JP7329265B2 - ヒト多能性成人幹細胞 - Google Patents

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Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法に基づく利益を主張するものである。２０１８年９月２１日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／７３４，７４０の§１１９（ｅ）の内容は、参照により全体として本開示に組み込まれている。
幹細胞ベースの治療法は、重大疾患や怪我の治療に大きな期待が寄せられている。幹細胞の自己再生能力と分化能力は、損傷細胞、組織または臓器の修復、置換または再生を助ける大きな可能性を秘めている。現在、様々な種類の幹細胞が前臨床試験や臨床試験で研究されている。その中には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成人組織から単離された幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）など）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）、および上記の他の細胞源から分化して得られる様々な特異性細胞などが含まれている。
多能性幹細胞は、他の多能性または一能性体性幹細胞の提供源と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの強固な自己再生能力と、３種の胚性胚葉の誘導体に分化する能力である「多能性」という点で、様々な利点を提供する。現在の多能性幹細胞の例には、ＥＳＣおよびｉＰＳＣが含まれている。ヒトＥＳＣについては、患者に適合したＥＳＣの作製は実現可能性がないため、倫理的問題、腫瘍性、免疫拒絶反応など、細胞治療への利用を妨げる多くの問題がある。倫理的問題や免疫拒絶反応など、これらの問題の一部は、患者自身の細胞から直接得られるｉＰＳＣによって回避できる可能性があるが、ｉＰＳＣの派生の腫瘍性および低頻度性はまだ解決されていない。そのため、幹細胞治療においては、所望の安全性、有効性、臨床使用のための培養拡大の実現可能性を備えた成人組織由来のヒト多能性幹細胞の供給源が求められている。
幹細胞治療の主な課題の１つは、動物モデルを用いた幹細胞の研究を、ヒトに応用することである。例えば、マウスＥＳＣが初めてマウスに単離されて研究されたのは８０年代初期のことであるが、１９９８年になって初めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚性幹細胞を単離および培養する技術が研究者に開発され、画期的な成果が得られた。マウスはヒトの生物学を研究する上で最も重要なモデル生物と考えられているが、マウスの幹細胞とヒトの幹細胞は大きく異なる可能性がある。マウスＥＳＣとヒトＥＳＣの間には、分子シグネチャ、シグナル伝達経路、コロニーの形状、成長速度、表面マーカ、発達可能性など、基本的な差異が存在する。
そのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡張可能、分化効率が高い、非腫瘍化であり、ヒト成人組織から単離されたヒト多能性幹細胞の同定が求められている。また、これらのヒト多能性幹細胞を細胞ベースの治療法のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するプロトコルの確立が求められている。このようにヒト成人組織から単離された多能性幹細胞は、組織損傷や慢性疾患、加齢に関連する疾患を治療する実用的な細胞ベースの治療への道を開くものである。
ヒト成人組織から拡張性のある多能性幹細胞を同定し、それらをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するプロトコルを確立することは、組織損傷や慢性および加齢に関連する疾患の治療のための実用的な細胞ベースの治療への道を開くものである。
本開示は、（１）少なくとも一部分の赤血球を血液サンプルから除去することと、（２）３，０００ｘｇ－１５，０００ｘｇでサンプルを遠心分離してペレットを取得することと、（３）ペレット内の細胞を溶液に懸濁させることと、（４）ＣＤ４９ｆ＋細胞を溶液中で濃縮することとを備える、細胞集団を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、溶液中の細胞の少なくとも４０％が、ＣＤ４９ｆを発現し、６μｍ未満の直径を有するＣＤ４９ｆ＋細胞である。いくつかの態様においては、サンプルは５，０００ｘｇ、６，０００ｘｇ、または７，０００ｘｇ超で遠心分離される。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＳＳＥＡ４に陽性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＡＢＣＧ２およびＬｉｎに陰性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＣＤ７３およびＣＤ４５に陽性であって、ＣＤ４およびＬｉｎ２８に陰性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ３１、ＣＤ１１７、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカをさらに発現する。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４１からなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない。いくつかの態様においては、前記細胞の２０％未満が、赤血球である。
前記細胞の少なくとも４０％が、ＣＤ４９ｆを発現し、６μｍ未満の直径を有するＣＤ４９ｆ＋細胞である、少なくとも１０００個の細胞を含む組成物も提供される。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＳＳＥＡ４に陽性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＡＢＣＧ２およびＬｉｎに陰性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＣＤ７３およびＣＤ４５に陽性であって、ＣＤ４およびＬｉｎ２８に陰性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ３１、ＣＤ１１７、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカをさらに発現する。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４１からなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない。いくつかの態様においては、前記細胞の２０％未満が、赤血球である。いくつかの態様においては、ＣＤ４９ｆ＋細胞が、１または複数の因子を含む培地によって活性化されることができ、ならびに、活性化された細胞はＡＢＣＧ２を発現する。
複数のヒト細胞を、初代肝細胞および肝細胞株からなる群から選択された少なくとも１つと接触している、またはこれによって馴化された培地で培養することを含む、細胞を培養する方法も提供される。いくつかの態様においては、前記肝細胞株は、肝細胞癌由来の細胞株、不死化肝細胞、トランスジェニック動物から単離した不死化肝細胞、肝細胞／肝細胞癌ハイブリッド細胞、遺伝子操作された肝細胞、肝細胞前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が（ａ）６μｍ未満の直径を有し、および（ｂ）ＣＤ４９ｆ＋細胞である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＳＳＥＡ４に陽性である。いくつかの態様においては、前記ＣＤ４９ｆ＋細胞は、さらにＡＢＣＧ２およびＬｉｎに陰性である。いくつかの態様においては、培養後の細胞は、ＡＢＣＧ２を発現する。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、１または複数の幹細胞型を含む。
本開示は、ＣＤ４９ｆを表現し、Ｌｉｎを発現しない、単離したヒト細胞をさらに提供する。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、ＡＢＣＧ２に陽性であることをさらに特徴とする。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、ＳＳＥＡ４に陽性であることをさらに特徴とする。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＣＤ７３およびＣＤ１０５に陽性であることをさらに特徴とする。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、ＣＤ４５、ＣＤ１４および／またはＣＤ１９を発現しな。いくつかの態様においては、前記ヒト細胞が、１または複数の因子を含む培地で一定期間培養された後、コロニーに発達する。本明細書に開示されるように、前記細胞の集団も提供される。
（ａ）直径が６μｍ未満であり、（ｂ）ＣＤ４９ｆを発現し、および（ｃ）ＡＢＣＧ２を発現しないヒト細胞の集団に由来する幹細胞であって、前記幹細胞の集団が、ＡＢＣＧ２を発現し、異種細胞の集団である、幹細胞も提供される。本明細書で開示されるように、本開示の実施形態は、幹細胞から分化した細胞も提供する。
前記細胞の少なくとも４０％が、ＣＤ４９ｆおよびＡＢＣＧ２を発現し、Ｌｉｎを発現しない、少なくとも１０００個の細胞を含む、組成物も提供される。いくつかの態様においては、前記細胞の前記少なくとも４０％が、さらにＣＤ７３および／またはＳＳＥＡ４に陽性である。いくつかの態様においては、前記細胞の前記少なくとも４０％が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、および／またはＣＤ１０５に陽性であることをさらに特徴とする。
本明細書で開示されるように、初期段階の前駆体および／または幹細胞を医薬学的に許容可能な担体または賦形剤に含む組成物も提供される。本明細書で開示されるように、いくつかの実施形態において、分化した細胞を医薬学的に許容可能な担体または賦形剤に含む組成物も提供される。それを必要とするヒト被験者の疾患または病状を治療する方法であって、有効量の組成物をヒト被験者に本明細書に開示されるように投与することを含む方法も提供される。
ヒト末梢血から単離された初期段階の前駆体を含む細胞集団の顕微鏡写真を示す図である。
活性化／発達システムに播種した後の初期段階の前駆体の核染色を示す図である。
活性化／発達システムで培養されている初期段階の前駆体における初期段階マーカの発現を示す図である。 活性化／発達システムで培養されている初期段階の前駆体における初期段階マーカの発現を示す図である。 活性化／発達システムで培養されている初期段階の前駆体における初期段階マーカの発現を示す図である。 活性化／発達システムで培養されている初期段階の前駆体における初期段階マーカの発現を示す図である。
活性化／発達システムにおける初期段階の前駆体の成長と拡大を示しす図である。
活性化／発達システムにおける初期段階の前駆体に由来する幹細胞コロニーの形成を示す図である。
ヒト初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞で治療された場合、免疫不全マウスの創傷治癒が促進されたことを示す図である。
本開示の全体にわたって、様々な出版物、特許、公開特許明細書が本明細書で参照されている。これらの出版物、特許、公開特許明細書の開示内容は、参照によりその全体が本開示に組み込まれている。
組成物および方法を説明する前に、本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞株、アッセイ、および試薬に限定されるものではなく、これらは変化する可能性があることを理解されたい。また、本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されたい。
本発明の実施にあたっては、特に明示のない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡなど、当該技術分野における従来の技術を採用する。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌの編著を参照。
Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition;
the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology;
the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);
MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press);
MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach;
Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual;
Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition;
Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis;
U.S. Patent NO. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization;
Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization;
Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation;
Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986));
Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning;
Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory);
Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London);
Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002));
Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987));
the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995));
Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual;
Harlow and Lane, eds. (1999) Using Antibodies, A Laboratory Manual;
Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987));
Zigova, Sanberg and Sanchez-Ramos, eds. (2002) Neural Stem Cells.
