹細胞での発現は、より分化した神経細胞での発現よりも著しく高いことが示されている（Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄら、２００１、Ｎｅｕｒｏｎ ２９：３２５）。
ＭＤＲ１（Ｐ糖タンパク質、ＡＢＣＢ１）は、造血幹細胞において（いくつかの他の細胞型の間で）発現される別のＡＴＰ結合カセット輸送体であった（Ｚｈｏｕら、２００１、上記；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９１、上記）。骨髄細胞におけるＭＤＲ１の過剰発現は、ＳＰ集団の拡張、培養物におけるその生存の延長、およびマウスへの移植後の再占有活性の増強を導いた（Ｂｕｎｔｉｎｇら、２０００、上記）。移植動物のいくつかにおいて、これは最後に、慢性骨髄性白血病に類似した骨髄増殖性症候群をもたらした（Ｂｕｎｔｉｎｇら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９２：２２６９）。従ってＭＤＲ−１発現は、造血幹細胞の拡張に関係し、そしてＡＢＣＧ２のみ発現する静止細胞と対照して増殖性の幹細胞の特性として示唆された（Ｂｕｎｔｉｎｇら、２００２、上記）。ＭＤＲ１は、ＮＩＰ由来の膵島のＳＰ画分において発現された。
（実施例１０）
（ＧＬＰ−１Ｒポジティブなヒト膵臓幹細胞の免疫細胞化学同定）
ネスチンポジティブな膵島幹細胞を、ＧＬＰ−１Ｒ発現について分析した。ヒト島組織を、Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから得た。ＮＩＰを以前に記載されるように単離した（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら、２００１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：５２１）。手短に言えば、島を洗浄し、そして血清、１１．１ｍＭ グルコース、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、βメルカプトエタノールおよび増殖因子を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。数日以内に、ネスチンポジティブな細胞（上記のように免疫細胞化学的に同定された）は、島を離れて成長した。後にこれらの細胞をクローニングし、そして２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子、または１０００単位の組換えヒト白血病阻害因子を含む培地中で拡張した。血清の非存在環境下においてＧＬＰ−１とのインキュベーションを行い、そして新しいペプチドを、培地を変えずに４８時間毎に添加した。
ＧＬＰ−１Ｒの免疫細胞化学検出を、以下の通りにウサギポリクローナル抗血清（Ｈｅｌｌｅｒら、上記）を用いて行った。Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）または方眼のついたカバーグラス（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ、ＮＪ）上で培養された細胞を、室温で１０分間ＰＢＳにおける４％ パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳでの数回のすすぎ後、細胞を正常ロバ血清で３０分間ブロックし、そして一次抗血清または免疫前血清とともに４℃でインキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳですすぎ、そしてＣｙ−３またはＣｙ−２標識された二次抗血清（ロバ抗ウサギ抗血清およびロバ抗モルモット抗血清）とともに室温で１時間インキュベートした。数回の洗浄後、細胞を含むカバーグラスを、核を染色するＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含む封入剤を含むスライド上にマウントした。蛍光像を、ＰｏｗｅｒＭａｃ ７１００と接続されたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＴＥＣ−４７０ ＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を備えたＺｅｉｓｓ ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡を用いて獲得した。ＩＰ ｌａｂ Ｓｐｅｃｔｒｕｍソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｖｉｅｎｎａ、ＶＡ）を使用して、像を獲得および分析した。
ＧＬＰ−１Ｒ免疫反応性を、試験されたＮＩＰのうちの大多数（少なくとも６０％）において検出した（図２２Ａ）。
（実施例１１）
（ＲＴ−ＰＣＲによるＧＬＰ−Ｒ１ポジティブなヒト幹細胞の同定）
膵島（ＮＩＰ）におけるＧＬＰ−１Ｒ発現の免疫細胞化学同定を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを、ＮＩＰから調製した総ＲＮＡを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲを、上記の実施例６のように行い、ネスチンｍＲＮＡの同定についての差異は、以下のＧＬＰ−１Ｒ特異的プライマーを使用したことであった：５’ｇｔｇｔｇｇｃｇｇｃｃａａｔｔａｃｔａｃ３’（フォワード）；５’ｃｔｔｇｇｃａａｇｔｃｔｇｃａｔｔｔｇａ３’（リバース）。ＮＩＰ ｍＲＮＡの増幅は、予測された３４６ｂｐの産物を産生し（図２２Ｂ）、ＧＬＰ−１Ｒタンパク質の発現に加えて、ＮＩＰはＧＬＰ−１Ｒを産生する生合成能を有することを示した。従ってネスチンに加えてＧＬＰ−１Ｒは、本発明において膵臓幹細胞に対するマーカーとして有用であった。
（実施例１２）
（ネスチンポジティブな幹細胞のインビトロ増殖）
ネスチンポジティブな幹細胞がインビトロで増殖する能力を決定した。
６０日齢ラットまたは正常な成体ヒトから調製した島を、第一にコンカナバリンＡでコーティングされた皿上にプレーティングし、そして１０％ ウシ胎仔血清を含む改変ＲＰＭＩ １６４０培地中で４日間培養して、ＣｏｎＡでコーティングされたプレートに接着した線維芽細胞および他の非島細胞を島調製物から除去した。これらの培養条件下でプレートに接着しなかった島を収集し、そしてここでさらにｂＦＧＦおよびＥＧＦ（それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した同じ改変ＲＰＭＩ １６４０培地を含む１２ウェルプレート（ＣｏｎＡコーティングを伴わない）に移した。増殖因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを共に選択した。なぜならこれらの増殖因子は、脳の上衣に由来する神経幹細胞の増殖を刺激することが公知だからである（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９６、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１７５：１〜１３）。この島はプレートに接着し、そして細胞は、単層として徐々に島を離れて成長した（ヒト細胞において推定細胞倍加時間は４０〜４５時間）。生長中の単層の細胞は、表現型が相同であり（図９Ａ、パネル１）、そしてネスチンを発現した（図９Ａ、パネル２）。ラット細胞を単層から選び（少なくとも２０〜３０細胞群）、１２ウェルプレートにサブクローニングし、そしてｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む改変ＲＰＭＩ １６４０培地（１１．１ｍＭ グルコース）とともにインキュベートした。このサブクローニングされた細胞は急速に成長し、そして６日でコンフルエントとなり、推定細胞倍加時間は１２〜１５時間であり（図９Ａ、パネル３）、そして１２日までに波様構造を形成した。培養の１５〜１７日後、細胞は島様集団（ＩＬＣ）を形成した（図９Ａ、パネル４）。類似の細胞をヒト島からクローニングした（図９Ｂ）。コンフルエントな状態に達した際（図９Ｂ、パネル１）、このヒト細胞が移動して、皿中で大きな空胞構造を形成した（図９Ｂ、パネル２および３）。次いで大きな空間の輪郭を描く細胞は形態を変え、円形になり、そして互いに集合して３次元のＩＬＣを形成した（図９Ｂ、パネル４〜６）。
