CN109337871A - 一种胎盘造血干细胞制备方法 - Google Patents

一种胎盘造血干细胞制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109337871A
CN109337871A CN201811308030.3A CN201811308030A CN109337871A CN 109337871 A CN109337871 A CN 109337871A CN 201811308030 A CN201811308030 A CN 201811308030A CN 109337871 A CN109337871 A CN 109337871A
Authority
CN
China
Prior art keywords
placenta
stem cell
bomaili
lavation
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811308030.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109337871B (zh
Inventor
杨致亭
韩伟
邱青芳
姚立琼
潘德芹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WEIFANG KANGHUA BIOTECH CO Ltd
Original Assignee
WEIFANG KANGHUA BIOTECH CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WEIFANG KANGHUA BIOTECH CO Ltd filed Critical WEIFANG KANGHUA BIOTECH CO Ltd
Priority to CN201811308030.3A priority Critical patent/CN109337871B/zh
Publication of CN109337871A publication Critical patent/CN109337871A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109337871B publication Critical patent/CN109337871B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：(1)胎盘预处理；(2)胎盘一次灌洗；(3)胎盘二次灌洗；(4)胎盘三次灌洗；(5)混合离心；(6)胎盘初步纯化；(7)造血干细胞的冻存；该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。

Description

一种胎盘造血干细胞制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘造血干细胞制备方法。
背景技术
造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSCs)是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力，即可以通过一个细胞周期后产生两个与分裂前具有相同性质的细胞，以及具有在一定外界条件下分化成各类成熟血细胞的潜能。
造血干细胞最先发生染色体易位等主要的致病突变，这种突变并不影响其分化能力，即可分化为具有正常功能的成熟血细胞，当已发生染色体易位的造血干细胞或者由发生了染色体易位的造血干细胞分化的成熟血细胞发生第二次突变，就会引发白血病，如急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)和慢性髓细胞白血病(chronicmyelocytic leukemia，CML)的发生都与造血干细胞异常存在直接或间接的关系。造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也具有一定作用，如前列腺肿瘤细胞会模拟造血干细胞的分子信号，进入造血微环境，并引起造血干细胞表达谱的改变迫使造血干细胞离开，也可以通过表达造血细胞迁移相关的分子离开造血微环境，最终导致肿瘤的转移。
随着对造血干细胞研究的深入，在临床治疗中，造血干细胞移植广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病等血液系统疾病，某些实体瘤以及自身免疫疾病等。通常，造血干细胞根据来源不同可分为三种，即骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞以及脐血造血干细胞。随着造血干细胞领域的研究进展，发现成熟的胎盘中存在大量的造血干细胞，相比于传统三种来源的造血干细胞，胎盘来源的造血干细胞不但免疫原性低、在数量上具备绝对优势，而且是相对更为原始的祖细胞，除此之外，胎盘为产妇生产后的废弃物，具有来源丰富，且采集过程不会对母体或新生儿造成损伤的优点。
目前，现有的从胎盘提取造血干细胞的流程为：(1)将胎盘或胎盘小叶用机械法分解剪碎；(2)采用一种酶或多种酶联合分步骤消化；(3)取消化液用羟乙基淀粉法或淋巴细胞分离法分离出消化液中含有造血干细胞的单个核细胞；(4)分离出的单个核细胞用免疫磁珠法或流式细胞仪等方法富集。但是以上所述现有技术存在以下缺点：(1)分离过程长、操作步骤繁琐，容易丢失细胞的同时，极易造成细胞污染；(2)胎盘体积较大，消化过程需大量酶，且不易控制消化过程进度，容易造成过度消化，因细胞损伤而失活，并且酶的大量使用必然增加实验成本。
另外，目前所用的造血干细胞冻存方法中所使用的冻存液添加了胎牛血清或供体自身的血清，血清含有大量未知成份，且质量不易控制，存在一定安全隐患，对后期临床应用造成一定困扰。
发明内容
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种胎盘造血干细胞制备方法，该制备方法可提高CD34阳性细胞的分离数量、细胞活力，而且所采用的试剂均无潜在风险，可应用于临床，并降低了实验成本。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种胎盘造血干细胞制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过多次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。
作为一种改进的技术方案，步骤(1)中的胎盘清洗液为pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中每L磷酸盐缓冲液中含有100-500mg/L青霉素100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、100-500mg/L庆大霉素、50-200mg/L两性霉素B。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中的胎盘灌洗液A为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的胎盘灌洗液B为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液、0.01-0.5wt％中性蛋白酶、0.01-0.5wt％Ⅰ型胶原酶。