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、分子量などのすべての数値表示は、範囲を含んで近似値であり、必要に応じて０．１または１の増分で（＋）または（－）に変化する。常に明示的に記述されるわけではないが、すべての数値表示には、「約」という用語が先行することを理解されたい。「約」という用語には、「Ｘ＋０．１または１」や「Ｘ－０．１または１」など、適切な場合には「Ｘ」の小さな増分に加えて、正確な値「Ｘ」も含まれる。また、必ずしも常に明示されていないが、本明細書に記載されている試薬は単なる例示であり、その同等物が当技術分野において知られていることも理解されたい。
１．定義
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において使用されるように、以下の用語は、以下の意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形の「１つ」、「一」、および「当該」は、文脈上明らかに別途規定されない限り、複数の参照語を含む。したがって、例えば、参照として、「１つの細胞」という表現は、複数の細胞（その混合物を含む）を含む。
本明細書において使用されるように、「備える」または「備え」という用語は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味するように意図している。「基本的に成る」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、記述される目的のための組み合わせにとって何らかの本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書において定義される要素から基本的に成る組成物は、請求される基本的かつ新規の特性に実質的な影響を与えない他の材料または段階を除外しないであろう。「から成る」は、微量以上の他の成分元素と、方法の実質的な段階とを除外することを意味するものとする。これらの転換語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
本明細書において使用されるように、「単離」という用語は、細胞およびその他の構成要素から分離されたことを意味し、その中には、自然界で通常関連付けられている細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が含まれている。例えば、単離したポリヌクレオチドは、本来の自然環境、例えば染色体上で通常関連している３'および５'の連続したヌクレオチドから分離される。当業者には明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、天然に存在する対応物と区別するために「単離」する必要はない。単離した細胞とは、表現型または遺伝子型の異なる組織または細胞から分離された細胞のことである。
本明細書において使用されるように、「幹細胞」は、培養中に不定期に分裂し、特異性細胞を生み出す能力を有する細胞と定義される。幹細胞型の非限定的な例としては、体性（成人）幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞（Ｃｉｂｅｌｌｉら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５（５５５６）：８１９；米国特許公開第２０１０００６９２５１号および第２００８０２９９０９１号を参照）、および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）が挙げられる。体性幹細胞とは、分化した組織に存在する未分化細胞で、自己更新（クローン化）し、（一定の制限の下で）分化して元の組織から由来するすべての特異性細胞種類を生み出すことができる。胚性幹細胞とは、胚から採取される原始的な（未分化な）細胞で、様々な特異性細胞種類になる可能性を有する。胚性幹細胞の非限定的な例としては、ＥＳＩ社（シンガポール）から入手可能なＨＥＳ２（ＥＳ０２とも呼ばれる）細胞株や、ＷｉＣｅｌｌ社（マディソン、ＷＩ）から入手可能なＨ１またはＨ９（ＷＡ０１とも呼ばれる）細胞株が挙げられる。追加の細胞株はＮＩＨの審査を待っている。例えば、ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ．ｈｔｍ（最終アクセス日：２０１７年３月１３日）を参照。多能性胚性幹細胞は、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＣＤ３０、ＴＤＧＦ－１、ＧＣＴＭ－２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、胚芽細胞核因子、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を含むマーカを使用することで、他型の細胞と区別できるが、これらに限定されるものではない。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）とは、非多能性細胞、典型的には成人体細胞から人工的に得られた幹細胞であって、１または複数の幹細胞特定の遺伝子の発現を誘導することにより作製される。ｉＰＳＣは、オクタマ転写因子のファミリー、例えば、Ｏｃｔ－３／４；Ｓｏｘ遺伝子のファミリー、例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８；Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５；Ｍｙｃ遺伝子のファミリー、例えば、ｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃ；Ｎａｎｏｇ遺伝子のファミリー、例えば、Ｏｃｔａｍｅｒ－４（ＯＣＴ４）、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１；またはＬｉｎ２８を含む特定の遺伝子を発現するが、これに限定されるものではない。ｉＰＳＣの例は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７）Ｃｅｌｌ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２００７年１１月２０日；Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ（２００６ Ｃｅｌｌ１２６：６６３-７６；Ｏｋｉｔａら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ４４８：２６０-２６２；Ｙｕら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２００７年１１月２０日；およびＮａｋａｇａｗａら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２００７年１１月３０日に、記載されている。
本明細書において使用されるように、「増殖」という用語は、細胞または細胞集団を成長させたり、またはその表現型を変化させたりすることを意味する。「成長」または「拡大」という用語は、所望の数の細胞または細胞型を得るために必要な支持媒体、栄養分、成長因子、支持細胞、または任意の化学的または生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を意味する。１つの実施形態においては、細胞の成長／拡大により、組織が再生することになる。
本明細書において使用されるように、「培養」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を意味する。培養された細胞の子孫は、親細胞と完全に同一（すなわち、形態的、遺伝的、または表現型）ではない可能性があることを理解されたい。「拡張」とは、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
本明細書において使用されるように、および以下により詳しく記載されるように、「馴化培地」とは、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックス、および細胞の成長、発達、分化を促進するようないくつかの材料などの細胞因子を培地に供給する成熟細胞で培養した培地のことである。
本明細書において使用されるように、「分化」という用語は、非特異性細胞が、皮膚、心臓、肝臓または筋肉細胞などの特異性細胞の特徴を獲得するプロセスを表している。「一定方向への分化」とは、幹細胞の培養条件を操作して、特定の細胞型への分化を誘起することを意味する。「脱分化」とは、細胞の系統の中で、よりコミットしない位置に戻る細胞のこと。本明細書において使用されるように、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系統の中でよりコミットした（「分化した」）位置を取る細胞を定義する。
本明細書において使用されるように、細胞の「系統」は、その細胞の遺伝性、すなわちその先行した者と子孫を定義する。細胞の系統は、発達と分化の遺伝的なスキームの中で細胞を配置する。本明細書において使用されるように、「中胚葉系（または外胚葉系、内胚葉系）に分化する細胞」は、それぞれ特定の中胚葉系（または外胚葉系、内胚葉系）にコミットするようになる細胞を定義する。中胚葉系に分化する細胞や、特定の中胚葉系細胞を生み出す細胞の例としては、脂肪原性、平滑筋原性、軟骨原性、心原性、皮膚原性、造血原性、血管原性、筋原性、腎原性、尿原性、骨原性、心膜原性、または間質原性などが挙げられるが、これらの細胞に限定されるものではない。外胚葉系に分化する細胞の例としては、表皮細胞、神経原性細胞、神経膠原性細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。内胚葉系に分化する細胞の例としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺などを生み出す細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において使用されるように、「多能性幹細胞」という用語は、以下のような細胞を意味する：（i）未分化な状態でｉｎ ｖｉｔｒｏで無期限の増殖が可能であること、（ii）長期間の培養により正常な核型を維持すること、（iii）長期間の培養後も３種の胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべての誘導体に分化する可能性を維持すること。現在利用可能な多能性幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞およびｉＰＳＣが含まれている。本明細書において使用されるように、「胚性類似幹細胞」という用語は、組織、臓器、または血液に由来する細胞で、胚性幹細胞の多能性特性を有するものを意味する。
本明細書において使用されるように、「多系統幹細胞」または「多能性幹細胞」という用語は、自己複製する幹細胞、および異なる発生系統から少なくとも２つのさらなる分化した子孫細胞を意味する。系統は、同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉または内胚葉）からのものでもよく、異なる胚葉からのものでもよい。多系統幹細胞から分化して、異なる発生系統を有する２つの子孫細胞の例として、筋原性細胞と脂肪原性細胞が挙げられる（両方とも中胚葉由来であるが、異なる組織を生み出す）。他の例としては、神経原性細胞（外胚葉由来）と脂肪原性細胞（中胚葉由来）がある。
本明細書において使用されるように、「自己再生可能」という用語は、細胞の特性が実質的に変化することなく、何回も繰り返して自己再生できる細胞を意味する。一態様において、繰り返す回数は、少なくとも約２、または少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも約１５、２０、３０、５０、または１００である。
本明細書において使用されるように、「実質的に均質」という用語は、約５０％以上、または約６０％以上、または約７０％以上、または約７５％以上、または約８０％以上、または約８５％以上、または約９０％以上、または約９５％以上、または約９９％以上の細胞が同じまたは類似した表現型である細胞集団を表している。表現型は、予め選択された細胞表面マーカなどで判断することができる。
本明細書において使用されるように、目標細胞の「精製された集団」という用語は、自生環境に存在する実質的にすべての他の細胞から離れて単離された細胞集団を意味するだけでなく、細胞の混合物中の目標細胞の割合が自生環境で見出されるより大きい場合も意味する。例えば、細胞の精製された集団は、他の細胞および細胞型も濃縮された集団に存在していても、目標細胞の濃縮された集団を表す。いくつかの実施形態において、細胞の精製された集団は、細胞の混合集団の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を表し、精製前の集団に比べて「精製された」集団では、目標細胞が全細胞集団のより大きな割合を占めるという条件がある。
本明細書において使用されるように、「細胞集団」という用語は、表現型および／または遺伝子型が同一（クローン化）または非同一である１つ以上の細胞の集合を意味する。
本明細書において使用されるように、「細胞コロニー」または「コロニー」という用語は、細胞成長の結果として形成された密接に関連する細胞のグループを意味する。これらの用語は、コロニーを構成する細胞の数とは無関係に使われている。
本明細書において使用されるように、「休眠」または「静止」という用語は、成長、分裂、および／または分化を行うことができる前に活性化することが必要な状態にある細胞を包含することを意図している。
本明細書において使用されるように、「前駆体」または「前駆体細胞」という用語は、１または複数の特定の細胞型を生み出すことができる細胞を包含することを意図している。本明細書において使用されるように、「初期段階の前駆体」という用語は、特定の初期段階マーカを表現する前駆体細胞を包含することを意図している。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、活性化／発達すると、１または複数の幹細胞の集団を生み出す。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、活性化／発達する前に休眠／静止状態のままである。
本明細書において使用されるように、細胞の「活性化」または「発達」という用語は、細胞の休眠／静止状態における測定可能な形態学的、表現型、および／または機能的変化を意味する。このような活性化／発達は、典型的には、活性化された細胞の特定マーカの発現と同時に起こる。１つの実施形態において、活性化／発達は、細胞の成長、分裂、および／または発達の変化と同時に起こる。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体の活性化／発達には、細胞融合、細胞質および／または遺伝物質の混合、核移植、遺伝物質の交換、リプログラミング、および／またはハイブリッド細胞の形成が含まれる。
本明細書において使用されるように、「活性化された幹細胞」という用語は、活性化された状態にあり、特定の条件下で成長、分裂、および／または分化を行うことができる幹細胞を包含することを意図している。
本明細書において使用されるように、「組成物」という用語は、活性剤と別の担体、例えば、化合物または組成物、不活性（例えば、検出可能な薬剤やラベル）または活性剤、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどまたはの組み合わせを包含することを意図している。担体には、医薬品の賦形剤や添加剤であるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物（例えば、単糖類、ジ、トリ、テトラ、オリゴ糖などの糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖類などの誘導体化糖類；および多糖類または糖ポリマーなど）も含まれ、これらは単独または組み合わせで存在し、単独または組み合わせで１～９９．９９％の重量または体積を備えることができる。タンパク質賦形剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、リコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれて、例示されている。緩衝機能も発揮できる代表的なアミノ酸／抗体成分としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物系賦形剤も本発明の範囲内であると意図され、その例としては、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類、および、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、および、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチなどの多糖類、および、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトール類などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態においては、組成物は、細胞集団または細胞の混合物を含む。特定の実施形態においては、組成物は、フィルム、ゲル、パッチ、３次元構造、または液体溶液として調合される。
