CN104357380A - 一种人表皮干细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人表皮干细胞的分离方法。该方法包括如下步骤：(1)将离体的人的皮肤组织用DispaseⅡ进行处理；再用胰蛋白酶进行消化处理；(2)将消化处理后的体系静置，分别取沉淀和上清液；(3)将静置所得的上清液进行终止消化，离心，弃上清，取沉淀；对沉淀进行重悬，得到组织液1；(4)将静置所得的沉淀用胰蛋白酶进行消化处理后过滤；(5)将过滤所得的滤液进行终止消化，离心，弃上清，得到组织液2；(6)将组织液1和组织液2混合，得到组织液3，对组织液3进行重悬；(7)对组织液3中的细胞进行筛选，得到人表皮干细胞。本发明的方法具有温和、快速、高效分离表皮干细胞的特点。

Description

一种人表皮干细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人表皮干细胞的分离方法。

背景技术

表皮干细胞是维持皮肤发生、修复以及重塑的关键性源泉，更是皮肤出现创伤后促进皮肤创伤愈合的关键性细胞。因此，表皮干细胞在组织工程皮肤的构建以及再生医学领域都起着重要的作用，也越来越受到人们的关注。

从人皮肤组织中快速高效的分离得到表皮干细胞是近年来学者们研究的重点。目前，皮肤组织分离表皮干细胞方法是利用酶消法或者组织块法等。酶消法以其作用温和、对细胞损伤小而广受关注。但是常规的方法是将组织消毒后直接用手术刀分离表皮、真皮及脂肪组织。对细胞损伤较大，且分离的表皮组织中容易混入其他类细胞。两步酶法也有应用，但是因为通常使用0.25％的胰蛋白酶来分离表皮和真皮组织，酶的浓度较高，所以可能会引起细胞的破坏。因此，建立一种低损伤、更适宜分离表皮干细胞的方法十分具有研究价值。

发明内容

本发明提供了一种人表皮干细胞的分离方法。

本发明所提供的人表皮干细胞的分离方法包括如下步骤：

(1)将离体的人的皮肤组织进行消毒、去除脂肪组织；

(2)将经步骤(1)处理后的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；

(3)将经步骤(2)处理后的组织的真皮部分和表皮部分撕开，并将表皮部分剪碎，用胰蛋白酶进行消化处理；

(4)将经步骤(3)消化处理后的体系静置，分别取沉淀和上清液；

(5)将经步骤(4)静置所得的上清液进行终止消化，离心，弃上清，收集沉淀；对所述沉淀进行重悬，得到组织液1；

(6)将经步骤(4)静置所得的沉淀用胰蛋白酶进行消化处理；

(7)将经步骤(6)处理后的体系进行过滤，取滤液；

(8)将经步骤(7)过滤所得的滤液进行终止消化，离心，弃上清，得到组织液2；

(9)将组织液1和组织液2混合，得到组织液3；对所述组织液3进行重悬；

(10)用流式细胞仪对步骤(9)所得的组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人表皮干细胞。

上述方法中，所述人的皮肤组织进行消毒包括如下步骤：将人的皮肤组织放入碘酊中浸泡3min，在放入75％的酒精中浸泡洗涤3min，最后用DPBS浸泡漂洗3次，每次漂洗3min。

上述方法中，所述在用Dispase Ⅱ进行处理前还包括将所述经步骤(1)处理后的皮肤组织剪成5mm×5mm小块的步骤。

上述方法中，所述用Dispase Ⅱ进行处理的温度是4℃；所述处理的时间是过夜。

上述方法中，所述用胰蛋白酶进行消化处理的方法为将所述剪碎的表皮放入质量分数为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液中，进行消化处理。

上述方法中，所述质量分数为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液的配制方法：用DPBS溶液将质量分数为0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液稀释至质量分数为0.125％。