これらのＩＬＣを形成したこれらのネスチンポジティブな島前駆細胞（ＮＩＰ）の分化の指標は、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロットによって特徴付けられ、そしてこれらの細胞が内分泌マーカーであるＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）（Ｃｉｒｕｌｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１０７：１４２９〜３６）（図９Ｃ、右パネル）および導管細胞マーカーであるＣＫ１９（サイトケラチン１９）（Ｂｏｕｗｅｎｓら、１９９８、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１８４：２３４〜９；Ｂｏｕｗｅｎｓら、１９９５、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、４３：２４５〜５３；Ｂｏｕｗｅｎｓら、１９９４、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４３：１２７９〜９３）（図９Ｃ、左パネル）を発現することを見出した。研究のこの段階で、ＮＩＰがコンフルエントになり、そして島様細胞集団に集合したときに、ＮＩＰは膵臓遺伝子（ＮＣＡＭおよびＣＫ１９）を発現し始めたが、内分泌細胞への分化に不可欠な増殖因子の欠如のために島遺伝子の発現は限定されたことを結論付けた。前駆細胞集団の分化が、第一に増殖期、次いで分化特異的なモルフォゲン増殖因子の存在環境下での増殖の静止を代表的には必要とすることがまた認識された。従って培養条件を、場合によっては１１．１ｍＭ グルコース、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む培地を置換することによって（これは細胞の増殖を誘導する）、低グルコース（２．５ｍＭ）を含む培地で置換することによって（これは増殖を抑える）、そして因子ＨＧＦ／Ｓｃａｔｔｅｒ ＦａｃｔｏｒまたはベータセルリンおよびアクチビンＡを含む培地で置換することによって改変した。グルコースは、膵島β細胞に対する公知の増殖因子であり（Ｓｗｅｎｎｅ、１９９２、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３５：１９３〜２０１；Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ、１９８９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３８：４９〜５３）、そしてＨＧＦ／Ｓｃａｔｔｅｒ ＦａｃｔｏｒおよびアクチビンＡの両方は、膵臓導管細胞株ＡＲ４２Ｊをインスリン、グルカゴンおよび他の膵臓内分泌細胞タンパク質を産生する内分泌表現型に分化させることが示されている（Ｍａｓｈｉｍａら、１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７：３９６９〜７６；Ｍａｓｈｉｍａら、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：１６４７〜５４）。
ＩＬＣを含む培養物は、免疫細胞化学（図１０Ａ、上部パネル）、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット（図１０Ｂ）、ならびにウェスタン免疫ブロット（図１０Ｃ）によって、膵臓特異的なホメオドメインタンパク質、ＩＤＸ−１を発現した。ＩＬＣはまた、ＲＴ−ＰＣＲ（図１０Ｄ）によって観察されるようにプログルカゴンをコードするｍＲＮＡを発現し、そして免疫反応性のグルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１およびインスリンを産生した。いくつかのウェルにおける島様集団の培養の７２〜９６時間後に得られた培地の放射線免疫検定法は、４０〜８０ｐｇ／ｍｌ ＧＬＰ−１、３０〜７０ｐｇ／ｍｌ グルカゴン、２９〜４４ｐｇ／ｍｌ インスリンの値を与えた。放射線免疫検定法を、以下の通りに行った。
培養培地におけるインスリンおよびグルカゴンの濃度を、それぞれＬｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．およびＤＰＣ Ｉｎｃ．から購入した超高感度放射線免疫検定法キットによって決定した。それぞれのキットにおいて供給される抗血清は、モルモット抗ヒトインスリンおよびウサギ抗ヒトグルカゴンであった。ＧＬＰ−１分泌を、スカシ貝（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンに結合体化された合成ペプチド、ＣＦＩＡＷＬＶＫＧＲアミドとのウサギの免疫によって惹起された抗ヒトＧＬＰ−１（７〜３６）アミドウサギポリクローナル抗血清を用いて測定した。この抗血清は、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミドの検出に極めて特異的であり、そしてプログルカゴンを弱くしか検出しなかった。これらのアッセイについての感受性レベルは、それぞれ６ｐｇ／ｍＬ、１３ｐｇ／ｍＬおよび１０．２ｐｇ／ｍＬであった。
Ｒａｍｉｙａら（Ｒａｍｉｙａら、２０００、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、６：２７８〜２８２）によって記載されるように、１０ｍＭ ニコチンアミドにおける７日間のＩＬＣのインキュベーションは、インスリン分泌を２〜３倍増大した。
いくつかのさらなる膵臓マーカーは、図１５に示されるように、分化したＮＩＰ（例えばグルコース輸送体２（Ｗａｎｇら、１９９８）、シナプトフィジンおよびＨＧＦ（Ｍｅｎｋｅら、１９９９））において発現した。分化しているＮＩＰが膵臓外分泌組織の性質を有し得るか否かを決定するために、本発明者らはＲＴ−ＰＣＲを使用し、そしてアミラーゼおよびプロカルボキシペプチダーゼの発現を検出した（図１５）。
幹細胞を含むＮＩＰのいくつかの培養物はまた、ＲＴ−ＰＣＲによって観察されるように、プログルカゴンをコードするｍＲＮＡおよびインスリンをコードするｍＲＮＡを発現した（図１６ＡおよびＢ）。
ＩＤＸ−１の発現は特に重要であった。なぜならこれは、膵臓発生の主要な調節因子であることが認識され、そして特に、インスリンを産生する膵島β細胞の成熟および機能に必要とされることが認識されるからである（Ｓｔｏｆｆｅｒｓら、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８：１４５〜１５１）。