本明細書において使用されるように、「医薬学的に許容可能」という用語は、治療すべき疾患または病状およびそれぞれの投与経路を考慮して、合理的に賢明な医療従事者が患者への材料の投与を避ける原因となる特性を、明示された材料が有していないことを示している。例えば、そのような材料は、本質的に無菌であることが一般に要求される。
本明細書において使用されるように、「医薬学的に許容可能な担体（または培地）」という用語は、「生物学的に適合する担体（または培地）」という用語と互換的に使用してよく、治療的に投与されるべき細胞および他の薬剤と適合するだけでなく、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形も意味する。本発明での使用に適した医薬学的に許容可能な担体には、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体材料（例えば、当技術分野において知られており、本明細書でより詳細に記載されているような、細胞スキャフォールドおよびマトリックス、チューブシートおよび他のそのような材料）が含まれる。これらの半固体および固体材料は、体内で分解されないように（非生分解性）設計されてよく、体内で分解される（生分解性、バイオエローダブル）ように設計されてよい。生分解性材料は、さらに生体分解吸収性または生体吸収性であってよい。すなわち、体液に溶解して吸収され（水溶性インプラントはその一例である）、または分解され、最終的には他の物質に変換され、或いは自然な経路で分解、排泄されて体外に排出されてよい。局所的に使用する場合、医薬学的に許容可能な担体は、クリーム、軟膏、ゼリー、ゲル、溶液、懸濁液などの製造に適している。このような担体は当技術分野において従来からあり、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた局所投与が挙げられる。これらの製剤は、任意に、希釈剤、安定剤、および／またはアジュバントなどの医薬学的に許容可能な成分をさらに含んでよい。
本明細書において使用されるように、「溶液」という用語は、当技術分野においてよく知られている、溶液、懸濁液、エマルジョン、ドロップ、軟膏、液体洗浄、スプレー、リポソームを意味する。いくつかの実施形態において、液体溶液は、少量の酸または塩基を加えてもｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含む。
本明細書において使用されるように、「ｐＨ緩衝剤」という用語は、少量の酸または塩基を加えてもｐＨの変化に抵抗する水性緩衝液を意味する。ｐＨ緩衝溶液は、通常、弱酸とその共役塩基、またはその逆の混合物を備える。例えば、ｐＨ緩衝溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム十二水和物、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸水素二カリウムなどのリン酸塩；ホウ酸、およびホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムなどのホウ酸塩；クエン酸、およびクエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウムなどのクエン酸塩；酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムなどの酢酸塩；炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩などを含んでよい。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、乳酸、クエン酸、リン酸および酢酸などの酸、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ塩基などを挙げることができる。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および一部の製剤では塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含む）である。
本明細書において使用されるように、「製剤」または「処方」という用語は、１または複数の薬剤活性成分を含む異なる物質を組み合わせて剤形を生成するプロセスを意味する。特定の実施形態においては、２つ以上の薬剤活性成分を単一の剤形または複合剤に共同調合する、または別々に調合した後に複合剤に組み合わせることができる。徐放性製剤とは、治療薬を長時間かけて緩慢に体内に放出するように設計された製剤であり、一方、即放性製剤とは、治療薬を短時間で素早く体内に放出するように設計された製剤である。
本明細書において使用されるように、「治療」という用語は、傷害または介入の前、最中、および／または後に、疾患または障害の１または複数の臨床症状を予防、治癒、逆転、減衰、緩和、最小化、阻止、抑制、および／または停止させることを意味する。
本明細書において使用されるように、「患者」または「被験者」という用語は、マウス、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、またはヒトなどの哺乳類を含む動物で、医薬品組成物で治療されるか、または本明細書に記載された方法に従って治療されるものを意味する。
本明細書において使用されるように、「送達」という用語は、所望の治療効果を安全に達成するために必要な、医薬品組成物を体内に輸送するための経路、手法、製剤、技術、およびシステムを意味する。投与経路は、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚内、皮下、経皮、皮内、表皮内の経路を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路とすることができる。いくつかの実施形態において、有効量の組成物が、患者の皮膚上に適用するため、または皮膚内に送達するために調合される。いくつかの実施形態において、有効量の組成物が、患者の血流に送達されるように調合される。
本明細書において使用されるように、「有効量」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞成長、細胞分裂、および／または分化などを含む意図された結果をもたらすために、あるいはそれを必要とする患者の疾患、障害、または病状の治療のために有効な、本明細書に記載されているような組成物、細胞集団、または他の薬剤などの組成物や試薬の濃度や量を意味する。投与される細胞の数は、治療される障害の詳細に応じて変化することが理解されるであろう。これには、治療されるサイズまたは総体積／表面積、ならびに投与部位と治療される領域の位置との近さなど、薬用生物学者および／または治療医にとって身近な他の要素が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において使用されるように、「有効期間（または時間）」および「有効条件」という用語は、薬剤または組成物が意図された結果、例えば、細胞の事前決定された細胞型への分化を達成するために必要または好ましい、一定期間または他の制御可能な条件（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の場合は温度、湿度）を意味する。
本明細書において使用されるように、「対照」または「対照群」という用語は、比較の目的で実験に使用される代替の被験者またはサンプルを意味する。対照は、「陽性」または「陰性」であることができる。
本明細書において使用されるように、「同時」という用語は、同時（すなわち、連動して）投与を意味する。１つの実施形態において、投与は、２つ以上の薬剤活性成分（その任意の固体形態を含む）が一度に一緒に送達されるような共同投与である。
本明細書において使用されるように、「順次」という用語は、別々に（すなわち、異なる時間に）投与することを意味する。１つの実施形態において、２つ以上の薬剤活性成分（その任意の固体形態を含む）が異なる時間に別々に投与されるように、投与がずらされている。
本明細書において使用されるように、「標的組織」または「標的器官」という用語は、被験者に投与した後に、本明細書で開示されている幹細胞および／または本明細書で開示されている幹細胞に由来する分化した細胞が蓄積される意図された部位を意味する。例えば、本明細書で開示されている方法は、いくつかの実施形態において、（例えば、虚血または他の傷害によって）損傷を受けた標的組織または標的器官を伴う。
本明細書において使用されるように、「自己移植」、「自家移植」、「オートグラフト」などの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントでもある治療法を意味する。「同種移植」、「同種異系移植」、「アログラフト」などの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントと同種であるが、同一個体ではない治療法を意味する。ドナーの細胞とレシピエントの細胞が組織適合的にマッチしている細胞移植は、同系移植と呼ばれることもある。異種移植、異種生体移植、ゼノグラフトなどの用語は、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントと異なる種である治療法を意味する。
本明細書において使用されるように、「Ｏｃｔ４」、「Ｏｃｔ３／４」、または「オクタマ結合転写因子４」という用語は、オクタマ転写因子ファミリーのメンバを意味し、未分化細胞のマーカとして頻繁に使用され、遺伝子記号ＰＯＵ５Ｆ１を有する。Ｏｃｔ４は、Ｐｏｕ５ｆ１（ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ，ｃｌａｓｓ ５，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １，ｖａｎ Ｅｉｊｋ ｅｔ ａ，１９９９）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＮＭ＿００２７０１．５）、マウス（ＮＭ＿０１３６３３．３）、ラット（ＮＭ＿００１００９１７８．２）、ネコ（ＮＭ＿００１１７３４４１．１）、ウシ（ＮＭ＿１７４５８０．３）などのＯｃｔ４のアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＡＢＣＧ２」または「ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターＧ２」という用語は、ＡＢＣＧ/ホワイトサブファミリーに属するＡＢＣＧファミリーのハーフトランスポーターで、遺伝子記号がＡＢＣＧ２であることを意味する。ＡＢＣＧ２は、ＣＤ３３８またはＣＤｗ３３８（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｗ３３８， Ｌｅｃｃｉａら，２０１4）、ＭＸＲ（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｍｉｙａｋｅら，１９９９.）、ＢＣＲＰ（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｄｏｙｌｅら，１９９８）、またはＡＢＣＰ（Ｐｌａｃｅｎｔａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ， Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら，１９９８）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＡＡＧ５２９８２）、マウス（ＮＭ＿０１１９２０．３）、ラット（ＢＡＣ７６３９６．１）、ネコ（ＸＰ＿０１９６８４８１３．１）、イヌ（ＮＰ＿００１０４１４８６．１）、ブタ（ＮＰ＿９９９１７５．１）、ウシ（ＮＰ＿００１０３２５５５．２）などのＡＢＣＧ２のアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＣＤ４９ｆ」という用語は、タンパク質のインテグリンα鎖ファミリーのメンバで、遺伝子記号がＩＴＧＡ６であることを意味する。ＣＤ４９ｆは、ＩＴＧＡ６またはＩＴＧＡ６Ｂ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｌｐｈａ ６，Ｃａｒｉａｔｉら，２００８）、またはＶＬＡ－６（Ｈｅｍｌｅｒら，１９８９）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＮＭ＿００１０７９８１８．２）、マウス（ＮＭ＿００８３９７．４）、ラット（ＮＭ＿０５３７２５．１）、ウシ（ＮＭ＿００１１０９９８１．１）などのＣＤ４９ｆのアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＣＤ３４」という用語は、特定の造血幹細胞および非造血幹細胞に存在する細胞表面マーカで、遺伝子記号がＣＤ３４であることを意味する。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＡＡＢ２５２２３）、マウス（ＮＰ＿５９８４１５．１）、ラット（ＮＰ＿００１１００６７２．１）、ネコ（ＮＰ＿００１００９３１８．１）、ブタ（ＮＰ＿９９９２５１．１）、ウシ（ＮＰ＿７７６４３４．１）などのＣＤ３４のアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＣＤ１１７」という用語は、造血幹細胞や他の細胞型の表面に発現するサイトカイン受容体で、遺伝子記号がＫＩＴであるものを意味する。ＣＤ１１７は、ＫＩＴ（Ｇｉｅｂｅｌら，１９９１）、ｃ－Ｋｉｔ（Ｙａｒｄｅｎら，１９８７）、ＰＢＴ（Ｐｉｅｂａｌｄ ｔｒａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎら，１９９１）、またはＳＣＦＲ（ｍａｓｔ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， Ｓｐｒｉｔｚら，１９９２）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＮＭ＿０００２２２．２）、マウス（ＮＭ＿００１１２２７３３．１）、ラット（ＮＭ＿０２２２６４．１）、ネコ（ＮＭ＿００１００９８３７．３）、イヌ（ＮＭ＿００１００３１８１．１）、ブタ（ＮＭ＿００１０４４５２５．１）などのＣＤ１１７のアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＣＤ１８４」という用語は、間質由来因子－１（ＳＤＦ－１、ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）に特定のα－ケモカイン受容体であり、遺伝子記号がＣＸＣＲ４であることを意味する。ＣＤ１８４は、ＣＸＣＲ４（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４，Ｅｎｄｒｅｓら，１９９６）、ＬＡＰ３またはＬＡＰ－３（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３， Ｋａｇｅｙａｍａら，２００８）、またはＦｕｓｉｎ（Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，１９９６）としても知られている。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、ヒト（例えば、ＡＪ２２４８６９．１）、マウス（ＢＣ０９８３２２．１）、ラット（ＮＭ＿０２２２０５．３）、ネコ（ＮＭ＿００１００９８２６．１）、イヌ（ＮＭ＿００１０４８０２６．１）、ブタ（ＤＱ１２４１０４．１）、ウシ（ＮＭ＿１７４３０１．３）などのＣＤ１８４のアミノ酸配列および核酸配列が開示されている。
