CN109845726A - 一种间充质干细胞超低温冻存保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，包括以下组份：8份‑10份DMSO，5份‑6份质量分数为12%‑15%的HES水溶液。本发明的有益效果是：使用本发明冻存的干细胞，在冻存一定的周期后复苏，存活率显著提高；使用本发明冻存的干细胞，在冻存一定的周期后复苏，干细胞冻存一定周期后复苏，细胞状态优良。
Description
技术领域
本发明涉及冻存保护剂领域，尤其涉及一种间充质干细胞超低温冻存保护剂。
背景技术
脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UCMSCs)是指来源于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，UCMSC可以向多个方向进行分化，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等方面具有广阔的临床应用前景。
将细胞、组织等冷冻在-80℃以下的环境，使细胞的生化过程和酶代谢几近完全停滞，以保证细胞的存活能力和时间，这个过程称之为细胞的冷冻保存。UCMSC在实验和生产过程中，常常需要长期冷冻保存，冷冻保存对细胞最大的威胁在于低温状态下水结晶对细胞膜和细胞器的损伤，因此细胞要长期保存，需要避免细胞内外水的结晶，这就需要在细胞冻存时添加相应的保护剂。
目前，常用的干细胞冻存方法主要有两种，即程序性慢冻法和玻璃化法，慢冻法操作较为简便，但是细胞复苏率相对较低，且分化率分化率较高，而玻璃化法虽然复苏率较高，也存在操作过程繁琐、不适用大量保存、细胞易污染等问题。
干细胞冻存常用的保护剂主要有二甲基亚砜（DMSO）、白蛋白（ALB）、乙二醇、蔗糖等。目前，各大学院校、科研院所、医院平台等实验室在实验过程中，所使用保护剂种类不一，比例也是不尽相同，经不同时间冻存后，细胞复苏时成活率多在50%-80%之间，分化率多在5%-15%之间，综合两者比例，可见目前各实验室常用的干细胞冻存液不尽理想。
发明内容
为了解决上述背景技术中提出的问题，本发明提供了一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液。
优选的，按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量分数为20%的ALB溶液。
优选的，按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量体积分数为15%-18%的海藻糖水溶液。
优选的，按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份乙二醇。
优选的，按体积份数计，还包括以下组份：80份-90份细胞培养基。
本发明的有益效果是：
1、使用本发明冻存的干细胞，在冻存一定的周期后复苏，存活率显著提高。
2、使用本发明冻存的干细胞，在冻存一定的周期后复苏，干细胞冻存一定周期后复苏，细胞状态优良。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
英文缩写解释说明：
DMSO：二甲基亚砜；
ALB：白蛋白；
HES：羟乙基淀粉。
实施例
1、主要仪器、试剂、耗材
仪器：Thermo CO2培养箱，Thermo离心机，SD-WJ-2HD超净工作台，Accuri C6plus流式细胞仪，JSY-SC-021H细胞计数仪，东亚液氮罐。
试剂：GENVIEW PBS，Gibco 胰酶，Gibco 青霉素/链霉素，Helios血清，Gibco MEM培养基，肝素钠，DMSO，质量分数为12%的HES水溶液，质量分数为20%的ALB溶液，质量体积分数为16%的海藻糖水溶液，乙二醇。
耗材：T175细胞培养瓶，10ml-50ml移液管，50ml离心管，冻存管。
2、方法步骤
（1）将实验室UCMSC传代培养至P4代，消化收集以备冻存，分别取10ul和100ul做细胞计数和流式检测。
（2）配制以下冻存液：
A组:10ml的DMSO,90ml的Gibco MEM培养基；
B组:10ml的DMSO,10ml质量分数为20%的ALB溶液,80ml的Gibco MEM培养基；
C组:10ml的DMSO,6ml质量分数为12%的HES水溶液,84ml的Gibco MEM培养基；
D组:10ml的DMSO,5ml质量分数为12%的HES水溶液,5ml质量分数为20%的ALB溶液,80ml的Gibco MEM培养基；
E组:10ml的DMSO,5ml质量分数为12%的HES水溶液,5ml质量体积分数为16%的海藻糖水溶液,80ml的Gibco MEM培养基；
F组:10ml的DMSO,5ml质量分数为12%的HES水溶液,5ml乙二醇,80ml的Gibco MEM培养基；
将以上各组冻存液各自混匀后，置于4℃保存待用。
（3）将（1）收集的细胞以5×10^6数量为单位，分别和（2）中所述各组冻存液混匀1ml于冻存管内。每组均设置3个平行。
（4）将各冻存管置于-20℃冰箱4h，后装入泡沫盒移置于-80℃冰箱保存隔夜，后移置于-196℃液氮罐中保存。
（5）分别于冻存1、3、6、12、24个月时，复苏细胞进行计数和流式检测。
3、结果
在冻存1个月、3个月时，各组细胞复苏后活率和分化率（以CD45-、CD34-、CD90+、CD105+比例表示）相差不大，差异不明显（P＞0.05）；冻存6个月时，细胞复苏后，B、C、D、E组细胞较A、F组活率较高，差异明显（P＜0.05），分化率差异不明显（P＞0.05），B、C、D、E组比较活率和分化率差异不明显（P＞0.05）；冻存12个月时，D、E组细胞复苏后活率较其他组高，分化率较其他组低，均差异明显（P＜0.05），D、E组之间比较细胞活率和分化率略有差异，但不显著（P＞0.05）；冻存24个月时，D、E组细胞复苏后，细胞活率E组较D组低，但差异不明显（P＞0.05），分化率D组较E组低，差异明显（P＜0.05）。具体如下表：
从上述结果可以看出，短时间（6个月以内）的干细胞冻存，考虑到成本问题，以DMSO为冻存保护剂可以基本满足需要。但是从长时间（12个月以上）冻存结果看，单以DMSO为保护剂已经不能满足细胞复苏后成活率和分化率需求。单对DMSO辅以一种保护剂成分时，虽然复苏成活率有所改善，但仍相对较低，且细胞状态会发生较大改变，有较高的分化倾向。
D组的冻存剂是一种较为理想的干细胞冻存保护剂，细胞经-196℃冻存24个月后复苏回收率能达到93.7%，且干细胞表面标志物综合比例达到约94.1%，证明细胞状态改变较小，分化率较低。
E组的冻存剂是一种较为理想的干细胞冻存保护剂，细胞经-196℃冻存24个月后复苏回收率能达到91.9%，且干细胞表面标志物综合比例达到约93.5%，证明细胞状态改变较小，分化率较低。
综上所述，为提高间充质干细胞复苏回收率，降低分化和细胞状态改变倾向，推荐以按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量分数为20%的ALB溶液的冻存保护剂或者按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量体积分数为15-18%的海藻糖水溶液的冻存保护剂作为间充质干细胞冻存保护剂。
对所公开的实施例的上述说明，仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量分数为20%的ALB溶液。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份质量体积分数为15%-18%的海藻糖水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，包括以下组份：8份-10份DMSO，5份-6份质量分数为12%-15%的HES水溶液，5份-6份乙二醇。
5.根据权利要求1-4所述的一种间充质干细胞超低温冻存保护剂，其特征在于：按体积份数计，还包括以下组份：80份-90份细胞培养基。
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