作为一种改进的技术方案，深低温冻存时步骤(7)中的冻存液含有体积分数为10％的DMSO和体积分数为90％、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液。
作为一种改进的技术方案，非深低温冻存时步骤(7)中的冻存液中含有体积分数84％、质量浓度为30-50mg mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液、体积分数为10％的DMSO和体积分数为6％、质量浓度为15-30g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)造血干细胞在胎盘中含量丰富，主要分布在胎盘小叶和胎盘血中，本发明胎盘灌洗液B中含有中性蛋白酶和Ⅰ型胶原酶，这两种酶作用温和，不造成细胞损伤，这两种酶共同作可分离组织获得单个细胞，并且灌注过程中通过按压胎盘的操作，有助于灌洗液充分浸润胎盘小叶的毛细血管，有助于目的细胞从组织中游离出来，大大提高了目的细胞的分离率；
(2)本发明实验操作简单，时间较短，不涉及胎盘组织剪碎及组织酶解消化，大大降低了实验操作过程中掺杂其他细胞，以及避免了实验过程复杂造成细胞污染的可能性；
(3)本发明中的冻存液以勃脉力A溶剂替代了常用的不能用于临床的PBS，人血清白蛋白代替了不能用于临床的胎牛血清或不易获取的人血清血浆.采用上述冻存液将细胞进行冻存，有效提高了细胞复苏之后的复苏率。
综上所述，采用本发明的制备方法大大提高了造血干细胞的分离率和细胞冻存复苏后的存活率，造血干细胞活性高，污染率低。
附图说明
图1为倒置显微镜下观察胎盘血来源的单个核细胞(40×)；
图2为倒置显微镜下观察台盼蓝染色的胎盘血来源的单个核细胞(40×)；
图3为倒置显微镜下造血干细胞集落形态(100×)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液(每1L，pH7.2的磷酸盐缓冲液中含有100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、100mg/L庆大霉素、50mg/L两性霉素B)清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、1支肝素钠注射液)沿胎盘脐动脉注入至脐静脉，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将胎盘灌洗液B(每L勃脉力A中含有100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、0.05wt％中性蛋白酶、0.05wt％Ⅰ型胶原酶、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入至脐静脉，按压胎盘使灌洗液能浸润胎盘内部血管，静置30min，收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入由脐静脉输出，反复冲洗2次，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，用勃脉力A重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液(体积分数为84％，质量浓度为30mg/ml人血清白蛋白的勃脉力A溶液、和体积分数6％，浓度为15g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液)将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，缓慢滴加冻存液的剩余组分(体积分数为10％的DMSO)混匀后封口，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存60d。
实施例2
一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液(每L磷酸盐缓冲液中含有200mg/L青霉素、200mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、200mg/L庆大霉素、80mg/L两性霉素B)清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有200mg/L青霉素、200mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、2支肝素钠注射液)沿胎盘脐动脉注入至脐静脉，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将胎盘灌洗液B(每L勃脉力A中含有200mg/L青霉素、200mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、0.15wt％中性蛋白酶、0.15wt％Ⅰ型胶原酶、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入至脐静脉，按压胎盘使灌洗液能浸润胎盘内部血管，静置30min，收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有200mg/L青霉素、200mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入由脐静脉输出，反复冲洗3次，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，用勃脉力A重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液(体积分数为84％、质量浓度为40mg人血清白蛋白的勃脉力A溶液)将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，缓慢滴加冻存液的剩余组分(体积分数为10％的DMSO)混匀后封口，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中在196℃条件下冻存60d。
实施例3