本明細書において使用されるように、「ＣＤ４５」という用語は、チロシンホスファターゼを意味し、遺伝子記号ＰＴＰＲＣを有する。ＣＤ４５は、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ｃ，Ｇｏｆｆら，１９９９）、またはＬ－ＣＡまたはＬＣＡ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ｃｏｍｍｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｐｉｎｇｅｌら，１９８９）としても知られている。この遺伝子は、ＧＥＮＢＡＮＫ(r) Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第ＮＰ＿００２８２９（ヒト）、ＮＰ＿０３５３４０（マウス）、ＮＰ＿６１２５１６（ラット）、ＸＰ＿００２８２９（イヌ）、ＸＰ＿５９９４３１（ウシ）、ＡＡＲ１６４２０（ブタ）号に対応する。ＧＥＮＢＡＮＫ(r)データベースには、他にも数種の魚類や数種のヒト以外の霊長類などからのＣＤ４５ホモログのアミノ酸配列が登録されている。ＣＤ４５には様々なアイソフォームが存在し、例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）などが挙げられる。
本明細書において使用されるように、「系統マーカ」または「Ｌｉｎ」という用語は、細胞の系統に関する特徴的な分子、例えば、細胞表面マーカ、ｍＲＮＡ、または内部タンパク質を意味する。系統陽性（Ｌｉｎ＋）細胞とは、成熟細胞の系統マーカを発現している細胞の混合物を意味する。系統陰性（Ｌｉｎ－）細胞とは、幹細胞や前駆細胞など、分化していない成熟細胞のことを意味する。一態様においては、「Ｌｉｎ」はマーカのパネルを意味する。本明細書において使用されるように、ＦＩＴＣ抗ヒト系統抗体カクテルは、ヒト末梢血のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、および好中球の検出に最適化されている。このカクテルは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６で構成されている。
本明細書において使用されるように、「肝細胞株」という用語は、肝臓に由来する細胞株を意味する。肝細胞株の非限定的な例としては、肝細胞癌由来の細胞株、不死化肝細胞、トランスジェニック動物から単離した不死化肝細胞、肝細胞／肝細胞癌ハイブリッド細胞、遺伝子操作された肝細胞、肝細胞前駆細胞、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一態様において、肝細胞癌由来の細胞株として、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＨｕＨ－７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ－５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５、およびＨｅｐａＲＧが挙げられてよいが、これらに限定されるものではない。また、別の態様において、肝細胞の不死化により肝細胞株を生成してもよい。１つの実施形態において、不死化肝細胞は、ウイルス遺伝子または発癌遺伝子（すなわち、サルウィルスＳＶ４０大Ｔ抗原、ｃ－ｍｙｃ、ｃＨ－ｒａｓ）による形質転換を介して、または組換体プラスミドを用いた形質移入を介して生成された肝細胞を含んでよい。別の実施形態において、不死化肝細胞は、ウイルス形質転換遺伝子、発癌遺伝子または成長因子を発現するトランスジェニック動物から単離してよい。さらに別の実施形態において、成人の肝酵素を発現しながら永続的に成長し続ける肝細胞／肝細胞癌ハイブリッド細胞を生成してよい。別の実施形態において、肝細胞株は、ヒト薬物代謝酵素を発現する遺伝子操作された肝細胞も含む。別の実施形態において、肝細胞株は、肝臓卵形細胞などの肝細胞前駆細胞も含む。
２．ヒト成人組織からの初期段階の前駆体の単離
研究者たちは長い間、臨床応用の可能性を秘めた多能性幹細胞の供給源を、ヒト成人組織から探している。本発明は、比較的小さなサイズの初期段階の前駆体の集団を、ヒト成人組織から単離できることを示すものである。これらの初期段階の前駆体は、活性化／発達を経て、ヒト多能性幹細胞になることができる。細胞の多能性は、３つの胚葉すべてに分化する能力によって実証されている。さらに、本明細書で開発された新たな活性化／発達システムにより、ヒト多能性幹細胞を取得して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡張することができる。さらに、ヒト成人組織から由来する多能性幹細胞は、倫理的・政治的に問題視されることもなく、遺伝子操作も必要としない。さらに、本技術のもう一つの利点は、ヒト多能性幹細胞が非腫瘍化であることが実証されたことである。従って、本開示の技術は、組織損傷や慢性疾患、加齢関連疾患を治療するための実用的な細胞ベースの治療への道を開くものである。
１つの実施形態において、本開示は、ＣＤ４９ｆを発現し、６μｍ未満の直径を有するヒト細胞で濃縮された組成物または細胞集団を提供する。このようなヒト細胞は、本明細書では、「ＣＤ４９ｆ＋細胞」または「初期段階の前駆体」と呼ばれている。いくつかの実施形態において、組成物または細胞集団は、少なくとも１００個の細胞、１０００個の細胞、１０，０００個の細胞、１００，０００個の細胞、または１，０００，０００個の細胞の合計を含み、そのうちの少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が初期段階の前駆体である。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体が濃縮された組成物または細胞集団は、ヒト被験者の成人組織サンプルから単離される。いくつかの実施形態において、組成物または細胞集団は、約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の割合で、初期段階の前駆体以外の細胞をさらに含む。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体が濃縮された組成物または細胞集団は、ヒト被験者の血液サンプルから単離される。いくつかの実施形態において、組成物は、赤血球および白血球などの血球をさらに含む。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体が濃縮された組成物または細胞集団は、約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の割合で血球を含む。
いくつかの実施形態において、組成物中の初期段階の前駆体は、無傷のものと壊れたものの両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞集団における無傷の初期段階の前駆体の数と壊れた初期段階の前駆体の数の比率は、１：１未満、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、または１５：１である。
いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の直径は、約１μｍ、または約１．５μｍ、または約２μｍ、または約２．５μｍ、または約３μｍ、または約３．５μｍ、または約４μｍ、または約４．５μｍ、または約５μｍ、または約５．５μｍ、または約６μｍ、または約１－２μｍの間、または約１－３μｍの間、または約１－４μｍの間、または約１－５μｍの間、または約１－６μｍの間、または約２－３μｍの間、または約２－４μｍの間、または約２－５μｍの間、または約２－６μｍの間、または約３－４μｍの間、または約３－５μｍの間、または約３－６μｍの間、または約４－５μｍの間、または約４－６μｍの間、または約５－６μｍの間、または６μｍ未満、または５μｍ未満、または４μｍ未満、または３μｍ未満、または２μｍ未満、または１μｍ未満である。いくつかの実施形態において、単離されたヒト初期段階の前駆体は、非常に高い核－細胞質比率（ｖ／ｖ、Ｎ：Ｃ比、またはＮ／Ｃとも呼ばれる）を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体の核／細胞質の比率は、少なくとも９：１、または少なくとも８：１、または少なくとも７：１、または少なくとも６：１、または少なくとも５：１であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体において、核が占める細胞の面積の割合は、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体の細胞質は最小限であってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで通常の細胞培養培地（例えば、１０％のＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）に播種した場合、いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体は増殖せず、数日で老化する。
いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、マーカの異なるセットによって特徴付けられる細胞の様々な分集団を含む、不均質な細胞混合物である。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、ＣＤ４９ｆおよび／またはＳＳＥＡ４を発現し、ＡＢＣＧ２および／またはＬｉｎを発現しない細胞の分集団を含む。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、ＣＤ４９ｆ、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ４５、およびＣＤ１０５から選択される１または複数のマーカを発現する細胞の分集団を含む。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ４５、およびＣＤ１０５から選択される１または複数のマーカを発現する細胞の分集団を含む。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１８４、ＣＤ４５、およびＣＤ１０５から選択される１または複数のマーカを発現する細胞の分集団を含む。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、非常に低いレベルのＣＤ３４を発現する。
いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、マーカＡＢＣＧ２（ＣＤ３３８）を発現していない。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体は、Ｌｉｎ－であることをさらに特徴とする。いくつかの実施形態において、ヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、ＣＤ９０、Ｌｉｎ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ４１から選択される１または複数のマーカを発現していない。
ヒト初期段階の前駆体は、以下の表１に示すような細胞表面マーカおよび細胞内マーカを用いて分析してよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、１または複数の初期段階幹細胞マーカ（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＳＥＡ４）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、造血マーカのグループの１または複数のマーカ（例えば、ＣＤ１１７およびＣＤ４５）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、ＭＳＣマーカのグループの１または複数のマーカ（例えば、ＣＤ１０５およびＣＤ７３）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、１または複数の増殖マーカ（例えば、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１Ｌｏｗおよびｃ－Ｍｙｃ）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、１または複数のサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦおよびＩＬ１０）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヒト初期段階の前駆体は、ＨＬＡ－ＩＬｏｗ／ＨＬＡ－ＩＩ－である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるヒト初期段階の前駆体の単離した集団は、表２で識別されるマーカの１または複数を発現する細胞の２つ以上の分集団を含む。一態様において、表２で識別されたマーカのうち２つが存在するか、または３つ、または４つ、または５つと増大していき、すべてのマーカが存在するまでになる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体の細胞の分集団は、表２で識別されるマーカの様々な組み合わせを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているような初期段階の前駆体は、Ｌｉｎを発現していない。
いくつかの実施形態において、ヒト成人組織サンプルから本明細書に開示された初期段階の前駆体を単離する方法が提供される。ヒト成人組織の非限定的な例としては、ヒト末梢血、臍帯血、骨髄、臍帯、胎盤、脂肪組織、脳、血管、骨格筋、皮膚、歯、歯髄、心臓、肝臓、卵巣上皮、精巣、腎臓、網膜、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯および腱などが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒトの血液サンプルから本明細書に開示された初期段階の前駆体を単離する方法が提供される。ヒトの血液サンプルの非限定的な例としては、ヒト末梢血および臍帯血が挙げられる。
いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、細胞の単離を可能にする任意の手段によって、ヒト成人組織サンプルから単離することができる。例えば、ヒトの血液サンプルから初期段階の前駆体を単離するために、本明細書に開示の方法は、血液サンプルから赤血球の少なくとも一部を除去すること、およびサンプルを遠心分離して初期段階の前駆体を含むペレットを得ることを含んでよい。別の例において、本明細書に開示されている方法は、ヒト成人組織サンプルから細胞懸濁液を取得すること（例えば、組織サンプルを消化し、未消化の組織を除去すること）、および細胞懸濁液を遠心分離して、初期段階の前駆体を含むペレットを得ることを含んでよい。他の態様において、本方法は、１または複数の識別マーカに基づく細胞選別および細胞単離方法を含んでよい。例えば、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）や磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）を用いて、初期段階の前駆体を選別、単離してよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体を単離するために、他の方法を使用することができる。いくつかの単離手順の例は、後述の「実施例１」に記載されている。