新しい島の新生がまた、特に新生児期（ラットおよびマウス）の間に（しかしある程度成体期を通じて）膵管における細胞の分化によって生じることが公知であるので（Ｂｏｎｎｅｒ−ｗｅｉｒら、１９９３、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４２：１７１５〜１７２０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９９５、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、４：３７１〜３８３；Ｂｏｕｗｅｎｓら、１９９６、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ、４２７：５５３〜５６０）、ネスチン発現を、成体ラットの膵管において分析した。ネスチンおよびサイトケラチン１９に対する抗血清を用いた二重蛍光免疫細胞化学によって、導管上皮のマーカーであるネスチンは、大きな導管および小さな導管の両方の局所領域において、ならびに外分泌腺房組織内のいくつかの中央小葉導管において強力に発現した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。珍しいことに、導管におけるネスチン発現の局所領域は、抗ＣＫ１９抗血清での染色をほとんど欠いた。さらに、導管におけるネスチンポジティブな細胞は、上皮細胞とは異なる形態を有するようであった。上皮細胞は、立方体様の丸い細胞の相同集団からなるが、一方ネスチンポジティブな細胞は、有核で蛇行状であり、そして上皮細胞の間または周囲の空間に存在するようであった（図１１Ｃ）。
従ってＣＫ１９は、ネスチンを発現する導管細胞の大多数において発現されず、膵管内に位置するこれらのネスチンを発現する細胞は、導管上皮細胞とは異なる細胞のパッセンジャー集団であり、そして導管表現型または内分泌表現型にまだ分化していない幹細胞であることを示唆した。成体ラット膵臓の膵管および膵島内のネスチンを発現する細胞の局所集団の発見は、ラット膵管は島細胞の前駆体である細胞を含むが（新生）、これらの前駆体はそれ自体は導管上皮細胞の部分集団ではないという考えをさらに支持した。
（実施例１３）
（真性糖尿病を有するヒト被験体においてＩＤＸ−１を発現するように操作された膵臓幹細胞の移植）
ブタまたはヒトのドナー膵臓、あるいは起こり得るヒト移植レシピエントの膵臓生検から単離された島を、幹細胞の生長を刺激する条件においてエキソビボで培養した。次いで幹細胞を島から単離し（クローニング）、ｂＦＧＦ−２、ＥＧＦおよび１１．１ｍＭ グルコースを含む増殖培地においてインビトロで拡張し、転写因子ＩＤＸ−１をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いてトランスフェクト／注入し、そして糖尿病レシピエントに移植した。あるいはＩＤＸ−１をトランスフェクトされた幹細胞を、操作された幹細胞のβ細胞への分化のプロセスを開始するために、移植前にＧＬＰ−１あるいは他の分化モルフォゲンまたは増殖因子で１〜３日間処理した。一実施態様において、幹細胞を、レシピエントに投与する前に拡張も分化もしないか、あるいはレシピエントに投与する前に拡張または分化のみ行った。一実施態様において、ＧＬＰ−１を、幹細胞の分化を刺激しそして首尾良い移植を促すために、移植の間および移植後数日間レシピエントに投与した。この方法に従って、異種移植（ブタ島）または同種移植（レシピエントではないヒトドナー由来のヒト島）、ならびに同系移植（レシピエント由来の島）を行った。宿主レシピエントへ移植された場合、幹細胞遺伝的レパートリーが、宿主が幹細胞を自己として認識する（異種移植または同種移植の場合において）ように再プログラムされて、その結果自己免疫（１型糖尿病）による免疫不寛容ならびに移植片拒絶および移植片破壊が生じないと仮定された。
（実施例１４）
（真性糖尿病を有するヒト被験体におけるＩＤＸ−１の発現を刺激するように培養された膵臓幹細胞の移植）
上記のように単離された島を、島内部に存在する幹細胞の拡張（増殖）を第一に刺激し、次いで転写因子ＩＤＸ−１の発現を刺激する条件において、数日間エキソビボで培養した。幹細胞の増殖を、ｂＦＧＦ−２、ＥＧＦおよび１１．１ｍＭ グルコースを含む培地において島を培養することによって達成した。ＩＤＸ−１発現の誘導を、ＧＬＰ−１および２ｍＭ グルコースの存在環境下でのインキュベーションによって達成した。記載される処理によってそのようにあらかじめ処理された島を、宿主レシピエントに移植した。さらに宿主レシピエントに、幹細胞をさらに拡張しそしてインスリン産生性細胞に分化させて移植の成功を増強するために、移植の間および移植後数日間ＧＬＰ−１を投与し得た。
この方法に従って、異種移植（ブタ島）、同種移植（レシピエントではないヒトドナー由来のヒト島）、ならびに同系移植（レシピエント由来の島）をもたらした。
（実施例１５）
（腎臓への膵臓幹細胞の異種移植）
ヒトのネスチンポジティブな島前駆細胞（ＮＩＰ）を記載されるように単離し、そして免疫抑制されていない８匹のＣ５７Ｂ１６マウスの腎被膜下に移植した。移植されたヒト細胞は、マウスレシピエントによって拒絶されなかった。現在の理解は、異種移植片（例えばヒト組織）は、５〜１０日以内にマウスによって拒絶されるということであった。現在の理解と反対に、本発明者らは、今まで試験された８匹の非免疫抑制マウスのうちの８匹において、すべての移植片が首尾良く移植され、そしておよそ１０５〜１０６細胞の移植後１ヶ月（３０〜３８日）までに腎臓の極を巻き込む大集団の組織に増殖した。
１匹のＣ５７Ｂ１６マウスを屠殺し、そして移植部位に広い領域の新しい成長を有することを決定した。新しい組織を有する腎臓の切片を、２つの断片に分割した。一方の断片を、凍結切片組織学について凍結し、そして他方の断片を、パラフィン切片組織学についてパラホルムアルデヒド中に固定した。凍結切片を調製し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ならびに種々の島細胞抗原に対する抗血清で染色した。
Ｈ＆Ｅ染色された腎臓切片の試験は、肝臓成分、神経成分、導管成分、脂肪（ａｄｉｐｏｄｉｐｉｃ）成分および造血成分を含む混合された間葉組織および上皮組織からなる多形態性の形態を示す腎臓の一部ではない新しい成長の存在を実証した。腎臓切片の顕微鏡写真は、新しい成長が、腎実質および糸球体に浸潤しているように見えたことが実証された。ヒト特異的（マウスではない）抗血清での特異的免疫染色は、ヒト特異的ケラチン、ビメンチンおよびヒト造血リンパ球に特異的なＣＤ４５白血球抗原について染色する免疫ポジティブな細胞の索を明らかにした。第二のＣ５７Ｂ１６マウスの腎臓はまた、ＮＩＰ移植の部位で類似の様相の新しい成長を有した。
Ｃ５７Ｂ１６マウス（屠殺されるべき第一のマウス）のＮＩＰ移植された腎臓のパラフィン切片を試験した。試験された組織塊は、腎臓の先端由来であり、そして外来組織が腎実質への「浸潤」の徴候を伴わずに腎被膜下に良好に含まれたことを示した。特に多形態性様相の移植片組織の間が、腎実質に類似した領域であった。理論に束縛されない１つの仮説は、移植片は分化しようとする幹細胞からなるということと、そしてこの幹細胞は「浸潤」しておらず、しかし単に移動し、増殖し、そしてニッシェを探している（すなわち間葉指令）ということであった。これらは、腎臓から合図を受け取り得、そして腎臓に分化しようとし得た。この移植片細胞は、悪性ではないようであるが、その機能を果たそうとするただの幹細胞であり得た。
（実施例１６）
（膵臓幹細胞の膵臓への異種移植）
ヒトのネスチンポジティブな島前駆細胞（ＮＩＰ）を、記載されるように単離し、そして免疫抑制されないマウスの膵臓、および（ａ）ストレプトゾトシン（ストレプトゾトシン誘導性糖尿病を産生するため）処理によって傷つけられたマウスの膵臓または（ｂ）炎症を伴う進行中の島が存在するＮＯＤマウスの膵臓へ移植した。
移植された動物の膵臓を、ＮＩＰがその適切なニッシェを見出すか否か、島領域から指令を受け取るか否か、そして島細胞（β細胞）に分化するか否かを決定するために試験した。
（実施例１７）
（膵臓幹細胞の異種移植による糖尿病の処置）
ヒト島を記載されるように単離し、そしてインビトロで数日間培養して、幹細胞集団を拡張した。ヒトＮＩＰを、門脈を介して肝臓に移植した（肝臓への移植について当該分野で周知の従来手順に従って）。