一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液(每L磷酸盐缓冲液中含有300mg/L青霉素、300mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、200mg/L庆大霉素、100mg/L两性霉素B)清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有300mg/L青霉素、300mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、2支肝素钠注射液)沿胎盘脐动脉注入至脐静脉，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将胎盘灌洗液B(每L勃脉力A中含有300mg/L青霉素、300mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、0.1wt％中性蛋白酶、0.1wt％Ⅰ型胶原酶、2支肝素钠注射液)沿脐动脉注入至脐静脉，按压胎盘使灌洗液能浸润胎盘内部血管，静置30min，收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有300mg/L青霉素、300mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入由脐静脉输出，反复冲洗4次，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，用勃脉力A重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液(含有体积分数为90％、质量浓度为45mg的人血清白蛋白的勃脉力A溶液和)将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，缓慢滴加冻存液的剩余组分(体积分数为10％的DMSO)混匀后封口，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存60d。
实施例4
一种胎盘造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液(每L磷酸盐缓冲液中含有400mg/L青霉素、400mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、400mg/L庆大霉素、150mg/L两性霉素B)清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有400mg/L青霉素、400mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、2支肝素钠注射液、0.2wt％中性蛋白酶、0.2wt％Ⅰ型胶原酶)沿胎盘脐动脉注入至脐静脉，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将胎盘灌洗液B(每L勃脉力A中含有400mg/L青霉素、400mg/L链霉素、2mg/mL维生素C、2支肝素钠注射液)沿脐动脉注入至脐静脉，按压胎盘使灌洗液能浸润胎盘内部血管，收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A(每L勃脉力A中含有200mg/L青霉素、200mg/L链霉素、1mg/mL维生素C、1支肝素钠注射液)沿脐动脉注入由脐静脉输出，反复冲洗5次，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，用勃脉力A重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液(含有体积分数为90％、质量浓度为50mg人血清白蛋白的勃脉力A溶液、体积分数为6％、质量浓度为20g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液)将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，缓慢滴加冻存液的剩余组分(体积分数为10％的DMSO)混匀后封口，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存60d。
为了更好的证明采用本发明的制备方法可以提高造血干细胞的提取率，以本发明实施例3为基础，做了3个对比例。
对比例1
与实施例3不同的是，步骤(2)中的胎盘灌洗液B中不含有中性蛋白酶和I型胶原酶。
对比例2
与实施例3不同的是，步骤(2)中的胎盘灌洗液B中不含有中性蛋白酶。
对比例3
与实施例3不同的是，步骤(2)中的胎盘灌洗液B中不含有I型胶原酶。
将实施例3和对比例1-3方法下制备的造血干细胞检测，
(1)对获得的所有细胞进行细胞计数：取20μL的细胞悬液到细胞计数板，细胞计数仪计数细胞个数并做记录；
(2)细胞活性检测：取20μL的细胞悬液，按照体积比1:1的比例加入浓度为0.04％的台盼蓝染液，混匀，然后取5μL到载玻片上，显微镜下观察染色细胞，检测细胞活性并拍照记录，细胞计数仪检测活细胞数；
(3)流式细胞仪定量检测：CD34阳性(CD34+)细胞，通过检测，CD34+细胞占活的单个核细胞总数的比率达到2.71％，冻存复苏细胞后做相同检测，CD34+细胞占活的单个核细胞总数的比率达到2.60％。该项实验数据充分说明本发明得到的造血干细胞的数量可观，临床的应用价值很高，见表1和表2；
表1
表2
本发明在显微镜下观察胎盘血来源的单个核细胞(40×)，具体可详见图1，其中A为显微镜下观察初次提取的胎盘血来源的单个核细胞；B为显微镜下观察冻存60d复苏后的胎盘血来源的单个核细胞。经细胞计数，经过冻存复苏的单个核细胞数量与初次提取时的数量无显著差别(P＞0.05)。
本发明在显微镜下观察台盼蓝染色的胎盘血来源的单个核细胞(40×)，具体可详见图2，其中A为显微镜下观察台盼蓝染色的初次提取的胎盘血来源的单个核细胞；B为显微镜下观察台盼蓝染色的冻存60d复苏后的胎盘血来源的单个核细胞。经活细胞计数，经过冻存复苏的单个核细胞数量与初次提取时的数量无显著差别(P＞0.05)。
本发明对造血干细胞进行集落形成培养实验：用甲基纤维素半固体培养基培养(CFU-GM)，取六孔板，设立三个平行对照，在孔中加入3mL甲基纤维素半固体培养基，加10μL的细胞悬液，另取三个孔加3mL蒸馏水，置于细胞培养箱中培养并观察是否有完整的细胞集落。细胞集落形态见图3，图A为培养5d时造血干细胞集落形态；图B为培养10d时造血干细胞集落形态；图C为培养15d时造血干细胞集落形态。10d与5d相比，肉眼可见细胞数量增多，15d可见细胞克隆体积显著增大。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：
(1)胎盘预处理：在无菌条件下，将新鲜采集的足月完整健康胎盘用胎盘清洗液清洗，备用；
(2)胎盘一次灌洗：取步骤(1)中的胎盘，将胎盘灌洗液A沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；
(3)胎盘二次灌洗：取步骤(2)中的胎盘，将灌洗液B沿胎盘脐动脉注入胎盘内部，注入过程中按压胎盘使灌洗液浸润胎盘内部血管，静置15-30min，由脐静脉收集灌洗后的液体组分；
(4)胎盘三次灌洗：取步骤(3)中的胎盘，另取新的胎盘灌洗液A沿脐动脉注入由脐静脉输出，经过2-5次反复冲洗，收集灌洗后的液体组分；
(5)混合离心：合并步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所收集的液体组分，离心，去除上清，向收集的细胞沉淀中加入勃脉力A，得到细胞悬液；
(6)初步纯化：取步骤(5)中的细胞悬液，将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心，收集的白膜层即为包含了造血干细胞的单个核细胞；