一態様においては、ヒト初期段階の前駆体の単離方法は、（１）ヒトの血液サンプルから赤血球の少なくとも一部を除去すること、（２）サンプルを３，０００ｘｇ～１５，０００ｘｇで遠心分離すること、および（３）本明細書で開示するヒト初期段階の前駆体を含むペレットを得ることを含む。いくつかの態様においては、段階（２）のサンプルは、約３，０００ｘｇで、または約３，５００ｘｇで、または約４，０００ｘｇで、または約４，５００ｘｇで、または約５，０００ｘｇで、または約５，５００ｘｇで、または約６，０００ｘｇで、または約６，５００ｘｇで、または約７，０００ｘｇで、または約７，５００ｘｇで、または約８，０００ｘｇで、または約８，５００ｘｇで、または約９，０００ｘｇで、または約９，５００ｘｇで、または約１０，０００ｘｇで、または約１０，５００ｘｇで、または約１１，０００ｘｇで、または約１１，５００ｘｇで、または約１２，０００ｘｇで、または約１２，５００ｘｇで、または約１３，０００ｘｇで、または約１３，５００ｘｇで、または約１４，０００ｘｇで、または約１４，５００ｘｇで、または約１５，０００ｘｇで遠心分離されてよい。
いくつかの態様においては、ヒト初期段階の前駆体の単離方法は、（１）ヒト組織サンプルを消化し、未消化の組織を除去して細胞懸濁液を得ること、（２）細胞懸濁液を３，０００ｘｇ～１５，０００ｘｇで遠心分離すること、および（３）本明細書で開示するヒト初期段階の前駆体を含むペレットを得ることを含む。いくつかの態様においては、段階（２）のサンプルは、約３，０００ｘｇで、または約３，５００ｘｇで、または約４，０００ｘｇで、または約４，５００ｘｇで、または約５，０００ｘｇで、または約５，５００ｘｇで、または約６，０００ｘｇで、または約６，５００ｘｇで、または約７，０００ｘｇで、または約７，５００ｘｇで、または約８，０００ｘｇで、または約８，５００ｘｇで、または約９，０００ｘｇで、または約９，５００ｘｇで、または約１０，０００ｘｇで、または約１０，５００ｘｇで、または約１１，０００ｘｇで、または約１１，５００ｘｇで、または約１２，０００ｘｇで、または約１２，５００ｘｇで、または約１３，０００ｘｇで、または約１３，５００ｘｇで、または約１４，０００ｘｇで、または約１４，５００ｘｇで、または約１５，０００ｘｇで遠心分離してよい。
いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体の特定マーカー（複数可）に基づいて、ヒト初期段階の前駆体の特定の濃縮された集団を単離する方法が提供される。いくつかの実施形態において、特定マーカに基づく細胞の複数の分集団を含む、ヒト初期段階の前駆体の異種集団を単離する方法が提供される。例えば、本方法は、ＣＤ４９ｆ＋細胞が濃縮された細胞集団を単離するために使用されてよい（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによる）。別の例において、本方法を用いて、ＣＤ４９ｆ＋／ＡＢＣＧ２－細胞が濃縮された細胞集団を単離してよい。別の例において、本方法を用いて、ＣＤ４９ｆ＋／Ｌｉｎ－細胞が濃縮された細胞集団を単離してよい。別の例において、本方法を用いて、ＣＤ４９ｆ＋／ＳＳＥＡ４＋／Ｌｉｎ－細胞が濃縮された細胞集団を単離してよい。他の実施形態においては、本方法を用いて、特定マーカの特定セット（例えば、本明細書に開示されている初期段階の前駆体を識別するためのマーカの様々な組み合わせ）を有する細胞で濃縮された細胞集団を単離してよい。
いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、組織が本明細書で開示されているような生存している初期段階の前駆体を含む限り、他の提供源／組織から単離してよい。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、任意の年齢の被験者から単離してよい。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、いつでも被験者から単離してよい。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体は、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、マウス、サルおよびヒトなどの動物から単離してよいが、これらに限定されるものではない。
３．活性化および発達
初期段階の前駆体の単離した集団をｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化／発達を促進するために、活性化／発達システムが確立されている。
いくつかの実施形態において、活性化／発達システムは、初代肝細胞および肝細胞株から選択される１または複数の細胞／細胞株を含む。肝細胞株の非限定的な例としては、肝細胞癌に由来する細胞株、不死化肝細胞、トランスジェニック動物から単離された不死化肝細胞、肝細胞／肝細胞癌ハイブリッド細胞、遺伝子操作された肝細胞、肝細胞前駆細胞などが挙げられる。肝細胞癌由来の細胞株の非限定的な例としては、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＨｕＨ－７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ－５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５およびＨｅｐａＲＧなどが挙げられる。１つの実施形態において、不死化肝細胞は、ウイルス遺伝子または発癌遺伝子（例えば、サルウィルスＳＶ４０大Ｔ抗原、ｃ－ｍｙｃ、ｃＨ－ｒａｓ）による形質転換を介して生成された肝細胞、および組換体プラスミドを用いた形質移入を介して生成された肝細胞を含む。例えば、不死化肝細胞としては、ＴＨＬＥ－２、ＴＨＬＥ－３、Ｌ－０２（ＨＬ－７７０２）、ヒト肝細胞株（ＨＨＬ）などを含んでよいが、これらに限定されるものではない。１つの実施形態において、不死化肝細胞は、ウイルス形質転換遺伝子、発癌遺伝子または成長因子を発現するトランスジェニック動物から単離された肝細胞を含む。１つの実施形態において、肝細胞株は、肝細胞と肝細胞癌細胞を融合して生成された肝細胞／肝細胞癌ハイブリッド細胞も含む。１つの実施形態において、肝細胞株は、ヒト薬物代謝酵素を発現する遺伝子操作された肝細胞も含む。１つの実施形態において、肝細胞株は、肝臓卵形細胞などの肝細胞前駆細胞も含む。いくつかの実施形態において、活性化／発達システムは、他型の細胞および／または細胞株を含んでいてもよい。いくつかの態様においては、活性化／発達システムは、上述の細胞／細胞株のうち、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つを含んでよい。
一態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞と、肝細胞株から選択された１または複数との細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、肝細胞株から選択された少なくとも１つを含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、肝細胞株から選択された少なくとも２つの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、肝細胞株から選択された少なくとも３つの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞とＨｅｐＧ２の細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくともＨｅｐＧ２の細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐａＲＧの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくともＨｅｐＧ２とＨｅｐａＲＧの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞と、ＴＨＬＥ－２、ＴＨＬＥ－３、Ｌ－０２（ＨＬ－７７０２）、およびＨＨＬから選択される少なくとも１つとの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、ＴＨＬＥ－２、ＴＨＬＥ－３、Ｌ－０２（ＨＬ－７７０２）、およびＨＨＬから選択される少なくとも１つの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくともＨｅｐａＲＧと、ＴＨＬＥ－２、ＴＨＬＥ－３、Ｌ－０２（ＨＬ－７７０２）、およびＨＨＬから選択される少なくとも１つの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞とＨｅｐａＲＧの細胞混合物を含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくともＨｅｐａＲＧを含む。別の態様においては、活性化／発達システムは、少なくとも初代肝細胞を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書は、細胞培養における初期段階の前駆体の活性化および発達を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養において初期段階の前駆体の活性化および発達を促進する方法は、本明細書に開示されているような細胞／細胞株または細胞混合物と接触している、またはこれによって馴化された培地で初期段階の前駆体を培養することを含む。
一態様においては、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような細胞／細胞株または細胞混合物を用いた共培養システムにおいて、初期段階の前駆体の活性化および発達を促進する方法である。いくつかの実施形態において、共培養システムは、トランスウェルプレートを用いて調製してよい。例えば、上述の細胞／細胞株の細胞または細胞混合物を調製し、マイトマイシンＣで処理して細胞を分裂不活性化することができる。次に、細胞／細胞混合物を共培養培地で細胞培養プレートの底に播種することができる。初期段階の前駆体の単離した集団は、トランスウェル膜上に播種して、細胞／細胞混合物と共培養することができる。共培養培地は、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を５～５０％含むα-ＭＥＭ培地を含んでいてよい。例えば、共培養培地は、約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％のＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地を含んでよい。別の実施形態において、共培養培地は、５～５０％のヒト血清を含む培地を含んでよい。別の実施形態において、共培養培地は、５～５０％の血清置換を行った培地を含んでよい。別の実施形態において、共培養培地は、血清を含まない培地を含んでよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている方法で、他の培養培地を使用してよい。任意で他の試薬や因子を共培養培地に加えてよい。
別の態様においては、本明細書では、馴化培地を用いて初期段階の前駆体の活性化と発達を促進する方法が提供される。いくつかの態様においては、培養培地は、活性化／発達システムで使用する前に、上述の細胞／細胞株または細胞混合物で調整されてよい。例えば、上述の細胞／細胞混合物を細胞培養培地に懸濁した後、細胞培養皿／プレートに播種することができる。細胞／細胞混合物を培養するための細胞培養培地は、ＦＢＳを５～５０％含むＤＭＥＭを含んでよい。例えば、培地は、約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを含んでよい。別の実施形態において、細胞／細胞混合物を培養するための細胞培養培地は、５～５０％のヒト血清を含む培地を含んでよい。別の実施形態において、細胞／細胞混合物を培養するための細胞培養培地は、５～５０％の血清置換を行った培地を含んでよい。別の実施形態において、細胞／細胞混合物を培養するための細胞培養培地は、血清を含まない培地を含んでよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている方法で、他の培養培地を使用してよい。任意で他の試薬や因子を培地に加えてよい。馴化培地は、細胞培養皿／プレートから回収することができ、単離された初期段階の前駆体を培養するために培地を使用する前に、培地中の残りの細胞を（例えば、遠心分離および／またはフィルタリングによって）除去することができる。一態様においては、回収した調整される培地を、本明細書で開示されているように、単離された初期段階の前駆体の培養に直接使用してよい。別の態様においては、初期段階の前駆体を培養するために、回収した調整される培地を上述の細胞培養培地と混合してよい。例えば、混合培地の総量を基準として、本明細書で開示されている馴化培地は、約５％（ｖ／ｖ）、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％であってよい。任意で他の試薬および因子を混合培地に加えてよい。
いくつかの実施形態において、活性化／発達システムは、細胞融合を促進する組成物および／またはシステムを含む。細胞融合の非限定的な例としては、電気的細胞融合（または電気融合）、化学的に（例えば、ポリエチレングリコール、またはＰＥＧ）媒介による細胞融合、ウイルス誘導（例えば、センダイウイルス）による細胞融合、機械的な張力によって駆動される細胞融合（例えば、マイクロインジェクション）、および集中／高速遠心分離によって引き起こされる細胞融合などが挙げられる。いくつかの実施形態において、活性化／発達システムは、電気的細胞融合、化学的媒介による細胞融合、ウイルス誘導による細胞融合、機械的張力による細胞融合、遠心分離による細胞融合、またはそれらの組み合わせを促進する組成物および／またはシステムを含む。いくつかの実施形態において、細胞融合を誘導する任意の他の組成物および／またはシステムを、本明細書に開示される活性化／発達システムに含まれてよい。
１つの実施形態において、本明細書は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初期段階の前駆体の活性化と発達を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体の活性化と発達を促進する方法は、細胞融合を促進することを含む。いくつかの実施形態において、細胞融合を誘導する電気的方法、細胞融合を媒介する化学的方法／処理（例えば、ＰＥＧ）、細胞融合を誘導するウイルス（例えば、センダイウイルス）、細胞融合を駆動する機械的方法（例えば、マイクロインジェクション）、細胞融合を導く高速遠心分離法、またはそれらの組み合わせを含む、初期段階の前駆体の活性化および発達を促進する方法も提供される。
いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体の活性化および発達を促進する方法は、本明細書に開示されているような細胞融合を促進すること、および本明細書に開示されている培地で初期段階の前駆体を同時または逐次的に培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞融合を促進することは、初期段階の前駆体の活性化と発達に必要である可能性もあって、そうでない可能性もある。いくつかの実施形態において、細胞融合を促進する段階は任意である。