あるいはヒトＮＩＰの集団（記載されるように単離された）を、血流に導入した。特定の実施態様において、ヒトＮＩＰを、膵動脈を介して導入して、これらを糖尿病性膵臓へ導いた。
コントロール動物（移植を受けない動物）の集団および移植された動物の集団を、糖尿病の症状（例えば血液グルコースレベル、インスリンレベル、膵β細胞数）の改善について分析した。
（実施例１８）
（肝臓におけるネスチンポジティブな幹細胞の同定）
ラット肝臓を単離し、そして凍結切片を、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法に従って調製した。
ラット肝臓の凍結切片（６μＭ）を、ウサギポリクローナル抗ネスチン血清で免疫染色した。この免疫蛍光シグナルを、フルオロフォア、Ｃｙ３（黄色〜橙色）でタグ化された抗ロバＩｇＧ血清の反応によって見えるようにした。可能な大きい胆管を囲むネスチンポジティブな細胞を、図１３Ａに示した。いくつかの小さな胆管を囲むネスチンポジティブな細胞の集団を、図１３Ｂに示した。
（実施例１９）
（ＮＩＰの肝臓表現型への分化）
肝臓幹細胞（卵円形細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌｓ））、肝臓星状細胞および膵臓の前駆細胞との間の明白な共通の性質の報告、ならびにいくらかの損傷後に再生中の膵臓が肝臓化生を受けるという観察の報告のために（Ｓｌａｃｋ、１９９５；Ｒｅｄｄｙら、１９９１；Ｂｉｓｇａａｒｄら、１９９１；Ｒａｏら、１９９６）、本発明者らはＲＴ−ＰＣＲを行って、幹細胞における肝臓発現性遺伝子を検出した。ＰＣＲ産物を、ＸＢＰ−１（肝細胞発生に必要とされる転写因子（Ｒｅｉｍｏｌｄら、２０００））、およびトランスチレチン（肝臓急性期タンパク質）について得た。いくつかの他の肝臓マーカー（例えばαフェトプロテイン（Ｄａｂｅｖａら、２０００）、Ｅ−カドヘリン（Ｓｔａｍａｔｏｇｌｏｕら、１９９２）、ｃ−ＭＥＴ（Ｉｋｅｄａら、１９９８）、ＨＧＦ（Ｓｋｒｔｉｃら、１９９９）およびシナプトフィジン（Ｗａｎｇら、１９９８）；図１５を参照のこと）がまた発現された。膵臓および肝臓によって共有されるタンパク質（例えばＨＧＦおよびシナプトフィジン）の発現は、胚前腸内胚葉に由来する共通の起源を反映し得、そして膵臓表現型または肝臓表現型のいずれかへの分化を示し得た。
（実施例２０）
（ＮＩＰにおけるＧＬＰ−１Ｒシグナリング）
ＧＬＰ−１アミドの個々の単離されたＮＩＰへの適用は、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）のレベルを上昇させた。細胞を方眼のついたカバーグラス上にプレーティングして、ネスチン発現について試験するために、同じ細胞の引き続く免疫組織化学染色を可能にした。［Ｃａ２＋］ｉ記録が行われたすべての細胞は、ネスチンを発現することを示した。成熟β細胞とは対照的に、ＧＬＰ−１は、基礎的な（５．６ｍＭ）グルコースで［Ｃａ２＋］ｉレベルを刺激したが、高い（２０ｍＭ）グルコースの存在環境下においては効果がなかった（図２３、パネルＡ）。これらの効果を、フォルスコリンによって再現し（図２３、パネルＢ）、これはＧＬＰ−１の効果が、ＧｓおよびｃＡＭＰ産生の活性化（正常なベータ細胞において使用される同じシグナリング経路）を通じて媒介されることを示唆した。ペプチドＥｘｔｅｎｄｉｎ（９〜３９）（ＧＬＰ−１の特異的アンタゴニスト）での個々の単離されたＮＩＰの前処理は、ＧＬＰ−１によって媒介される［Ｃａ２＋］ｉの増大を妨げた（図２３、パネルＣおよびＤ）。ＧＬＰ−１ＲアンタゴニストであるＥｘｔｅｎｄｉｎ（９〜３９）の効果は、ＧＬＰ−１Ｒの同じアイソフォームが、β細胞のようにＮＩＰにおいて発現されることを示唆した。ＧＬＰ−１によって媒介される［Ｃａ２＋］ｉの増大は、細胞外（ｅｘｐｒｅｃｅｌｌｕｌａｒ）Ｌａ３＋（５μＭ）によって阻害され、これはＧＬＰ−１が、β細胞を脱分極するその公知の役割と一致して［Ｃａ２＋］ｉ流入を活性化したことを示唆した（図２３、パネルＥ）。本発明者らはさらに、トルブタミド（１００μＭ）が、ＮＩＰにおける［Ｃａ２＋］ｉ上昇を刺激することを実証し、これは細胞がＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを発現することを示した（図２３、パネルＦ）。これらのデータは、β細胞におけるその作用機構と一致して、ＧＬＰ−１誘導性の膜脱分極、およびＮＩＰにおける電圧依存性Ｃａ２＋チャネルの活性化と一致した。
（実施例２１）
（ＧＬＰ−１はＮＩＰのインスリン分泌性細胞への分化を誘導する）
以前の研究は、ＧＬＰ−１のインスリン指向性作用、ならびに部分膵切除ラットにおいてβ細胞新生を刺激する能力を実証した（Ｘｕら、１９９９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：２２７０）。ＮＩＰを島培養物から選び、そしてｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む増殖培地において３〜１０日間拡張した（継代０１）（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら、２００１ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：５２１）。特定の場合において、３〜５日間拡張されたＮＩＰＯを固定し、そして図２４Ａに示されるようにネスチン（Ｃｙ−３）およびインスリン（Ｃｙ−２）の免疫細胞化学検出に供した。この段階で、ＮＩＰはネスチンポジティブでありそしてインスリンネガティブであることが見出された。ＮＩＰ培養物を７〜１０日間拡張し、次いでＧＬＰ−１またはその安定なアナログであるｅｘｔｅｎｄｉｎ−４のいずれかで処理した場合、細胞の部分集合は、インスリンポジティブ（Ｃｙ−２；図２４Ｂ、パネル３、５および６）、およびＩｄｘ−１ポジティブ（Ｃｙ−３；図２４Ｂ、パネル７）ならびにネスチンネガティブ（Ｃｙ−３；図２３Ｂ、パネル４）になった。培養物をＧＬＰ−１で処理した場合、ネスチン発現は総体的に減少した（図２４Ｂ、パネル２対４）。従ってＥｘｔｅｎｄｉｎ−４での処理は、インスリン分泌の２〜３倍の増大を誘導した（図２５）。しかしいくつかの培養ウェルにおいて、コンフルエントな状態だけで、少量のインスリン分泌を開始するのに十分であった。
ホメオドメインタンパク質、Ｉｄｘ−１は、膵臓発生に重大であり、そしてインスリン遺伝子の転写調節において重要な役割を果たした。Ｉｄｘ−１発現の単独誘導欠損（ｈａｐｌｏｉｎｄｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、早期発症の２型糖尿病の形態をもたらし（ＭＯＤＹ４）、そしてＩｄｘ−１の遺伝性アミノ酸変化は、後期発症の２型糖尿病に関連した。Ｉｄｘ−１は、分化したＮＩＰ細胞集団において発現された。
繰り返し継代されたヒトＮＩＰは、ＧＬＰ−１に応答してインスリンを分泌する能力を失った。しかしヒトＩｄｘ−１ ｃＤＮＡをコードする発現ベクターを用いたこれらの細胞のトランスフェクトによって、ＧＬＰ−１反応性になり、そしてＮＩＰの部分集合においてインスリンの合成を誘導した（図２６、パネル１）。興味深いことに、ＧＬＰ−１処理を行わないＩｄｘ−１でのＮＩＰ（継代９）のトランスフェクションは、インスリン生合成を誘導しなかったが（図２６、下部パネルＢ）、Ｉｄｘ−１発現レベルを刺激した（図２６、上部パネルＢ）。総合すれば、これらの結果は、ＧＬＰ−１が、ＮＩＰ細胞におけるＩｄｘ−１発現のレベルを刺激し、そしてＩｄｘ−１の臨界閾値濃度が、ＮＩＰがインスリン産生性細胞に転換されるのに必要とされることを示唆し、従って島細胞分化におけるＧＬＰ−１Ｒについての役割を示唆した。
（実施例２２）
（組織／器官移植片の有望な宿主レシピエントにおいて免疫寛容状態をあらかじめ誘導するためのＮＩＰの使用のための方法）
