RU2502999C1 - Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи - Google Patents
Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2502999C1 RU2502999C1 RU2012131976/15A RU2012131976A RU2502999C1 RU 2502999 C1 RU2502999 C1 RU 2502999C1 RU 2012131976/15 A RU2012131976/15 A RU 2012131976/15A RU 2012131976 A RU2012131976 A RU 2012131976A RU 2502999 C1 RU2502999 C1 RU 2502999C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- homogenate
- temperature
- skin cell
- sodium chloride
- cell population
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области фармацевтики и биологии и представляет собой способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. Изобретение обеспечивает разделение клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для получения и исследования жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.
Наиболее близким к предлагаемому является способ разделения пулов 26S- и 20S-протеасом из цитоплазматической фракции клеток [Патент РФ №2427623, кл. C12N 1/00, С07K 14/00, C12Q 1/68, 2011], включающий гомогенизацию ткани в буфере, центрифугирование гомогената при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°С с получением цитоплазматической фракции, инкубацию цитоплазматической фракции с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°C и разделение белков цитоплазматической фракции.
Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является невозможность разделения клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.
При осуществлении изобретения поставленная задача решается за счет достижения технического результата, который заключается в разделении клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.
Указанный технический результат достигается способом получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымыванием рабочей камеры гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.
Забор биоптата кожи проводят на глубину 2 мм, для того чтобы практически не захватывать подкожно жировой слой, но забирать эпидермис и дерму. Это позволяет проводить исследование без проведения ферментной обработки, что снижает опасность действия фермента и благоприятно сказывается на жизнеспособности клеток кожи и исключает их возможную активацию.
Гомогенизацию ткани проводят в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C. 0,9% водный раствор хлорида натрия является наиболее близкой средой к условиям жизнедеятельности клетки кожи в живом организме. При использовании других веществ возможно их поступление через мембрану внутрь клетки и последующее ее разрушение или наоборот, диффузия раствора из клетки наружу с последующей ее гибелью. Температура +23…+25°C является оптимальной для данного способа.
Для того чтобы полностью извлечь все клетки кожи из рабочей камеры гомогенизатора проводят вначале отсасывание гомогената стерильным шприцем, а затем трижды вымывают 0,9% водным раствором хлорида натрия.
Фильтрование гомогената проводят через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, чтобы отделить строму и пропустить все клетки кожи в раствор. Если диаметр пор будет меньше 20 мкм, то в фильтре задержатся некоторые крупные клетки кожи, например фибробласты или макрофаги. Если диаметр пор будет больше 20 мкм, то не отфильтруется строма, что негативно повлияет на результаты дальнейших исследований. В качестве инертного материала фильтровальной перегородки может использоваться, например, нейлон.
Центрифугирование гомогената проводят при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. При данных условиях центрифугирования осаждаются все нужные клетки кожи и удаляется надосад очная жидкость.
Пример осуществления предлагаемого способа приведен ниже.
Забор биоптата кожи размером 2×2×2 мм проводили с ягодичной области человека с помощью дракара DERMO-PUNCH (2 мм) (STERYLAB, Италия). Далее биоптат кожи и 1 мл 0,9% водного раствора хлорида натрия помещали в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). Гомогенизацию ткани проводили в течение 30 секунд при температуре +23…+25°C. Затем извлекали гомогенат стерильным шприцем и трижды вымывали рабочую камеру гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл.
После чего фильтровали гомогенат через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее центрифугировали гомогенат для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.
После этого определяли жизнеспособность клеток с помощью витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SSLin) и регистрацией флуорисценции (7-AAD).
На чертеже представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в образце в результате предлагаемого способа.
Известно, что популяция клеток кожи считается жизнеспособной, если в ней содержится не менее 85% живых клеток. На гистограмме слева от вертикальной линии (у значения 10°) зарегистрированы живые клетки кожи, а справа мертвые. Также наблюдается гетерогенность популяции, т.к. клетки имеют разный объем, причем размеры клеток не превышают 20 мкм. Полученные данные показали, что в результате применения предлагаемого способа количество жизнеспособных клеток кожи в рассмотренном образце составило 90,0%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить жизнеспособную гетерогенную популяцию клеток кожи для дальнейших исследований по подбору и испытанию лекарственных препаратов при лечении кожных заболеваний in vitro, выделения и культивирования отдельных популяций клеток и разработки лекарственных препаратов нового поколения.