本開示の実施形態はまた、本明細書に開示される初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞の集団を提供する。活性化された幹細胞は、初期段階の前駆体を上述の活性化／発達システムで有効期間培養することによって得られてもよい。いくつかの態様においては、初期段階の前駆体を活性化するのに効果的な培養時間は、少なくとも１時間、または少なくとも２時間、または少なくとも４時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも１日間、または少なくとも２日間、または少なくとも３日間、または少なくとも４日間、または少なくとも５日間、または少なくとも８日間、または少なくとも１０日間、または少なくとも１２日間、または少なくとも１５日間、または少なくとも１８日間、または少なくとも２０日間、または少なくとも２５日間、または少なくとも３０日間を含んでよいが、これらに限定されるものではない。細胞培養培地は、１日ごとに交換してもよく、または２日ごとに交換してもよく、または３日ごとに交換してもよく、または４日ごとに交換してもよく、または５日以上ごとに交換してもよい。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞は、初期段階の前駆体を他の培養システム、培養培地、または条件で有効期間培養することによって得られてよい。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞は、マーカの異なるセットで特徴付けられる様々な細胞の分集団を含む、不均質な細胞混合物として特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されているように、幹細胞を活性化および／または培養するために、他の細胞培養培地および／または細胞培養条件を使用してよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている活性化／発達システムで使用される細胞培養培地および／または細胞培養条件は、他型の細胞および／または他型の幹細胞を培養するために使用されてよい。例えば、活性化／発達システムで使用される細胞培養培地および／または細胞培養条件は、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）内皮幹細胞（ＥＳＣ）、乳腺幹細胞（ＭａＳＣ）、腸幹細胞（ＩＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、成人嗅覚幹細胞（ＯＳＣ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、精巣幹細胞（ＴＳＣ）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される１または複数の細胞を培養するために使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞は、初期段階の前駆体では発現していないＡＢＣＧ２を発現する細胞の集団を含む。いくつかの態様においては、核酸染色（例えば、ヘキスト３３３４２）は、活性化／発達システムで培養された活性化された幹細胞の外側で徐々に消耗し、一方で、初期段階の前駆体の核酸染色は、本明細書で開示される通常の培養培地では消耗しない。
また、本明細書では、いくつかの実施形態において、初期段階の前駆体に由来する、ＣＤ４９ｆ＋／Ｌｉｎ－である活性化された幹細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団がＡＢＣＧ２を発現している。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２、およびＳＳＥＡ４からなる群から選択された１または複数のマーカを発現し、Ｌｉｎを発現しない。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２、ＳＳＥＡ４、およびＬｉｎ２８からなる群から選択された１または複数のマーカを発現し、Ｌｉｎを発現しない。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、Ｌｉｎ２８、ＣＤ４４、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカを発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＡＢＣＧ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカを発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、Ｌｉｎ２８、ＣＤ４４、ＣＤ１８４、およびＣＤ１０６からなる群から選択される１または複数のマーカを発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、非常に低いレベルのＣＤ３４を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される活性化された幹細胞の集団は、１または複数の増殖マーカ（例えば、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１およびｃ－Ｍｙｃ）を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される活性化された幹細胞の集団は、１または複数のサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－べーた、ＨＧＦ、ＩＬ－６、およびＩＬ１０）を発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ１１７、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１５０、ＣＤ９０、およびＬｉｎからなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ８、およびＣＤ４１からなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される活性化された幹細胞の集団は、ＨＬＡ－ＩＬｏｗ／ＨＬＡ－ＩＩ－である。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、アルブミンとα胎児性タンパク質（ＡＦＰ）などの１または複数の内胚葉特定マーカを発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、オステオカルシンやデスミンなどの１または複数の中胚葉特定マーカを発現する。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団が、ネスチンなどの１または複数の外胚葉特定マーカを発現する。
また、本明細書では、いくつかの実施形態において、少なくとも１０００個のヒト細胞を含み、少なくとも４０％の細胞が本明細書に開示されている活性化された幹細胞である組成物が提供される。一態様においては、本組成物は、少なくとも２０００個、または少なくとも５０００個、または少なくとも１００００個、または少なくとも５００００個、または少なくとも１０００００個のヒト細胞と、および少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の細胞が活性化された幹細胞を含む。
いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の集団は、１または複数の細胞の分集団を含む異種細胞の集団である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている活性化された幹細胞の分集団の１または複数が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化／発達システムにおいて拡大することができる。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の分集団の倍加時間が変化してよい。いくつかの実施形態において、活性化／発達システムにおける活性化された幹細胞の１または複数の分集団の倍加時間は、８０時間超、または75時間未満、または７０時間未満、または６５時間未満、または６０時間未満、または５５時間未満、または５０時間未満、または４５時間未満、または４０時間未満、または３５時間未満、または３０時間未満、または２５時間未満、または２０時間未満、または約２０時間から約８０時間の間、または約２０時間から約７５時間の間、または約２０時間から約７０時間の間、または約２０時間から約６５時間の間、または約２０時間から約６０時間の間、または約２０時間から約５５時間の間、または約２０時間から約５０時間の間、または約２０時間から約４０時間の間、または約２０時間から約３０時間の間、または約３０時間から約７５時間の間、または約３５時間から約７５時間の間、または約４０時間から約７５時間の間、または約４５時間から約７５時間の間、または約５０時間から約７５時間の間、または約５５時間から約７５時間の間、または約６０時間から約７５時間の間、または約４０時間から約７０時間の間、または約４０時間から約６５時間の間、または約４０時間から約６０時間の間、または約４５時間から約７０時間の間、または約４５時間から約６５時間の間、または約５０時間から約７０時間の間、または約５０時間から約６５時間の間、または約５５時間から約６５時間の間のいずれかであってよい。いくつかの実施形態において、活性化された幹細胞の１または複数の分集団は、他の細胞培養系で、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで他の培養条件下で拡大することができる。
また、本明細書では、本明細書で開示された初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞の分集団を精製する方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する、マーカの特定セットを有する活性化された幹細胞の分集団を精製する方法が提供される。
１つの実施形態において、一定期間（例えば、５～１０日）、活性化／発達システムで培養した後、１または複数の細胞コロニーが発生する。いくつかの態様においては、通常の培地（例えば、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ培地）で培養した初期段階の前駆体は、成長・拡大せず、細胞コロニーに発展しない。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される初期段階の前駆体に由来する細胞コロニーを単離する方法が提供される。例えば、クローニングシリンダを用いて、細胞コロニーを採取することができる。代わりに、細胞培養プレート／ディッシュからコロニーをトリプシンで切り離すことで、細胞コロニーを単離することもできる。細胞コロニーを単離するために、他の方法も採用できることを理解すべきである。
また、本明細書で開示されているように、単離されたコロニーから活性化された幹細胞の集団を精製する方法も提供されている。いくつかの実施形態において、ＭＡＣＳやＦＡＣＳなどの方法を用いて、活性化された幹細胞から特定集団や濃縮された細胞集団を精製することができる。いくつかの実施形態において、他の方法を用いて、活性化された幹細胞から特定集団または濃縮された細胞集団を精製することができる。
４．活性化された幹細胞の分化
活性化された幹細胞集団および／またはその様々な分集団は、本明細書で開示された初期段階の前駆体に由来し、その多能性、例えば、適切な培養条件および培地を用いて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）のすべての細胞型に分化する能力によって識別することができる。細胞の分化状態の確認は、当業者に知られているように、細胞型特定マーカの同定によって行うことができる。
本開示は、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団の外胚葉系への分化を誘導する方法を提供する。また、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団に由来する、外胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。一態様においては、活性化された幹細胞は、外胚葉系の細胞型のうち少なくとも１つに分化することができる。別の態様においては、活性化された幹細胞は、外胚葉系の少なくとも２つ、少なくとも３つ、さらに最大ですべての細胞型に分化することができる。外胚葉系に分化する細胞の非限定的な例としては、上皮細胞、神経原性細胞、神経膠原性細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
他の態様において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団における様々な分集団を外胚葉系に分化誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている初期段階の前駆体に由来する、活性化された幹細胞集団における様々な分集団に由来する、外胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。他の態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞の分集団の外胚葉系への分化を誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている活性化された幹細胞の分集団に由来する、外胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。
また、本開示は、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団を中胚葉系に分化誘導する方法を提供する。また、本明細書で開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団に由来する、中胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。別の態様においては、活性化された幹細胞は、中胚葉系の細胞型の少なくとも１つに分化することができる。別の態様においては、活性化された幹細胞は、中胚葉系の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、さらには最大ですべての細胞型に分化することができる。中胚葉系に分化する細胞の非限定的な例としては、脂肪原性、平滑筋原性、軟骨原性、心原性、皮膚原性、造血原性、血管原性、筋原性、腎原性、尿原性、骨原性、心膜原性、または間質原性細胞が挙げられる、これらに限定されるものではない。
他の態様において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団における様々な分集団を中胚葉系に分化誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている初期段階の前駆体に由来する、活性化された幹細胞集団における様々な分集団に由来する、中胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。他の態様において、本明細書に開示されている活性化された幹細胞の分集団を中胚葉系に分化誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている活性化された幹細胞の分集団に由来する、中胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。
また、本開示は、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団を内胚葉系に分化誘導する方法を提供する。また、本明細書で開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞集団に由来する、内胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。一態様においては、活性化された幹細胞は、内胚葉系の細胞型の少なくとも１つに分化することができる。別の態様においては、活性化された幹細胞は、内胚葉系の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、さらには内胚葉系のすべての細胞型までに分化することができる。内胚葉系に分化する細胞の非限定的な例としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺などの細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
他の態様において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する、活性化された幹細胞集団における様々な分集団を内胚葉系に分化誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている初期段階の前駆体に由来する、活性化した幹細胞集団における様々な分集団に由来する内胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。他の態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞の分集団の内胚葉系への分化を誘導する方法も提供される。また、本明細書で開示されている活性化された幹細胞の分集団に由来する、内胚葉系の分化した細胞の組成物または集団も提供される。