ＮＩＰを、潜在的な器官ドナーに対して寛容状態をあらかじめ誘導するために使用した。最近公表された報告は、ドナーから移植レシピエントへの幹細胞の移植は、どの免疫抑制剤も必要とせずにドナー由来の移植片に対する寛容を誘導し得ることを示した（例えばＦａｎｄｒｉｃｈら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、Ｆｅｂ ２００２、８：１７１；Ｑｕａｉｎｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３ Ｊａｎ ２００２、３４６：５；Ｋｏｒｂｌｉｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、７ Ｍａｒ ２００２、３４６：７３８を参照のこと）。本明細書中に記載される手順は、これらの報告を確証し、そしてドナーからレシピエントへの器官移植の前に、潜在的な器官ドナーに対して免疫寛容状態をあらかじめ誘導するというＮＩＰの新規の使用を実証した。
この方法に従って、組織生検を、有望なヒトドナーの膵臓または肝臓から得た。ヒトのネスチンポジティブな細胞（ＮＩＰ）を、記載されるように単離しそしてインビトロで拡張して、ＮＩＰまたはＮＩＰに等価な幹／前駆細胞を作製した。次いでこれらのＮＩＰを、皮下注入または静脈内注入のいずれかを介して免疫学的に応答性のレシピエントに投与した。４〜８週間後、組織標本を、針生検またはパンチ生検によって得た。ゲノムＰＣＲおよびドナー特異的プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションは、移植されたヒトＮＩＰは、レシピエントの複数の器官にコロニー形成し、そして微小な／混成のキメラ現象の状態を生成し、これが免疫寛容状態を誘導したことを示した。レシピエントによるヒト組織移植片の受容は、移植された幹／前駆細胞の樹状抗原提示細胞への分化から生じ、そのためレシピエントの免疫系を誘導して、移植されたヒト組織を自己として認識したと考えられた。ドナー組織に対するレシピエントにおける免疫寛容の誘導の成功は、ドナーから皮膚生検材料を採取することによって、そしてレシピエントの皮膚上にその生検材料を移植することによって確認され、そしてレシピエントはドナーの皮膚移植片を拒絶しないことを示した。ドナーに対する免疫寛容状態の誘導の確認後、ＮＩＰ移植片を外科的に除去した。次いでドナー由来の器官（腎臓、心臓、肝臓、膵臓）を、移植された器官の拒絶を招くことなくレシピエントに移植した。この器官の予備移植プロトコルは、レシピエントの免疫系を奪い取って、移植された器官を自己として認識し、従って強力であるが毒性の免疫抑制剤についての必要性を不要にした。
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Ｒａｏ．Ｍ．Ｓ．ら、１９９６．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ ６：１５〜２２．
Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ｋ．ら、１９９１．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ．Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３６：５０２〜５０９．
Ｒｅｉｍｏｌｄ，Ａ．Ｍ．ら、２０００ Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＸＢＰ−１．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１５２〜７．
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．およびＷｅｉｓｓ，Ｓ．１９９６．Ｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ａｎ ＥＧＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ＣＮＳ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｓ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７５：１〜１３．
Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎら、１９９５．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｎｏｎａｂｌａｔｅｄ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ ８６（３）：１２１８〜１２２７．
Ｓｋｒｔｉｃ，Ｓ．ら、１９９９．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＨＧＦ） ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３０：１１５〜１２４．
Ｓｌａｃｋ，Ｊ．Ｍ．Ｗ．、１９９５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２１：１５６９〜１５８０．
Ｓｔａｍａｔｏｇｌｏｕ，Ｓ．Ｃ．ら、１９９２．Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１６：１５０７〜１５１５．
Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、１９９８．ＧＬＵＴ２ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ：ｃｒｕｃｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：５０〜５６．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ａ．１９９０．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２２９．
（他の実施態様）
他の実施態様は、添付の特許請求の範囲内である。
図１Ａおよび１Ｂは、１６日胚（図１Ａ）および生後６０日目（図１Ｂ）のラット膵島の二重蛍光免疫細胞化学染色を示す。ネスチンに対する抗体での免疫染色を白色で示し（オリジナルでは赤色、フルオロフォアとしてＣｙ３を使用）、そしてインスリンに対する抗体での免疫染色を灰色で示す（オリジナルでは緑色、フルオロフォアhとしてＣｙ２を使用）。 図２は、５０のラットの島から得られたｍＲＮＡを用いて行われたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを示す。８３４ｂｐの１本のバンドを配列決定し、そして実質的にネスチンに対する配列として同定した。 図３は、培養されたラットの島から外へ増殖したネスチンポジティブな細胞を示す。 図４は、培養物中での島様構造の発生を示す。 図５は、培養物中で作製された島様構造のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＮＣＡＭの発現およびサイトケラチン−１９（ＣＫ１９）の発現を検出した。 図６は、高グルコースによるネスチンｍＲＮＡ発現の刺激を示す。ＡＰＲＴをコントロールとして試験した。 図７Ａは、ネスチンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。 図７Ｂは、ネスチンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。 図７Ｃは、ネスチンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。 