CN102492654A - 一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法，所述试剂盒由A液、B液和C液组成，其中A液中添加适量葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯。本发明还涉及一种人脐带血干细胞治疗液，其包含利用本发明试剂盒制备的人脐带血干细胞。本发明的试剂盒能够从脐带血快捷高效的分离干细胞，有利于推广干细胞治疗技术。

Description

一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法。本发明还涉及一种人脐带血干细胞治疗液，其包含利用本发明试剂盒制备的人脐带血干细胞。 

背景技术

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。 

干细胞对早期人体的发育特别重要，在儿童和成年人中也可发现专能干细胞。举我们所最熟知的干细胞之一，造血干细胞为例，造血干细胞存在于每个儿童和成年人的骨髓之中，也存在于循环血液中，但数量非常少。在我们的整个生命过程中，造血干细胞在不断地向人体补充血细胞——红细胞、白细胞和血小板的过程中起着很关键的作用。如果没有造血干细胞，我们就无法存活。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其它类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。 

在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化特定的细胞或组织。 

然而，这个观点目前受到了挑战。最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其它细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。按 分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞，它是从早期胚胎内的细胞团分离出来的一种高度未分化的细胞系，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十一中血细胞，但不分化出造血系统以外的其他细胞。还有一类干细胞为单能干细胞(也称专能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。 

总之，凡需要不断产生新的分化细胞以及分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织，都要通过干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持肌体细胞的数量，可以这样说，生命是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。 

干细胞可以从常用的四种来源取得：胚胎(主要用于基础研究)，胎盘及其附属物，骨髓，成体组织(包含外周血)。目前用于临床干细胞来源主要有三种：自体外周血、自体骨髓、胎盘及其附属物。 

干细胞移植常用的有四种途径：介入途径、局部种植、静脉途径、腰穿途径。干细胞的移植所有程序都从在医院进行身体检查开始。然后，在国际GMP标准的实验室里制备出所需的干细胞，送入医院，临床医生将依据患者的临床评估，将干细胞通过注射、介入等方法植入人体，一旦细胞到达目的地，这些细胞具有修复组织细胞和恢复组织功能的能力。在治疗后几个星期内，患者还不会看到或感觉到任何改变，当然也有部分患者可能很快就见到效果。在一个月内，有时需要二个月的时间，患者应该可以感觉到症状减轻，活动能力增加。其结果正如患者所希望的，改善了生活质量。依据每个病人的病情移植治疗时间约需三至四周。 

目前干细胞技术治疗的主要疾病(1)视神经发育不全(2)脑梗塞、脑出血、脑外伤、脊髓损伤后的截瘫(3)肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、多发性硬化(4)老年痴呆症、脑发育不全、脑萎缩、共济失调(5)长期昏迷、植物生存状态(6)脑瘫、小儿缺血缺氧性脑病、智力低下(7)脊髓炎后遗症等神经系统疾病(8)糖尿病并发症(9)股骨头坏死等等。 

从干细胞发育为成熟的组织细胞，根据疾病的不同及疾病目前所处的阶段的不同，其所需要的时间也是不同的。其在体内迁移、分化的过程非常复杂，具体到每个个体，我们还无法完全预知其确切时间。这是一个从量变到质变的过程，一般在移植术后的2-3个月之后才逐渐显示出现及越来越大的疗效表现，那么这个过程要在出院后3个月及以上。 

因为干细胞是一种未分化未成熟的细胞，其细胞表面的抗原表达很微弱，患者自身的免疫系统对这种未分化细胞的识别能力很低，无法判断它们的属性，从而避免了器官移植引起的免疫排斥反应及过敏反应等，使同种异体移植神经干细胞变得非常安全。目前，干细胞研究完成了干细胞的临床前全套安全性实验，包括急性毒性试验，长期毒性试验，致瘤性试验，致畸性试验，局部刺激试验，发热试验和免疫毒性试验，结果表明，干细胞临床应用是安全，无毒的。在临床研究中，经过大量的临床病例研究表明，干细胞治疗除了极少数病人有轻微的发热、头痛外，无严重不良反应发生，表明其临床应用是安全的。 

干细胞移植治疗后没有后遗症，干细胞移植后会在患者体内长期存活，但其疗效则根据原发病的不同也不尽相同。对于原致病因素已经结出的患者来说，可能会长期有效，但对于致病因素持续存在的患者而言，则由于致病因素的持续破坏，其疗效难以长期维持，但可以延缓疾病发展的速度。 