(7)造血干细胞的冻存：取步骤(6)中的单个核细胞，加入勃脉力A离心洗两遍，用4℃预冷的冻存液将得到的单个核细胞按1×106个/mL细胞量重悬，得到的细胞重悬液分装后置于冰上，置于程序降温冻存盒中于-80℃冻存，24h内转移至液氮罐中冻存。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(1)中的胎盘清洗液为pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，其中每L磷酸盐缓冲液中含有100-500mg/L青霉素100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、100-500mg/L庆大霉素、50-200mg/L两性霉素B。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(2)中的胎盘灌洗液A为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液。
4.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(3)中的胎盘灌洗液B为勃脉力A，且每L勃脉力A中含有100-500mg/L青霉素、100-500mg/L链霉素、1-4mg/mL维生素C、1-2支肝素钠注射液、0.01-0.5wt％中性蛋白酶、0.01-0.5wt％Ⅰ型胶原酶。
5.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(7)中的冻存液含有体积分数为10％的DMSO和体积分数为90％、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液。
6.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞制备方法，其特征在于：步骤(7)中的冻存液中含有体积分数84％、质量浓度为30-50mg/mL人血清白蛋白的勃脉力A溶液、体积分数为10％的DMSO和体积分数为6％、质量浓度为15-30g/L羟乙基淀粉的勃脉力A溶液。
CN201811308030.3A 2018-11-05 2018-11-05 一种胎盘造血干细胞制备方法 Active CN109337871B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811308030.3A CN109337871B (zh) 2018-11-05 2018-11-05 一种胎盘造血干细胞制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811308030.3A CN109337871B (zh) 2018-11-05 2018-11-05 一种胎盘造血干细胞制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109337871A true CN109337871A (zh) 2019-02-15
CN109337871B CN109337871B (zh) 2021-10-22

Family

ID=65313701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811308030.3A Active CN109337871B (zh) 2018-11-05 2018-11-05 一种胎盘造血干细胞制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109337871B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109845726A (zh) * 2019-02-27 2019-06-07 李冲杰 一种间充质干细胞超低温冻存保护剂
CN112471137A (zh) * 2020-12-10 2021-03-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其冻存造血干细胞的方法和干细胞制剂
CN114271263A (zh) * 2021-12-30 2022-04-05 杭州芯递力生物科技有限公司 一种细胞保存液、冻存套装及细胞冻存方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102008507A (zh) * 2010-11-21 2011-04-13 天津和泽干细胞科技有限公司 人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
CN104711226A (zh) * 2015-04-09 2015-06-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胎盘造血干细胞的制备方法
CN105969721A (zh) * 2016-07-19 2016-09-28 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种胎盘造血干细胞提取制备方法
CN106754668A (zh) * 2016-11-16 2017-05-31 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种干细胞培养液及注射液
CN106924285A (zh) * 2017-03-17 2017-07-07 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
CN106967675A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 东莞市保莱生物科技有限公司 一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
CN107058224A (zh) * 2017-02-10 2017-08-18 广东唯泰生物科技有限公司 一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102008507A (zh) * 2010-11-21 2011-04-13 天津和泽干细胞科技有限公司 人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法
CN104711226A (zh) * 2015-04-09 2015-06-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胎盘造血干细胞的制备方法
CN105969721A (zh) * 2016-07-19 2016-09-28 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种胎盘造血干细胞提取制备方法
CN106754668A (zh) * 2016-11-16 2017-05-31 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种干细胞培养液及注射液
CN107058224A (zh) * 2017-02-10 2017-08-18 广东唯泰生物科技有限公司 一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法