図８は、免疫細胞化学またはＲＴ−ＰＣＲによって決定されるように、膵島内部の独特の細胞集団における神経幹細胞特異的なマーカーであるネスチンの発現を示す。 図９は、免疫細胞化学およびＲＴ−ＰＣＲによって膵臓から単離された幹細胞におけるネスチンのキャラクタリゼーションを示す。 図１０は、ネスチンポジティブな島前駆細胞（ＮＩＰ）に由来するヒト島様集団におけるホメオドメインタンパク質ＩＤＸ−１およびプログルカゴンの発現を示す。 図１１は、ラット膵臓の導管の局在化領域に対するネスチンポジティブな細胞の局在性を実証する。 図１２は、島の内分泌細胞の前駆体である膵管細胞の起源についての別のモデルを示す。 図１３ＡおよびＢは、ネスチンポジティブな肝臓幹細胞の免疫蛍光染色を示す。 図１４は、マウス内分泌膵臓の発生の間の転写因子の順次出現を示す。 図１５は、幹細胞を含むヒトＮＩＰ培養物中の神経内分泌の発現、外分泌膵臓マーカーの発現および肝臓マーカーの発現を示す。 図１６は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるようなプログルカゴンｍＲＮＡの発現およびインスリンｍＲＮＡの発現、ならびにインスリン分泌を示す。 図１７は、ＮＩＰマーカーを示す。 図１８は、ヒトＡＢＣＧ２の核酸配列（ａ）およびアミノ酸配列（ｂ）を示す。 図１９ａは、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロットハイブリダイゼーションによるＡＴＰ結合カセット輸送体ＡＢＣＧ２の発現を示す。図１９ｂは、ネスチンポジティブな島由来の前駆細胞（ＮＩＰ）が、ヘキスト３３３４２染色によって実証されるようにかなりの数のＳＰ細胞を有することを実証する。図１９ｃは、ＳＰ細胞からの染料流出が、ベラパミルの存在環境下で阻害されることを実証する。ＳＰゲート細胞は、Ｂにおいて分析された細胞の総数の２．１％であるのに対し、Ｃにおいては０．１％である。 図２０は、ＦＡＣＳによって単離されたＳＰ細胞が、高レベルのＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１およびネスチンを共発現することを実証する。図２０Ａは、ＳＰ細胞および非ＳＰコントロール細胞が、ヘキスト３３３４２染色後にＦＡＣＳによって単離されたことを示す（それぞれＲ１およびＲ２）。図２０Ｂは、この細胞が、ＲＴ−ＰＣＲによってＡＢＣＧ２ ＲＮＡ、ＭＤＲ１ ＲＮＡ、ネスチンＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ ＲＮＡの発現について分析されたことを実証する。ＡＢＣＧ２およびＭＤＲ１に対するＰＣＲ産物の同一性を、サザンブロットハイブリダイゼーションによって確認した。 図２１は、ヒトＧＬＰ−１Ｒの核酸配列（２１Ａ）およびアミノ酸配列（２１Ｂ）を示す。 図２２は、膵島由来の幹／前駆細胞に対するＧＬＰ−１Ｒの発現を示す。パネルＡは、ＧＬＰ−１Ｒの免疫細胞化学検出（Ｃｙ−３）およびＤＡＰＩで染色された核を示す。パネルＢは、ＧＬＰ−１Ｒに特異的なプライマーを用いてＮＩＰから調製されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。 図２３は、ネスチンポジティブなＮＩＰにおけるＣａ２＋流入のＧＬＰ−１（７〜３６）アミド刺激およびトルブタミド刺激を示す。 図２４は、ＧＬＰ−１誘導性分化を実証するＮＩＰの免疫組織化学染色を示す。パネルＡは、ネスチンおよびインスリンの免疫組織化学同定を示す。パネルＢは、細胞をＧＬＰ−１でチャレンジした後のネスチンおよびインスリンの免疫組織化学染色を示す。 図２５は、ＧＬＰ−１でチャレンジされたＮＩＰ培養物からのインスリン分泌レベルを示す。 図２６は、ヒトＩｄｘ−１でトランスフェクトされたＮＩＰ培養物におけるインスリン発現の免疫組織化学分析を示す。

Claims (89)

  1. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞がインスリン産生性細胞に分化するような該幹細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  2. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞がインスリン産生性細胞に分化するような該幹細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  6. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項１または５に記載の方法。
  7. 上記移植ステップの前に、上記幹細胞が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子でエキソビボ処理されることを特徴とする請求項１または５に記載の方法。
  8. 上記移植ステップが、内視鏡的逆行性注入を介して行われることを特徴とする請求項１または５に記載の方法。
  9. 請求項１または５に記載の方法であって、
    （ｃ）上記患者を免疫抑制剤で治療するステップ、
    をさらに含むことを特徴とする方法。
  10. 上記免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡＤ６５抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）インスリン産生性β細胞に分化するような該前駆細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  12. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  14. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  15. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）インスリン産生性β細胞に分化するような該前駆細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  16. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項１１または１５に記載の方法。
  17. 上記拡張ステップが、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子の存在環境下で行われることを特徴とする請求項１１または１５に記載の方法。
  18. 上記移植ステップが、内視鏡的逆行性注入を介して行われることを特徴とする請求項１１または１５に記載の方法。
  19. 請求項１１または１５に記載の方法であって、
    （ｄ）上記患者を免疫抑制剤で治療するステップ、
    をさらに含むことを特徴とする方法。
  20. 上記免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡＤ６５抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  21. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞を拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）培養物中の該前駆細胞を分化させて偽島様集団を形成するステップと、