干细胞治疗疾病的优势：应用干细胞技术能治疗神经系统、循环系统等多种系统的各种疾病，且较很多传统治疗方法具有无可比拟的优点。1)安全：低毒性或无毒性。2)在尚未完全了解疾病发病的确切机理前也可以应用。3)治疗材料来源充足。4)治疗范围广阔。5)是最好的免疫治疗和基因治疗载体。6)传统疗法认为是“不治之症”的疾病，又有了新的疗法和新的希望。 

我国科学家韩忠朝率领科技团队独辟蹊径找到干细胞非常理想的来源，于2006年首次从新生婴儿废弃的脐带组织中得到了一种多能干细胞，称为脐带间充质干细胞(UC-MSC)。UC-MSC不但具有胚胎干细胞类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、低病毒感染率、无伦理障碍，而且没有胚胎干细胞产生畸胎瘤问题，并且抗原性很低不产生免疫排斥反应，异体使用无需HLA配型。随着国内脐血干细胞库的建立和发展，脐血干细胞在临床中的应用范围将逐渐扩大。 

脐带血、骨髓、外周血来源的细胞比较如下：(1)骨髓中的干细胞比外周血的干细胞原始。(2)脐带血比骨髓更为原始。(3)脐带血的干细胞自我繁殖能力最强、繁殖速度最快，骨髓次之。(4)脐带血中干细胞的比率最大，骨髓次之。(5)外周血中的干细胞更接近终端细胞或叫祖细胞或前体细胞。 

公开号为CN1436843A的发明专利公开了一种脐血造血干细胞的制作方法，按如下步序进行：(1)采集脐血，将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；(2)加入红细胞沉淀剂；(3)离心分离1，将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；(4)移出红细胞，将红细胞输送到红细胞收集袋内；(5)离心分离2，将白细胞包括造血干细胞与血浆再一次分离；(6)移出血浆，将被分离的血浆输入到血浆收集袋内，脐血收集袋内剩余的脐血为含富集白细胞的脐血；(7)加入冷冻剂，将脐血收集袋中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂；(8)包装；(9)降温；(10)入库保存。但使用该方法制备的造血干细胞含有大量白细胞。 

公开号为CN101693884A的发明专利公开了一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，其工艺步骤为：首先将胎盘、脐带或脂肪组织与细胞保养液按2.5～4∶1的重量比混合放入组织粉碎桶中，以3000-6000转/分的转速粉碎2-4分钟，然后加入胶原酶充分混匀，放置到37℃±0.5℃的水浴箱中孵育20-30分钟，用200目过滤器过滤，按组织悬液量的25％-40％比例加入沉淀剂，混匀后静置10～30分钟，吸取上清液，用1100×g的离心力离心3～5分钟，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400^#的液体上，用离心力650×g离心10-30分钟，收取中间10-15ml的细胞层，用细胞保养液清洗3-4次，将收集的细胞计数，检测细胞存活率≥95％时，即可以供临床使用。该方法分离提取干细胞的生产成本较高。 

公开号为CN101629165A的发明专利公开了一种原始间充质干细胞的制备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法制备的：取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基溶液洗去脐带残留血液，去除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取华通胶并剪切成块，再以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基溶液冲洗后，浸泡于0.05～0.3％胶原酶溶液中，置35～37.5℃温箱中10～30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1～10倍量的含胎牛血清培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CO₂培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培 养基溶液，以后每隔2～4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2～4代，即时使用或冷冻保存备用。该发明制备干细胞需要时间长。 

公开号为CN1597935A的发明专利公开了一种活细胞胎盘素脐带干细胞的提取方法，其要点是：选择健康产妇的婴儿脐带，而且必须是男婴脐带，在靠近肚脐的一段其长度为6-8cm；将该脐带放在浓度为0.1-0.5％的抗凝剂柠檬酸钠液体内浸泡；并放在冷藏箱内冷藏保存，在冷藏箱内温度为5℃至-20℃条件下，可冷藏保存2-10天，然后将该脐带取出，植入体内可用来治疗哮喘、过敏性鼻炎、妇女更年期综合症、男性性功能减退，且能提高免疫系统、增强抵抗力，还可治疗肝炎、肝硬化、甲、乙、丙型肝炎、慢性肾炎、胃肠综合症、精神性胃溃疡、神经衰弱、美容、美声，还具有抗衰老、返老还童的功效。该发明提取干细胞必须来自男婴脐带，有局限性。 