上述方法中，所述消化处理的温度为37℃；所述消化处理的时间为10min；所述消化处理的过程中每分钟摇1次。

上述方法中，所述终止消化的方法是向所述步骤(4)所得的上清液或步骤(7)所得的滤液中加入培养基1。

上述方法中，所述重悬使用培养基1。

上述方法中，所述培养基1是含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基。

上述方法中，所述过滤的方法为用100μm和40μm的滤膜依次进行过滤。

上述方法中，所述离心的温度为4℃；所述离心的速度为360g；所述离心时间为8min。

上述方法中，所述筛选是选择同时具有β1整合素和CD49f细胞表面标志物的细胞。

本发明的另一个目的是提供上述所述的方法在分离人表皮干细胞中的应用。

本发明提供了一种人表皮干细胞的分离方法。本发明的方法具有温和、高效、快速分离表皮干细胞的特点。本发明采用的双酶法条件温和，对细胞损伤小；经过多次消化，获得的表皮干性细胞量大且分离的细胞较为充分彻底；通过流失分选细胞，能够快速的筛选出阳性反应的表皮干细胞，得到的表皮干细胞更为纯净。

附图说明

图1为双酶法β-integrin1标记的流式检测结果。

图2为常规方法β-integrin1标记的流式检测结果。

图3为双酶法CD49标记的流式检测结果。

图4为常规方法CD49标记的流式检测结果。

图5双酶法两种抗体同时标记结果。

图6为常规方法两种抗体同时标记结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料：手术废弃的人的包皮组织，将其放在保存液中保存，待用。

Dispase Ⅱ工作液配制方法：向20mL的DPBS中加入0.1％的BSA与0.25％的分散酶(Dispase Ⅱ)；Dispase Ⅱ可购买于Roche，产品目录号为4942078001。

质量分数为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液的配制方法：用DPBS溶液将质量分数为0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco，25200056)稀释至质量分数为0.125％。

实施例1、人表皮干细胞的分离方法

1、消毒：先将包皮组织放入碘酊中充分浸泡3min，在放入75％的酒精中充分浸泡洗涤3min，最后用DPBS(Gibco，70013-032)浸泡漂洗3次，3min/次。

2、将步骤1中消毒后的包皮组织上的脂肪组织剪下，丢弃；并将皮肤部分剪成5mm×5mm小块，放入装有Dispase Ⅱ工作液的离心管中，4℃处理过夜。

3、将皮肤组织取出，用镊子将真皮和表皮部分撕开，并将表皮部分浸入DPBS里。

4、将表皮部分剪碎，放入装有8mL浓度为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液中，37℃条件下消化处理10min，每分钟摇1次。

5、将步骤4中处理后的表皮组织静置沉淀1min，得到沉淀组织和上清液。

6、取上清液加入DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))终止消化，消化后在4℃条件下360g离心8min，弃上清，用DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))对上清液中的细胞进行重悬计数，重悬至细胞浓度约为每毫升1.15×10⁷个。

7、将步骤5中的沉淀组织中继续加入0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化处理10min(37℃)，每分钟摇1次。

8、将步骤7中消化处理后的组织依次用100μm和40μm的滤膜进行过滤，除去未消化的表皮组织。

9、向过滤后的组织溶液中加入DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))终止消化。

10、将步骤9中的消化处理后的组织溶液在4℃条件下360g离心8min，弃上清，得到沉淀液。

11、将步骤6重悬后的上清液和步骤10中的沉淀液混合，用DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))对混合液中的细胞进行重悬计数至浓度为2.5×10⁵个/mL，并将其接种在培养瓶中。

12、利用流式细胞仪对培养瓶中的细胞表面标志物(β1整合素、CD49f、β1整合素和CD49f进行双标记)进行阳性率检测，筛选出双阳性的细胞，即人的表皮干细胞，并将其培养在DMEM培养基(含有50ng/mL的上皮生长因子(EGF)和1μg/mL的牛垂体提取物(BPE))中。

实施例2、常规方法分离表皮干细胞

将包皮组织从组织保存液中取出(生理盐水)，浸泡于75％酒精中洗涤，再用DPBS漂洗；将组织上的脂肪组织剪下丢弃，将皮肤剪切成5mm×5mm的小块，直接用镊子将表皮和真皮组织轻轻撕开；将表皮组织浸泡在DPBS中，取出，剪碎，置于0.25％的胰蛋白酶中，37℃，酶处理10min；将酶解液过100μm和40μm的滤膜过滤，将上清液离心，4℃，360g离心10min；弃上清，用(含有10％的胎牛血清(FBS))培养基悬起细胞，培养于DMEM培养基(含有50ng/mL的上皮生长因子(EGF)和1μg/mL的牛垂体提取物(BPE))中。