    （ｄ）該偽島様集団を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  22. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  24. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  25. 真性糖尿病を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞を拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）培養物中の該前駆細胞を分化させて偽島様集団を形成するステップと、
    （ｄ）該偽島様集団を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  26. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項２１または２５に記載の方法。
  27. 上記拡張ステップが、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される因子の存在環境下で行われることを特徴とする請求項２１または２５に記載の方法。
  28. 上記移植ステップが、内視鏡的逆行性注入を介して行われることを特徴とする請求項２１または２５に記載の方法。
  29. 請求項２１または２５に記載の方法であって、
    （ｅ）上記患者を免疫抑制剤で治療するステップ、
    をさらに含むことを特徴とする方法。
  30. 上記免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡＤ６５抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
  31. 膵島から幹細胞を単離する方法であって、
    （ａ）膵島をドナーから取り出すステップと、
    （ｂ）該膵島由来の細胞を培養するステップと、
    （ｃ）該培養物からネスチンポジティブなクローンを選択するステップと、
    を含む方法。
  32. 上記ネスチンポジティブなクローンがまたＡＢＣＧ２ポジティブなクローンであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
  33. 上記ネスチンポジティブなクローンがまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
  34. 上記ネスチンポジティブなクローンが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
  35. 膵島から幹細胞を単離する方法であって、
    （ａ）膵島をドナーから取り出すステップと、
    （ｂ）該膵島由来の細胞を培養するステップと、
    （ｃ）該培養物からＡＢＣＧ２ポジティブなクローンを選択するステップと、
    を含む方法。
  36. 前記培養ステップが、第一にコンカナバリンＡでコーティングされた容器中で行われ、次いで再びコンカナバリンＡでコーティングされない容器中で行われることを特徴とする請求項３１または３５に記載の方法。
  37. 請求項３１または３５に記載の方法であって、
    （ｄ）ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される１の因子での処理によって、上記ネスチンポジティブなクローンを拡張するさらなるステップ、
    を含むことを特徴とする方法。
  38. 請求項３５に記載の方法であって、
    （ｄ）ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される１の因子での処理によって、上記ＡＢＣＧ２ポジティブなクローンを拡張するさらなるステップ、
    を含むことを特徴とする方法。
  39. 膵臓前駆細胞へのネスチンポジティブな膵臓幹細胞の分化を誘導する方法であって、
    ネスチンポジティブな膵臓幹細胞を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される１の因子で処理することによって、該幹細胞を引き続き膵臓前駆細胞に分化させるステップ、
    を含む方法。
  40. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブなクローンであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  41. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  42. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  43. 膵臓前駆細胞へのＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞の分化を誘導する方法であって、
    ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞を、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される１の因子で処理することによって、該幹細胞を引き続き膵臓前駆細胞に分化させるステップ、
    を含む方法。
  44. 前記膵臓前駆細胞が引き続き偽島様集団を形成することを特徴とする請求項３９または４３に記載の方法。
  45. 神経幹細胞ではない、単離されたネスチンポジティブなヒト膵臓幹細胞または単離されたネスチンポジティブなヒト肝臓幹細胞。
  46. 上記細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項４５に記載の単離された幹細胞。
  47. 上記細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項４５に記載の単離された幹細胞。
  48. 上記細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項４５に記載の単離された幹細胞。
  49. 神経幹細胞ではない、単離されたＡＢＣＧ２ポジティブなヒト膵臓幹細胞または単離されたＡＢＣＧ２ポジティブなヒト肝臓幹細胞。
  50. 上記細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項４９に記載の単離された細胞。
  51. 上記細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項４９に記載の単離された細胞。
  52. 上記細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項４９に記載の単離された幹細胞。
  53. 分化してインスリン産生性β細胞を形成することを特徴とする請求項４５または４９に記載の単離された幹細胞。
  54. 分化してグルカゴン産生性α細胞を形成することを特徴とする請求項４５または４９に記載の単離された幹細胞。
  55. 分化して偽島様集団を形成することを特徴とする請求項４５または４９に記載の単離された幹細胞。
  56. 分化して肝細胞を形成することを特徴とする請求項４５または４９に記載の単離された幹細胞。
  57. 膵細胞を幹細胞として同定する方法であって、
    細胞を標識されたネスチン特異的抗体と接触させることによって、該細胞が該抗体で標識されるようになる場合に該細胞が幹細胞として同定されるステップ、
    を含む方法。
  58. 細胞を、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーに結合する標識された抗体と接触させることによって、該細胞が該抗体で標識されるようになる場合に該細胞が幹細胞として同定されるステップ、
    をさらに含むことを特徴とする請求項５７に記載の方法。