５．利用方法
本開示は、本明細書に開示された初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞を用いて、それを必要とする被験者の疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する、活性化された幹細胞集団における１または複数の分集団を用いて、それを必要とする被験者の疾患を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞に由来する、分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者の疾患を治療する方法が提供される。再生医療は、損傷細胞、組織または臓器の修復、置換または再生を助けるために設計された治療法治療法を含む。本明細書で開示されている方法は、再生医療における細胞ベースの治療に使用する可能性がある。
いくつかの態様においては、本明細書に開示された方法および組成物は、変性疾患、増殖性障害、遺伝性疾患、傷害、および／または臓器不全などの疾患または病状を治療するために使用してよい。疾患や病状の非限定的な例としては、神経変性障害、認知機能障害、気分障害などの神経障害、難聴などの聴覚疾患、骨粗鬆症、心血管疾患、糖尿病、代謝障害、呼吸器疾患、薬物過敏症、黄斑変性症などの眼疾患、免疫疾患、血液疾患、腎臓疾患、増殖性障害、遺伝性障害、外傷、脳卒中、臓器不全または四肢の欠損などが挙げられる。疾患の他の例としては、神経変性障害、神経障害、眼疾患、気分障害、呼吸器疾患、聴覚疾患、心血管疾患、免疫疾患、血液疾患、代謝疾患、腎臓疾患、増殖性障害、遺伝性障害、自己免疫疾患、薬物過敏症、認知機能障害、うつ病、難聴、骨粗鬆症、糖尿病、黄斑変性症、肥満、アレクサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、失調性毛細血管拡張症、バッテン病、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底部変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、ロイウィー体認知症、マチャド・ジョセフ病、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコレプシー、神経膠腫症、パーキンソン病、ペリザウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフスム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血による亜急性複合脊髄変性症、統合失調症、脊髄小脳失調症、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、Ｓｔｅｅｌｅ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ－Ｏｌｓｚｅｗｓｋ症候群、脊髄癆、後天性免疫不全症、白血病、リンパ腫、過敏症（アレルギー）、重症複合免疫不全症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、皮膚筋炎、１型糖尿病、２型糖尿病、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭部関節炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈瘤、狭心症、不整脈、動脈硬化、心筋症、石灰沈着性大動脈弁疾患（ＣＡＶＤ）、脳血管障害（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患、心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧症、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞、静脈血栓塞栓症、酸性リパーゼ病、アミロイドーシス、バース症候群、ビオチニダーゼ欠損症、カミチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症ＩＩ型、中心性歯髄融解症、筋ジストロフィー、ファーバー病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ガングリオシド症、トリメチルアミン尿症、レッシュ－ナイハン症候群、脂質貯蔵疾患、代謝性ミオパチー、メチルマロン酸尿症、ミトコンドリアミオパチー、ムコリピド症、ムコ多糖症、多重ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、ノンケトーシス性高グリシン血症、ポンペ病、プロピオン酸血症、Ｉ型グリコーゲン貯蔵病、尿素サイクル障害、高オキサルール症、オキサロシス、癌、肉腫、生殖細胞腫瘍、芽球性腫瘍、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚黒色腫、乳癌、子宮内膜癌および卵巣癌などが挙げられる。
一態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要としている被験者の皮膚傷を治療する方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者の肝臓損傷を治療する方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者における骨損傷または病状（例えば、関節炎、骨粗鬆症など）を治療する方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者における神経損傷または神経細胞変性疾患を治療する方法が提供される。一態様において、本明細書に開示されている活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者の心臓組織損傷または心不全を治療する方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されているような活性化された幹細胞またはそれに由来する分化した細胞を用いて、それを必要とする被験者において糖尿病などの慢性疾患を治療する方法が提供される。
一態様においては、本明細書に開示されている活性化または分化した細胞の自己移植の方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている活性化または分化した細胞の同種移植の方法が提供される。一態様においては、本明細書に開示されている活性化または分化した細胞の同系移植の方法が提供される。
実施例
実施例１：ヒト成人組織からの初期段階の前駆体の単離
ヒト成人組織から初期段階の前駆体を単離するために、以下の方法が使用された。試験されたヒト成人組織には、ヒト末梢血、臍帯血、骨髄および臍帯などが含まれる。一実験では、ヒト末梢血は、カリフォルニア州スタンフォードのスタンフォード血液センタで採取された。すべての献血者は、書面によるインフォームド・コンセントを提供した。ヒト末梢血５－１０ｍｌをリチウムヘパリンチューブ（ＢＤ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に採取し、４℃で保存した。別の実験では、産科で分娩時に臍帯血を採取し、４℃で保存した。臍帯組織も採取し、４℃で保存した。別の実験では、ヒト初期段階の前駆体を単離するために骨髄を採取した。他のヒト組織サンプルもうまく利用できた。
以下の方法を使用して、末梢血や臍帯血などの血液サンプルから初期段階の前駆体を単離した。赤血球（ＲＢＣ）を溶解するために、採取した血液サンプルをヒト赤血球溶解緩衝剤(Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社)と１：１０の割合で混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、懸濁液を３，０００～１５，０００ｘｇで４０分間、４℃で遠心分離した。ペレットを洗浄し、５ｍｌの１Ｘ ＰＢＳに再懸濁した後、３，０００～１５，０００ｘｇで４０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、初期段階の前駆体を含むペレットを５ｍｌのＰＢＳまたは培養培地（例えば、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）に再懸濁してさらなる分析を行うか、または後述の実施例２に記載されている活性化／発達システムで培養した。
再懸濁したペレットには、平均直径が６μｍ以下の比較的小さな細胞の集団が濃縮されていた（図１）。以下に示すように、これらの細胞の少なくとも大きな割合は初期段階の前駆体である。ヘキスト３３３４２で染色すると、これらの単離された初期段階の前駆体は、非常に高い核－細胞質比率を有することを示した（図２、点線矢印）。活性化／発達システムで１日間培養すると、初期段階の前駆体の一部では、ヘキスト３３３４２核酸染色が細胞膜の外側に拡散した（図２、実線矢印）。単離された初期段階の前駆体の一部はクラスタ化し、別の前駆体と融合するように見えた（図２、丸で囲んだ部分）。蛍光抗体法（ＩＦ）と蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）による解析を用いて、初期段階マーカで発現する細胞マーカを調査した。その結果、濃縮された小細胞集団には、異質な細胞が混在していた。活性化可能な細胞の大部分は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ４５、ＣＤ１０５、および発現量が非常に低いレベルであるＣＤ３４を発現した。これらの細胞で調査されたが検出されなかったマーカは、ＡＢＣＧ２（活性化した前駆体細胞のマーカ）とＬｉｎ（造血器系のマーカ）のほか、ＣＤ９０、Ｌｉｎ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４１なども含む。
初期段階の前駆体は、細胞ペレットからさらに精製または濃縮された。ＣＤ４９ｆ＋細胞画分は、製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンディエゴ）が推奨するプロトコルに従って、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳによって濃縮された。濃縮された細胞集団は、次に、さらなる分析または活性化／発達システムのために調製された。別の手法では、初期段階の前駆体を含む比較的小さな細胞の単離された集団を、活性化／発達システムで培養した後、濃縮／精製した。
実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏで初期段階の前駆体の活性化／発達
上記の実施例１に記載されているように、ヒト成人組織から得られた初期段階の前駆体の活性化／発達を促進するために、以下の方法を用いた。ヒト初期段階の前駆体をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化・培養するための活性化／発達システムを開発した。
細胞融合
ヒト成人組織から得られた初期段階の前駆体を含む比較的小さな細胞の集団を培養すると、細胞融合が観察された。ヒト初期段階の前駆体を含む細胞ペレットを、１ｍｌの５０％ＰＥＧ１５００に穏やかに再懸濁し、室温で２分間インキュベートした。次に１ｍｌの無血清α－ＭＥＭを緩慢に加え、室温で細胞を３０分間インキュベートした。次に、懸濁液を３，０００～１５，０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清液を除去し、細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、活性化／発達システムで培養した。
その他の試験された細胞融合方法としては、電気的細胞融合（または電気融合）、ウイルス（例えば、センダイウイルス）による細胞融合、機械的な張力による駆動される細胞融合（例えば、マイクロインジェクション）、および／または集中／高速遠心分離による引き起こされる細胞融合などが挙げられる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化／発達
細胞培養で初期段階の前駆体の活性化／発達を促進するために、活性化／発達システムを調製した。このシステムでは、初代肝細胞および／または肝細胞株の細胞、またはそれらの細胞混合物、およびその他の試薬および因子を含む培地が採用された。活性化／発達システムは、トランスウェルを用いた共培養システムであってもよく、後述の馴化培地を用いてもよい。
共培養システムでは、細胞（初代肝細胞、または培養肝細胞株、または細胞混合物）をマイトマイシンＣで２時間処理し、細胞を分裂不活性化した。次に、１０％ＦＢＳを含む細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で６－ウェルプレートに接種した。接種から約１６時間後、細胞はウェルに付着し、約８０％のコンフルエント状態になった。次に、単離された初期段階の前駆体をトランスウェル（２４ｍｍインサート、Ｃｏｒｎｉｎｇ社，コーニング、ニューヨーク）の上室に配置し、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭの共培養培地で上述の細胞と共培養した。単離された初期段階の前駆体は、トランスウェル膜（孔径０．４μｍ）によって不活性化された細胞から分離された。培養培地は上段、下段のチャンバともに同じものを使用し、１日おきに交換して、約１０～２０日間使用した。
別の手法では、初代肝細胞、または培養肝細胞株、またはそれらの混合物で細胞培養培地を調整した。１０％ＦＢＳまたはヒト血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した後、細胞を細胞培養皿に播種しました。２日ごとに細胞培養皿から培地を回収し、その後、細胞が１００％コンフルエントになるまで新しい培地を細胞培養皿に加えた。異なる時間に採取した培地を一緒に混合でき、短期保存の場合は－２０℃、または長期保存の場合は－８０℃で保存することができる。使用前に、馴化培地を３０００ｘｇで遠心分離し、培地中の残りの細胞をペレット化した。また、馴化培地を０．２２μｍのフィルタでろ過して、残りの細胞を取り除くこともできる。次に、この馴化培地を通常の培養培地（例えば、１０％ＦＢＳまたはヒト血清を含むα－ＭＥＭ）と約１：３～約３：１の割合（ｖ／ｖ）で混合した。別の実験では、単離された初期段階の前駆体を培養するために、混合せずに馴化培地を直接使用した。単離された初期段階の前駆体は、上述の培地に穏やかに再懸濁された後、培養皿またはプレートに播種された。培地の交換は１日おきに行った。細胞培養は毎日顕微鏡で観察し、細胞の成長と細胞コロニーの形成を確認した。細胞コロニーを採取し、例えば、免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析を使用して、さらなる分析のために幹細胞を精製した。
免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果により、活性化／発達システムで培養してから１２日目に、初期段階の前駆体の一部の間に細胞融合が示された。Ｏｃｔ４を発現している初期段階の前駆体を含む比較的小さな細胞間（図３Ａ、実線矢印）、および、Ｏｃｔ４＋細胞とＯｃｔ４－細胞の間（図３Ａ、点線矢印）で、細胞融合が観察された。融合した細胞は、ＳＳＥＡ１（図３Ｂおよび図３Ｄ）およびＣＤ３４（図３Ｃおよび図３Ｄ）も発現した。
上述の活性化／発達システムで４週間培養した後の活性化された幹細胞について、マーカの発現を研究した。その結果、実施例１の初期段階の前駆体に由来する活性化された幹細胞は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、ＡＢＣＧ２を発現していた。活性化された細胞は、Ｌｉｎ２８、ＣＤ４４、ＣＤ１８４、ＣＤ１０６も発現しており、ＣＤ３４も低いレベルであった。これらの活性化された幹細胞は、Ｌｉｎ、ＣＤ１１７、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１５０、ＣＤ９０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ８またはＣＤ４１を発現しなかった。