Claims (2)
1. Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре 23-25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 мин при температуре 23-25°C.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что извлечение гомогената проводят вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымывают рабочую камеру гомогенизатора 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012131976/15A RU2502999C1 (ru) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012131976/15A RU2502999C1 (ru) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2502999C1 true RU2502999C1 (ru) | 2013-12-27 |
Family
ID=49817791
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012131976/15A RU2502999C1 (ru) | 2012-07-25 | 2012-07-25 | Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2502999C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2630607C1 (ru) * | 2016-06-02 | 2017-09-11 | Сергей Викторович Гольцов | Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи |
RU2732238C2 (ru) * | 2015-12-07 | 2020-09-14 | Кинтароселлспауэр Ко., Лтд. | Способ культивирования стволовых клеток |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2427623C1 (ru) * | 2010-05-14 | 2011-08-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ разделения пулов 26s- и 20s-протеасом из цитоплазматической фракции клеток |
-
2012
- 2012-07-25 RU RU2012131976/15A patent/RU2502999C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2427623C1 (ru) * | 2010-05-14 | 2011-08-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Способ разделения пулов 26s- и 20s-протеасом из цитоплазматической фракции клеток |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Latest Toys for Cell Cultivators // Lab Times. - 4 - 2009. - pp.53-56. * |
TD Blalock et al. Ischemic Skin Wound Healing Models in Rats // Wounds. - V.13, No.1. - 2001. * |
TD Blalock et al. Ischemic Skin Wound Healing Models in Rats // Wounds. - V.13, №1. - 2001. * |
Бурунова В.В. Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - М., 2011. * |
Бурунова В.В. Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - М., 2011. Latest Toys for Cell Cultivators // Lab Times. - 4 - 2009. - pp.53-56. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2732238C2 (ru) * | 2015-12-07 | 2020-09-14 | Кинтароселлспауэр Ко., Лтд. | Способ культивирования стволовых клеток |
RU2630607C1 (ru) * | 2016-06-02 | 2017-09-11 | Сергей Викторович Гольцов | Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2019004908A (ja) | 脂肪由来幹細胞作製システムおよび方法 | |
CN107921182B (zh) | 用于分离基质血管部分的机械仪器和方法 | |
KR20150035571A (ko) | 말초 순환 종양 세포 또는 희소 세포 분리용 디바이스 및 말초 순환 종양 세포 또는 희소 세포 분리 방법 | |
US9458429B2 (en) | Mesenchymal stem cell attractant and method for attracting mesenchymal stem cell | |
US20160298076A1 (en) | Bone Marrow Adipose Portion Isolation Device and Methods | |
KR20160019475A (ko) | 체액으로부터의 산발성 세포를 분리하는 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치 | |
JP6471259B2 (ja) | 毛髪再生用の細胞製剤 | |
CN206787889U (zh) | 一种分离和富集体液成分的装置 | |
RU2502999C1 (ru) | Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи | |
Bowles et al. | Mesenchymal stem cell-based therapy in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) | |
KR101694422B1 (ko) | 지방줄기세포 여과용기 | |
CN104293731A (zh) | 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 | |
CN102796669B (zh) | 柔嫩艾美耳球虫裂殖子提取纯化的方法 | |
CN102492654A (zh) | 一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法 | |
CN114700186B (zh) | 一种刺参体液样品外泌体分离的方法 | |
Coultas et al. | In vitro cercariae transformation: comparison of mechanical and nonmechanical methods and observation of morphological changes of detached cercariae tails | |
CN102389442B (zh) | 一种具有抗血栓作用的地龙提取物 | |
KR20110079122A (ko) | 모든 바이오샘플을 분리하는데 적용할 있는 전 자동 원심분리기용 특정 튜브 | |
CN109988745A (zh) | 一种细胞核的提取方法 | |
RU2464563C1 (ru) | Способ выделения микровезикул эритроцитов | |
JP5021936B2 (ja) | 脂肪組織の酵素処理液から有核細胞を採取する方法 | |
EP3055691B1 (en) | Method for retrieval of stem cells from human and animal blood using an oxygen-ozone mixture | |
CN117660314A (zh) | 一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒和方法 | |
CN111500417B (zh) | 一种高通量细胞分选富集装置及其使用方法 | |
WO2024078647A2 (zh) | 一种神经组织单细胞悬液的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170726 |