公开号为CN1407088A的发明专利公开了一种从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法，其特征是所述的方法包括从胎盘组织里提取组织细胞的方法并有如下步骤：(1)怎样系统有序的电脑联网储存有关胎盘及脐带血的资料，(2怎样无菌的处理胎盘，避免一切可能的细菌和霉菌的污染，(3)怎样清除母亲血液对胎盘和脐带血细胞的混入，(4)怎样采用机械的方法分离胎盘组织细胞，(5)怎样采用酶消化的方法分离胎盘组织细胞，(6)怎样采用CD34单克隆抗体-磁珠法纯化胎盘组织干细胞，(7)怎样冰冻长期保存胎盘组织细胞。该发明方法提取的干细胞，自我繁殖能力较弱，繁殖速度较慢，提取出干细胞的比率不够大。 

人脐带血干细胞在临床上虽然有广泛的应用前景，但现有的分离方法存在种种不足，例如分离步骤复杂，耗时冗长，分离成本高，制备的脐带血干细胞纯度低，活性差等，限制了脐带血干细胞的应用。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题提供一种简单高效分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法。本发明人设计了许多实验方案，尝试了大量试剂组合，出人意料的发现在从脐带血分离干细胞的过程中，在分离液中加入葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯能有效提高干细胞的分离效率和纯度。 

本发明的方法工艺简单，条件温和，产品中的活性成分含量高，活性高，安全性好，产品生产成本低，使医生在临床上方便、安全、规范地获取人脐带血干细胞来治疗相关疾病，便利推广干细胞治疗技术。 

为实现本发明的目的，本发明提供一种分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成， 

A液：0.2-0.5mmol/L葛根素，0.3-1.0μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，5-20mmol/L PBS，pH7.4； 

B液：质量/体积百分比浓度为8-15％的羟乙基淀粉溶液或质量/体积百分比浓度为0.5-1.0％的甲基纤维素溶液； 

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度为1.076g/mL的Percoll。 

优选的，上述试剂盒的特征在于： 

A液：0.3-0.5mmol/L葛根素，0.5-0.8μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，10-15mmol/L PBS，pH7.4； 

B液：质量/体积百分比浓度为10-15％的羟乙基淀粉溶液或质量/体积百分比浓度为0.5-0.8％的甲基纤维素溶液； 

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度为1.076g/mL的Percoll。 

更优选的，上述试剂盒的特征在于： 

A液：0.3mmol/L葛根素，0.5μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，10mmol/L PBS，pH7.4 

B液：质量/体积百分比浓度为10％的羟乙基淀粉溶液 

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。 

另一方面，本发明提供上述分离人脐带血干细胞的试剂盒的使用方法，包括如下步骤： 

1)取含有10-50U/mL肝素的脐带血与A液按2∶1的体积比混匀； 

2)将步骤1)的溶液与B液按1∶1的体积混合，充分混匀，室温静置60-120分钟； 

3)用移液管移取上层细胞液至50mL离心管中； 

4)将离心管置于离心机中，1000-2000rpm离心15-30分钟，离心后弃去上清液，用生理盐水清洗离心管，并用20-30mL生理盐水重悬细胞沉淀； 

5)将20-30mL C液缓慢加入新的50mL离心管中，再将步骤4)得到的细胞液沿管壁缓慢加入C液上面，2000-3000rpm离心20-30分钟； 

6)离心后管内可见分为四层：最上层是血浆，第二层为白膜层，主要含脐带血干细胞，第三层为分离液层，第四层为粒细胞和红细胞，用吸管轻轻插入，穿过血浆层至白膜层，沿管壁周缘吸出白膜层细胞，转入另一50mL离心管中； 

7)向步骤6)获得的细胞液中加入5倍体积的生理盐水，混匀，1000-2000rpm离心15-30分钟，弃去上清液，将沉淀的细胞团用生理盐水清洗2次，得到人脐带血干细胞。 

此外，本发明还提供一种人脐带血干细胞治疗液，其包含利用上述方法制备的人脐带血干细胞。本发明的人脐带血干细胞治疗液可用于治疗多种疾病，包括但不限于，视神经发育不全，脑梗塞、脑出血、脑外伤、脊髓损伤后的截瘫，肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、多发性硬化，脑发育不全、脑萎缩、共济失调，脑瘫、小儿缺血缺氧性脑病，脊髓炎后遗症等神经系统疾病以及糖尿病并发症，股骨头坏死等等传统疗法一般认为的“不治之症”，有效率及治愈率高。 