活性化／発達システムで１２日間培養した後、活性化された幹細胞は初期段階の前駆体よりも大きくなり、形状も変化した（図４）。通常の培地（例えば、１０％ＦＢＳを含むα－ＭＥＭ）で培養した初期段階の前駆体は成長しなかった（図４）。初期段階の前駆体に由来する細胞コロニーが、活性化／発達システムで観察された（図５に示す５日目の細胞コロニーを参照）。活性化された幹細胞はＣＤ４９ｆ＋で、コロニーからさらに精製された。
実施例３：増殖マーカ、成長因子およびサイトカインの発現
上記実施例２に記載した活性化された幹細胞における増殖マーカ、成長因子およびサイトカインの発現レベルを以下の方法を用いて評価した。ＲＴ－ＰＣＲを用いて、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ－１およびｃ－Ｍｙｃを含む増殖マーカ、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＬ－６およびＩＬ１０を含む成長因子およびサイトカインの発現レベルを検出した。内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた。また、成長因子およびサイトカインのレベルをＩＦなどの方法で評価した。その結果、活性化された幹細胞の集団は、増殖マーカであるＣｙｃｌｉｎ Ｄ１やｃ－Ｍｙｃ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＨＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ１０などの成長因子およびサイトカインを発現した。活性化された幹細胞はＨＬＡ－ＩＬｏｗ／ＨＬＡ－ＩＩ－であり、免疫原性が低いことを示している。その結果、活性化された幹細胞の集団は、アルブミンとＡＦＰ（内胚葉特定マーカ）、オステオカルシンとデスミン（中胚葉特定マーカ）、ネスチン（外胚葉特定マーカ）を発現しており、活性化された幹細胞が多能性を持つ可能性をさらに示した。
実施例４：皮膚傷の治療
実施例２で調製した活性化された幹細胞の集団を用いて、以下の方法で皮膚傷を治療した。
フィブリンゲルスカフォールドおよび３次元構造体の調製
フィブリノゲンとトロンビンのストック溶液を解凍し、最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンと２．５Ｕ／ｍｌのトロンビンにＣａＣｌ２（最終濃度４５ｍＭ）を加えて１．５ｍｌチューブに入れて一緒に混合し、フィブリンゲルを作製した。混合物の２００μｌを２４ウェルプレートに穏やかにピペッティングした。このフィブリノゲン含有物を、３７℃で２時間かけてフィブリンゲルスカフォールドを形成させた。実施例２で調製した活性化された幹細胞を、２４ウェルプレートまたは４８ウェルプレートの１ウェルあたりフィブリンゲルスカフォールドの上に２．５×１０５個播種し、１ウェルあたり０．５ｍｌまたは１ｍｌの馴化培地で一晩培養した。このようにして作られた細胞／スキャフォールドの３次元構造体は、次の移植の準備が整った。別の方法では、活性化された幹細胞をフィブリノゲン、トロンビンおよび馴化培地と予め混合した後、２４ウェルプレートまたは４８ウェルプレートに播種した。フィブリンゲルが形成された後（例えば、約２時間後）、０．５または１ｍｌの馴化培地を各ウェルに加え、細胞／スキャフォールドの３次元構造体を一晩培養すると、移植の準備が整う。また、実験の前にフローサイトメトリを行い、細胞／スキャフォールドの３次元構造体の中で培養された細胞の特徴を調べた。
全層皮膚傷の治療
皮膚を準備した後、１０－１２週齢の免疫不全（ヌード）オスマウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｓ）１０匹に、イソフルラン麻酔下で中背皮に直径６ｍｍの全層パンチバイオプシ傷をつけた。傷口の収縮を抑制するために，厚さ１．６ｍｍのシリコーンシート（Ｐｒｅｓｓ－ｔｏ－Ｓｅａｌ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｈｅｅｔ ＪＴＲ－Ｓ－２．０，Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ，Ｂｅｎｄ，ＯＲ）で作製したドーナツ型のスプリント（内径１０ｍｍ、外径１４ｍｍ）を創傷部の周囲に配置し，６－０ナイロン縫合糸（６－０ Ｅｔｈｉｌｏｎ Ｎｙｌｏｎ Ｓｕｔｕｒｅ，Ｅｔｈｉｃｏｎ ＬＬＣ．，Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）を用いて８本の断続的な縫合糸で固定した。次に、上述の細胞／スキャフォールドの３次元構造体（約２５０,０００細胞／構造体）を創傷床に移植した（ｎ＝５）。また、幹細胞を含まないフィブリンゲル（スキャフォールドのみ）を対照として創傷床に移植した（ｎ＝５）。傷口を覆うために、トリミングされた無菌Ｔｅｇａｄｅｒｍ透明フィルムドレッシング（３Ｍ）をスプリントの上部に貼り付けた。
皮膚創傷治癒解析
傷口の写真画像を、傷口ができてから毎日、一定の距離からデジタルカメラで撮影した。傷口面積を総体的に評価するために、元の傷口面積に対する現在の傷口の割合を計算して、傷口面積を解析した。傷口が完全に閉じたと考えられるのは、傷口面積が総じてゼロになったときである。
処置後２０日目にＣＯ２でマウスを安楽死させた。皮膚の創傷部分と周辺組織（約２．５ｃｍ）を採取し、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルムアルデヒドで４℃で１６時間以上固定するか、液体窒素中でスナップフローズンした後、パラフィン包埋または凍結切片に処理した。標本を５μｍの厚さの切片にスライスし、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、局所的な細胞の変性や炎症を調査した。創傷領域の組織の線維化を評価するために、マソンズトリクロームによるコラーゲン染色を実行した。考慮した組織学的パラメータは、創傷閉鎖率、再上皮化、真皮再生、線維性沈着、および炎症である。皮膚付属物の再生は、創傷床にある毛包や皮脂腺の数を数えて評価した。さらに、一部の皮膚のパラフィン切片（５μｍ）を免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光抗体法（ＩＦ）のために処理した。
画像を解析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて創傷閉鎖率の割合と瘢痕面積の割合を算出した。コラーゲン沈着物解析は、赤い色の領域（細胞構造領域）を青い色の領域（コラーゲン沈着物）に基づいて割ったものである。統計解析は、２つの群を比較するために、ペアリングされた、両側のスチューデントのＴテストを用いて行われた。ｐ＜０．０５の値を統計的に意味深いと考えられた。
糖尿病性皮膚創傷の治療
糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を用いて、上述の細胞／スキャフォールドの３次元構造体の創傷治癒効果を研究した。皮膚の準備後、６ヶ月以上の糖尿病マウス１０匹（体重６０～８０ｇ）を用いて、イソフルラン麻酔下で中背皮に慢性創傷を生成させた。次に、上述の細胞／スキャフォールドの３次元構造体（約２５０，０００細胞／構造体）を創傷床に移植した（ｎ＝５）。また、幹細胞を含まないフィブリンゲル（スキャフォールドのみ）を対照として創傷床に移植した（ｎ＝５）。傷口の写真画像は、傷口ができてから毎日撮影し、上述のように評価した。治療後６５日目（Ｄ６５）に糖尿病マウスをＣＯ２で安楽死させた。前述のとおり、皮膚の創傷部分と周辺組織を採取し、組織学的分析と治療効果の評価を行った。
結果
実施例２で調製した活性化された幹細胞の創傷治癒においての治癒可能性を研究するために、３次元細胞／スキャフォールドの構造体を作製し、免疫不全マウスの全層皮膚創傷に適用した。活性化された幹細胞を予めフィブリンゲルに播種し（またはフィブリンゲルに予め混合し）、移植前に一晩培養したところ、細胞はしっかりと成長し、フィブリンゲル上でコンフルエントな状態を示した。
治療群（細胞／スキャフォールドの３次元構造体を用いた場合）は、閉鎖時間、瘢痕面積が著しく減少し、創傷床内の血管新生が促進されたことを示した（図６）。形態学的な画像解析の結果、３次元構造体による治療は、創傷後５日目という初期段階で創傷の回復を著しく改善し、６日目にはより顕著になった。累積画像解析の結果、治療後の創傷治癒は対照群と比較して統計的に大きく改善された。３次元構造体で処理された傷口はすべて１０日目に閉じたが、対照群の傷は１５日目まで開いたままであった。
組織学的評価の結果、犠牲の最終日（２０日目）に、対照群と比較して治療群の動物の傷口の再上皮化が促進されていた。対照群と比較して、傷口の表面積や瘢痕領域が著しく小さくなった。治療したすべての動物の皮膚は、表皮と真皮の組織構造がほぼ正常であることを示した。
糖尿病皮膚創傷モデルでは、細胞／スキャフォールドの３次元構造体を治療した糖尿病マウスの創傷治癒が促進されるという結果が得られた。組織学的評価によると、治療群のマウスの傷口は、対照群と比較して、犠牲の最終日に再上皮化と皮膚構造の回復が促進されていた。それに比べて対照群の傷口は、皮下組織や筋肉組織がなく、角質化した表皮層でしか閉じられていなかった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（１）少なくとも一部分の赤血球を血液サンプルから除去することと、
（２）３，０００ｘｇ－１５，０００ｘｇでサンプルを遠心分離してペレットを取得することと、
（３）ペレット内の細胞を溶液に懸濁させることと、
（４）ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞を溶液中で濃縮することと
を備えて、前記溶液中の前記細胞の少なくとも４０％が、ＣＤ４９ｆを発現し、６μｍ未満の直径を有するＣＤ４９ｆ ＋ 細胞である
細胞集団を調製する方法。
（項目２）
前記サンプルを５,０００ｘｇ超で遠心分離する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記サンプルを７,０００ｘｇ超で遠心分離する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、さらにＳＳＥＡ４に陽性である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、さらにＡＢＣＧ２およびＬｉｎに陰性である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、さらにＣＤ７３およびＣＤ４５に陽性であって、ＣＤ４およびＬｉｎ２８に陰性である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ３１、ＣＤ１１７、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカをさらに発現する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４１からなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記溶液中の前記細胞の２０％未満が、赤血球である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞の直径が５μｍ未満である、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞は、核と細胞質の比率（ｖ／ｖ）が、少なくとも約９：１である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
細胞の少なくとも４０％が、ＣＤ４９ｆを発現し、６μｍ未満の直径を有するＣＤ４９ｆ ＋ 細胞である、
少なくとも１０００個の前記細胞を含む、組成物。
（項目１３）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞は、さらにＳＳＥＡ４に陽性である、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞は、さらにＡＢＣＧ２およびＬｉｎに陰性である、項目１２または１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞は、さらにＣＤ７３およびＣＤ４５に陽性であって、ＣＤ４およびＬｉｎ２８に陰性である、項目１２から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ３１、ＣＤ１１７、およびＣＤ１０５からなる群から選択される１または複数のマーカをさらに発現する、項目１２から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４１からなる群から選択される１または複数のマーカを発現しない、項目１２から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞は、核と細胞質の比率（ｖ／ｖ）が、少なくとも約９：１である、項目１２から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
前記ＣＤ４９ｆ ＋ 細胞が、１または複数の因子を含む培地によって活性化され、活性化された細胞がＡＢＣＧ２を発現する、項目１２から１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
（ａ）直径が６μｍ未満であり、（ｂ）ＣＤ４９ｆを発現し、および（ｃ）ＡＢＣＧ２を発現しないヒト細胞の集団に由来する幹細胞の集団であって、前記幹細胞の集団が、ＡＢＣＧ２を発現し、異種細胞の集団である、幹細胞の集団。

Claims (13)

  1. 少なくとも１０００個の細胞を含む組成物であって、該細胞の少なくとも４０％がＣＤ４９ｆ＋細胞であり、６μｍ未満の直径を有し、該ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ヒトの血液から得られ、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ１１７を発現し、ＣＤ９０およびＡＢＣＧ２を発現しない、組成物。
  2. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＳＳＥＡ４において陽性であるとさらに特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＣＤ３１において陽性であり、Ｌｉ２８およびＬｉｎにおいて陰性であるとさらに特徴づけられる、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＣＤ７３およびＣＤ４５において陽性であり、ＣＤ４において陰性であるとさらに特徴付けられる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＣＤ１０５をさらに発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４１を発現しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記細胞の少なくとも５０％がＣＤ４９ｆ＋細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記細胞の少なくとも６０％がＣＤ４９ｆ＋細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 少なくとも１００００個の細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記細胞の２０％未満が赤血球である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞の直径が５μｍ未満である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞の直径が、２μｍ～５μｍである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記ＣＤ４９ｆ＋細胞が、少なくとも９：１、または少なくとも８：１、または少なくとも７：１、または少なくとも６：１、または少なくとも５：１である核と細胞質の比率（ｖ／ｖ）を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
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