  59. 上記細胞を、標識されたサイトケラチン−１９特異的抗体と接触させることによって、該細胞が該抗体で標識されるようにならない場合に該細胞が幹細胞として同定されるステップ、
    をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  60. 上記細胞を、標識されたＩＶ型コラーゲン特異的抗体と接触させることによって、該細胞が該抗体で標識されるようにならない場合に該細胞が幹細胞として同定されるステップ、
    をさらに含むことを特徴とする請求項５７に記載の方法。
  61. 上記細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーに結合する標識された抗体と接触させることによって、該細胞が該抗体で標識されるようにならない場合に該細胞が幹細胞として同定されるステップ、
    をさらに含むことを特徴とする請求項５７に記載の方法。
  62. 肝細胞に分化するようにネスチンポジティブな膵臓幹細胞を誘導する方法であって、
    該ネスチンポジティブな膵臓幹細胞を、肝細胞、または肝細胞に分化する前駆細胞に分化するように該幹細胞を誘導する有効量の因子で処理するステップ、
    を含む方法。
  63. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
  64. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
  65. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項６２に記載の方法。
  66. 肝細胞に分化するようにＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞を誘導する方法であって、
    該ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞を、肝細胞、または肝細胞に分化する前駆細胞に分化するように該幹細胞を誘導する有効量の因子で処理するステップ、
    を含む方法。
  67. 上記因子がサイクロパミンであることを特徴とする請求項６２または６６に記載の方法。
  68. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞が肝細胞に分化するような該幹細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  69. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
  70. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
  71. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項６８に記載の方法。
  72. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞が肝細胞に分化するような該幹細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  73. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項６８または７２に記載の方法。
  74. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）該前駆細胞が肝細胞に分化するような該前駆細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  75. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
  76. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
  77. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
  78. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張して前駆細胞を産生するステップと、
    （ｃ）該前駆細胞が肝細胞に分化するような該前駆細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  79. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項７４または７８に記載の方法。
  80. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）エキソビボで該幹細胞を分化させて肝細胞を産生するステップと、
    （ｃ）該肝細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  81. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまたＡＢＣＧ２ポジティブであることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
  82. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞がまた、Ｏｃｔ３／４、ＧＬＰ−１レセプター、ラトロフィリン（２型）、Ｈｅｓ−１、ネスチン、インテグリンサブユニットα６およびβ１、Ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１、ＳＵＲ−１またはＫｉｒ６．２からなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つについてポジティブであることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
  83. 上記ネスチンポジティブな膵臓幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択されるマーカーのうちの少なくとも１つを発現しないことを特徴とする請求項８０に記載の方法。
  84. 肝臓疾患を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）ＡＢＣＧ２ポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）エキソビボで該幹細胞を分化させて肝細胞を産生するステップと、
    （ｃ）該肝細胞を該患者に移植するステップと、
    を含む方法。
  85. 上記患者が、上記のステップａの幹細胞に対する上記ドナーとして役立つことを特徴とする請求項８０または８４に記載の方法。
  86. 生理学的に適合性のキャリアと混合された請求項４５に記載の単離された幹細胞を含む薬学的組成物。
  87. 生理学的に適合性のキャリアと混合された請求項４６に記載の単離された幹細胞を含む薬学的組成物。
  88. 生理学的に適合性のキャリアと混合された請求項４９に記載の単離された幹細胞を含む薬学的組成物。
  89. 哺乳動物における器官移植の前に免疫寛容状態をあらかじめ誘導する方法であって、
    （ａ）ネスチンポジティブな膵臓幹細胞をドナーの膵島から単離するステップと、
    （ｂ）該ネスチンポジティブな膵臓幹細胞を移植レシピエントに移植するステップと、
    （ｃ）該ドナーの幹細胞に対して該レシピエントにおいて免疫寛容状態を誘導するステップと、
    （ｄ）免疫抑制剤の投与を伴わずに、該ドナーから該レシピエントに器官を移植するステップと、
    を含む方法。
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