本发明制备人脐带血干细胞的试剂盒和方法具有如下优点： 

1.工艺简单，条件温和，制备的人脐带血干细胞杂质少，活性高，安全性好，产品生产成本低。 

2.使得医生在临床上方便、安全、规范地获取人脐带血干细胞，解决临床上获取干细胞的瓶颈，推广干细胞治疗技术。 

实施例

实施例1 

分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成， 

A液：0.2mmol/L葛根素，0.3μmol/L4-羟基肉桂酸苯乙酯，5mmol/L PBS，pH7.4 

B液：质量/体积百分比浓度为8％的羟乙基淀粉溶液 

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。 

实施例2 

分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成， 

A液：0.5mmol/L葛根素，1.0μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，20mmol/L PBS，pH7.4 

B液：质量/体积百分比浓度为0.5％的甲基纤维素溶液 

C液：密度为1.076g/mL的Percoll。 

实施例3 

分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成， 

A液：0.3mmol/L葛根素，0.5μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，10mmol/L PBS，pH7.4 

B液：质量/体积百分比浓度为10％的羟乙基淀粉溶液 

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。 

实施例4 

分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成，A液：0.3mmol/L葛根素，0.5μmol/L4-羟基肉桂酸苯乙酯，10mmol/LPBS，pH7.4 

B液：质量/体积百分比浓度为0.5％的甲基纤维素溶液 

C液：密度为1.076g/mL的Percoll。 

实施例5 

人脐带血的采集，包括如下步骤： 

1)打开采血袋包装，关闭采血袋与穿刺针之间的管路上近针头处的卡子，血袋置于一旁备用。 

2)胎儿娩出后两把止血钳分别在距脐蒂侧约5cm和8cm处夹闭脐带，在两把止 血钳之间断脐带，胎儿脱离母体。 

3)在脐带母体侧断端确定脐静脉穿刺采血部位，将采血袋穿刺针头上的针帽沿顺时针方向拧开后，沿脐静脉断端针头斜面向下穿刺入脐静脉，可用一把止血钳将针头固定在脐带上。 

4)打开采血袋与针头间输液管上的卡子，脐带血将注入采血袋，同时持续轻摇采血袋使抗凝剂与脐带血充分混合，保持采血袋处于低位。为增加采血量可自胎盘侧向断端挤压脐带。采血量一般应高于60ml，100ml以上为佳。 

5)采血至脐带血不能流出时，在拔针前用近针头处和近采血袋处的两只卡子将采血袋与穿刺针之间的管路再次关闭，拔针。 

6)在近针头处卡子与针头之间剪断管路去掉针头，并用热合机封口。 

7)将采集的脐带血置于4-10℃冰箱中暂存，无冰箱室内暂存不能高于24℃。 

实施例6 

利用实施例3的试剂盒的分离人脐带血干细胞的方法，包括如下步骤： 

1)取含有50U/mL肝素的脐带血与A液按2∶1的体积比混匀； 

2)将步骤1)的溶液与B液按1∶1的体积混合，充分混匀，室温静置90分钟； 

3)用移液管移取上层细胞液至50mL离心管中； 

4)将离心管置于离心机中，2000rpm离心30分钟，离心后弃去上清液，用生理盐水清洗离心管，并用30mL生理盐水重悬细胞沉淀； 

5)将20mL C液缓慢加入新的50mL离心管中，再将步骤4)得到的细胞液沿管壁缓慢加入C液上面，2000rpm离心30分钟； 

6)离心后管内可见分为四层：最上层是血浆，第二层为白膜层，主要含脐带血干细胞，第三层为分离液层，第四层为粒细胞和红细胞，用吸管轻轻插入，穿过血浆层至白膜层，沿管壁周缘吸出白膜层细胞，转入另一50mL离心管中； 

7)向步骤6)获得的细胞液中加入5倍体积的生理盐水，混匀，2000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀的细胞团用生理盐水清洗2次，得到人脐带血干细胞。 

实施例7 

将15份脐带血分成3组，每组5份标本。I组为本发明的分离脐带血干细胞 的试剂盒组(采用本发明试剂盒的A液、B液和C液)，按照实施例6的方法进行。II组为对照组(采用的试剂基本与本发明试剂盒的A液、B液和C液相同，但是A液中不含葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯)，操作方法同A组。III组为市售干细胞分离试剂盒组，采用购自北京盛宏业医药科技发展有限公司的“骨髓、脐带血细胞处理试剂盒”，按照试剂盒所附说明书提供的方法进行分离。 

表1.不同方法分离脐带血干细胞的比较 

脐带血分离后主要根据有核细胞回收率(为脐带血分离后的有核细胞数与分离前的有核细胞数的百分比，其中有核细胞富含脐带血干细胞)和台酚蓝拒染率比较分离效果。表1结果显示，在A液中添加葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯后，干细胞的回收效率明显提高，其也明显优于采用市售干细胞分离试剂盒的分离效果。而I组的台酚蓝拒染率高于II组，与III组相当，说明在A液中添加葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯后，提高了分离后干细胞的活力，与市售干细胞分离试剂盒分离得到的干细胞活力相当。 

实施例8 

流式细胞仪测定分离后的干细胞纯度 

此外，还用流式细胞仪检测了实施例7中3组脐带血样品分离后的干细胞纯度。使用Beckman2Coulter EPICS Elite分选型流式细胞仪，根据仪器手册设置好各项参数，安装分选器。将上述分离的脐带血干细胞采用常规方法利用抗CD34抗体进行标记，然后经过流式细胞仪分选。收集完后测定CD34⁺细胞的含量，计算细胞纯度。 

表2.流式细胞仪测定的干细胞纯度 

利用CD34作为干细胞的标记物，通过流式细胞仪测定，在A液中添加葛根素和4-羟基肉桂酸苯乙酯后，显著提高分离产物中干细胞的纯度，其纯化效果也要优于市售干细胞分离试剂盒(如表2所示)。 

综上所述，本发明的内容并不局限在上述实施例中，本领域技术人员可以在本发明的技术指导思想之内轻易提出其他的实施例，这些实施例都包括在本发明的范围之内。 

Claims (5)

1.一种分离人脐带血干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液、B液和C液组成，

A液：0.2-0.5mmol/L葛根素，0.3-1.0μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，5-20mmol/LPBS，pH7.4；

B液：质量/体积百分比浓度为8-15％的羟乙基淀粉溶液或质量/体积百分比浓度为0.5-1.0％的甲基纤维素溶液；

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度为1.076g/mL的Percoll。

2.根据权利要求1所述的分离人脐带血干细胞的试剂盒，其特征在于：

A液：0.3-0.5mmol/L葛根素，0.5-0.8μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，10-15mmol/LPBS，pH7.4；

B液：质量/体积百分比浓度为10-15％的羟乙基淀粉溶液或质量/体积百分比浓度为0.5-0.8％的甲基纤维素溶液；

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液或密度为1.076g/mL的Percoll。

3.根据权利要求1所述的分离人脐带血干细胞的试剂盒，其特征在于：

A液：0.3mmol/L葛根素，0.5μmol/L 4-羟基肉桂酸苯乙酯，10mmol/L PBS，pH7.4

B液：质量/体积百分比浓度为10％的羟乙基淀粉溶液

C液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。

4.权利要求1-3中任一项所述的分离人脐带血干细胞的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)取含有10-50U/mL肝素的脐带血与A液按2∶1的体积比混匀；

2)将步骤1)的溶液与B液按1∶1的体积混合，充分混匀，室温静置60-120分钟；

3)用移液管移取上层细胞液至50mL离心管中；

4)将离心管置于离心机中，1000-2000rpm离心15-30分钟，离心后弃去上清液，用生理盐水清洗离心管，并用20-30mL生理盐水重悬细胞沉淀；

5)将20-30mL C液缓慢加入新的50mL离心管中，再将步骤4)得到的细胞液沿管壁缓慢加入C液上面，2000-3000rpm离心20-30分钟；

6)离心后管内可见分为四层：最上层是血浆，第二层为白膜层，主要含脐带血干细胞，第三层为分离液层，第四层为粒细胞和红细胞，用吸管轻轻插入，穿过血浆层至白膜层，沿管壁周缘吸出白膜层细胞，转入另一50mL离心管中；

7)向步骤6)获得的细胞液中加入5倍体积的生理盐水，混匀，1000-2000rpm离心15-30分钟，弃去上清液，将沉淀的细胞团用生理盐水清洗2次，得到人脐带血干细胞。

5.一种人脐带血干细胞治疗液，其包含利用权利要求4的方法制备的人脐带血干细胞。