实施例3、流式细胞仪检测细胞荧光阳性反应

Blocking solution(封闭液)制备方法：体积分数为95％的PBS(GIBCO，14190144)与体积分数为5％的FBS(Hyclone，SH30084.03)混合制备而成。

Stainning solution制备方法：体积分数为98％的PBS(GIBCO，14190144)与体积分数为2％的FBS(Hyclone，SH30084.03)混合制备而成。

一、细胞免疫荧光染色

1、封闭：Blocking solution封闭30min，RT；

2、将细胞平均分装至3支流式细胞管中，49μL/支；Tube1：空白对照(不染色)；Tube2：β1整合素；Tube3：CD49f；

3、染色：分别按照试验设计加入抗体1μL/管，空白对照加入Blocking solution 1μl，冰上孵育40min；

4、洗涤：staining solution 4ml/管，离心洗涤1000rpm，8min 4℃，洗涤3次，小心弃上清；

5、流式备用：staining solution 500μl分别悬起细胞，同时40μm过滤膜，置于冰上，备用。

将实施例1和2中得到的表皮细胞分别经过流式细胞仪检验，进行表皮干细胞的分离和鉴定，结果如表1和图1-图6所示。结果表明：采用双酶法分离的表皮干细胞的阳性率较常规方法高，该方法可以较为有效的分离纯化表皮干细胞。

表1、双酶法分离表皮干细胞阳性率与常规方法对比结果

Claims (10)

1.一种人表皮干细胞的分离方法，包括如下步骤：

(1)将离体的人的皮肤组织进行消毒、去除脂肪组织；

(2)将经步骤(1)处理后的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；

(3)将经步骤(2)处理后的组织的真皮部分和表皮部分撕开，并将表皮部分剪碎，用胰蛋白酶进行消化处理；

(4)将经步骤(3)消化处理后的体系静置，分别取沉淀和上清液；

(5)将经步骤(4)静置所得的上清液进行终止消化，离心，弃上清，收集沉淀；对所述沉淀进行重悬，得到组织液1；

(6)将经步骤(4)静置所得的沉淀用胰蛋白酶进行消化处理；

(7)将经步骤(6)处理后的体系进行过滤，取滤液；

(8)将经步骤(7)过滤所得的滤液进行终止消化，离心，弃上清，得到组织液2；

(9)将组织液1和组织液2混合，得到组织液3；对所述组织液3进行重悬；

(10)用流式细胞仪对步骤(9)所得的组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人表皮干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人的皮肤组织进行消毒包括如下步骤：将人的皮肤组织放入碘酊中浸泡3min，在放入75％的酒精中浸泡洗涤3min，最后用DPBS浸泡漂洗3次，每次漂洗3min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述在用DispaseⅡ进行处理前还包括将所述经步骤(1)处理后的皮肤组织剪成5mm×5mm小块的步骤。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述用DispaseⅡ进行处理的温度是4℃；所述处理的时间是过夜。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述用胰蛋白酶进行消化处理的方法为将所述剪碎的表皮放入质量分数为0.125％的胰蛋白酶-EDTA溶液中，进行消化处理；所述消化处理的温度为37℃；所述消化处理的时间为10min；所述消化处理的过程中每分钟摇1次。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述终止消化的方法是向所述步骤(4)所得的上清液或步骤(7)所得的滤液中加入培养基1；所述重悬使用培养基1；所述培养基1是含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述过滤的方法为用100μm和40μm的滤膜依次进行过滤。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述离心的温度为4℃；所述离心的速度为360g；所述离心时间为8min。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述筛选是选择同时具有β1整合素和CD49f细胞表面标志物的细胞。

10.权利要求1-9所述的方法在分离人表皮干细胞中的应用。