CN106924285A (zh) * 2017-03-17 2017-07-07 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
CN106967675A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 东莞市保莱生物科技有限公司 一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张丽娟等: "直接用于输注的临床级细胞冻存保护剂的动物体内外安全性评价", 《昆明医科大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109845726A (zh) * 2019-02-27 2019-06-07 李冲杰 一种间充质干细胞超低温冻存保护剂
CN112471137A (zh) * 2020-12-10 2021-03-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞冻存液及其冻存造血干细胞的方法和干细胞制剂
CN114271263A (zh) * 2021-12-30 2022-04-05 杭州芯递力生物科技有限公司 一种细胞保存液、冻存套装及细胞冻存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109337871B (zh) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861430B (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
Cairo et al. Characterization of banked umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells and lymphocyte subsets and correlation with ethnicity, birth weight, sex, and type of delivery: a Cord Blood Transplantation (COBLT) Study report
King et al. Sphingosine-1-phosphate prevents egress of hematopoietic stem cells from liver to reduce fibrosis
Khan et al. Safety and efficacy of autologous bone marrow stem cell transplantation through hepatic artery for the treatment of chronic liver failure: a preliminary study
CN106434557B (zh) 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法
CN109337871A (zh) 一种胎盘造血干细胞制备方法
US20060188984A1 (en) Method of providing readily available cellular material derived from cord blood, and a composition thereof
US20070087324A1 (en) Method of providing readily available cellular material derived from peripheral blood
CN103469309B (zh) 一种组织匀浆法分离活细胞构建细胞库的方法
CN105420191A (zh) 一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法
US9241959B2 (en) Kits and methods for processing stem cells from bone marrow or umbilical cord blood
CN101629165A (zh) 脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品
CN109481466A (zh) 使用胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的方法和细胞制剂
CN110438072A (zh) 脂肪间充质干细胞的制备方法
CN104711226A (zh) 一种胎盘造血干细胞的制备方法
CN101889079A (zh) 适于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法
CN109652366A (zh) 用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂
CN105368780A (zh) 分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法
Lanzoni et al. Isolation of stem cell populations with trophic and immunoregulatory functions from human intestinal tissues: potential for cell therapy in inflammatory bowel disease
CN104694466A (zh) 间充质干细胞来源的胞外体制备及在急性肺损伤中的应用
CN103320382A (zh) 从胎盘和脐带中同时提取和纯化多种来源干细胞的方法
CN102492654A (zh) 一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法
CN105368781A (zh) 一种分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法
CN101188941A (zh) 用于治疗糖尿病的方法和组合物
CN102660499B (zh) 一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 261023 No. 699, Yue He road, Weifang Economic Development Zone, Shandong

Applicant after: Shandong Kanghua Biomedical Technology Co., Ltd

Address before: 261023 No. 699, Yue He road, Weifang Economic Development Zone, Shandong

Applicant before: WEIFANG KANGHUA BIOTECH Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant