CN110250165A - 一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法，该冻存液包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1‑酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。本发明的脐带间充质干细胞冻存液不含动物源血清，无临床应用风险，采用本发明冻存液以及冻存方法冻存后进行复苏，脐带间充质干细胞的存活率高，具有良好的分化潜能，复苏效果好。

Description

一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它具有较高的分化潜能，能分化成骨、软骨、肌肉、心肌等多种组织细胞，还具有取材方便、无伦理学争议等优点，在组织工程方面具有广阔的临床应用前景。由于过度传代会使脐带间充质干细胞明显衰老或凋亡，失去多分化潜能，因此脐带间充质干细胞的冻存成为其临床研究、使用的重要工序。
由于在冻存过程中容易形成冰晶，导致细胞的机械性损伤和渗透性损伤，影响了干细胞的存活率和生物学特性，因此干细胞的超低温冻存需要加入合适的冻存液。现有的脐带间充质干细胞冻存液组分主要包括动物源血清和二甲基亚砜，由于血清成分不能稳定控制，存在批间差异大、生产不稳定等问题，还会带来排异反应的风险。为了解决上述问题，无血清冻存液成为一种可行的替代方案。但是，目前的脐带间充质干细胞无血清冻存液冻存后复苏的细胞存活率低，不能满足临床应用的需求。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法。
本发明提出的脐带间充质干细胞冻存液不含动物源血清，无临床应用风险，采用本发明冻存液以及冻存方法冻存后进行复苏，脐带间充质干细胞的存活率高，具有良好的分化潜能，复苏效果好。
一种脐带间充质干细胞冻存液，包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。
优选地，所述二甲基亚砜与所述DMEM/F12培养基的体积比为(0.05～0.08)：1，所述海藻糖在所述冻存液中的浓度为1～1.5mg/mL，所述人层粘连蛋白在所述冻存液中的浓度为6～8μg/mL，所述人α1-酸性糖蛋白在所述冻存液中的浓度为10～15μg/mL，所述硫酸乙酰肝素在所述冻存液中的浓度为40～50μg/mL，所述硫酸软骨素在所述冻存液中的浓度为100～120μg/mL，所述香菇多糖在所述冻存液中的浓度为20～30μg/mL。
更优选地，所述二甲基亚砜与所述DMEM/F12培养基的体积比为0.06：1，所述海藻糖在所述冻存液中的浓度为1.4mg/mL，所述人层粘连蛋白在所述冻存液中的浓度为7.5μg/mL，所述人α1-酸性糖蛋白在所述冻存液中的浓度为12μg/mL，所述硫酸乙酰肝素在所述冻存液中的浓度为45μg/mL，所述硫酸软骨素在所述冻存液中的浓度为120μg/mL，所述香菇多糖在所述冻存液中的浓度为24μg/mL。
优选地，脐带间充质干细胞冻存液制备方法如下：
S1、将海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖在DMEM/F12基础培养基中溶解，得到混合液；
S2、将二甲基亚砜与所述混合液混合均匀，即得。
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，使用上述脐带间充质干细胞冻存液。
优选地，脐带间充质干细胞的冻存方法包括：将脐带间充质干细胞与所述脐带间充质干细胞冻存液混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存。
优选地，脐带间充质干细胞的冻存方法具体步骤包括：
S1、向培养皿中加入0.02-0.03mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于所述胰酶溶液体积8-10倍的无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与所述脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存。
优选地，用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5～1.5×107个脐带间充质干细胞。
本发明的脐带间充质干细胞冻存液包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。其中，二甲基亚砜可以渗透到细胞内部，减少细胞内冰晶的形成；人层粘连蛋白具有球形结构域，和冰晶结合性强，能阻止冰晶长大；海藻糖，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖配合，可以有效清除自由基，减少冻存过程中自由基对细胞的损伤；海藻糖和香菇多糖配合，使冻存液具有合适的粘度，缓解细胞膜内外的渗透压变化，减少冷冻时细胞内的冰晶形成；香菇多糖具有分支结构的糖链，人α1-酸性糖蛋白带有5条多分支的N-糖链，将带有多分支的N-糖链的人α1-酸性糖蛋白、具有分支结构糖链的香菇多糖与具有线性糖链的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素配合，具有不同结构的糖链彼此之间起到协同作用，能更好地束缚水分子，阻止水分子通过扩散运动聚集在一起形成冰晶，从而更有效地抑制细胞外冰晶的形成和长大，减少对细胞的机械损伤；人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖相互配合，通过多糖与蛋白分子间的交互作用，也能更好地束缚水分子，从而抑制细胞外冰晶的形成和长大，减缓对细胞的机械损伤。
综上所述，本发明提出的脐带间充质干细胞冻存液不含动物源血清，无临床应用风险，而且能更有效地减少冻存过程中各因素对细胞的损伤作用。采用本发明冻存液以及冻存方法冻存后进行复苏，脐带间充质干细胞的存活率高，具有良好的分化潜能，复苏效果好。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种脐带间充质干细胞冻存液，包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。其中，二甲基亚砜与DMEM/F12培养基的体积比为0.05：1，海藻糖在冻存液中的浓度为1mg/mL，人层粘连蛋白在冻存液中的浓度为6μg/mL，人α1-酸性糖蛋白在冻存液中的浓度为10μg/mL，硫酸乙酰肝素在冻存液中的浓度为40μg/mL，硫酸软骨素在冻存液中的浓度为100μg/mL，香菇多糖在冻存液中的浓度为20μg/mL。
实施例2
一种脐带间充质干细胞冻存液，包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。其中，二甲基亚砜与所述DMEM/F12培养基的体积比为0.06：1，海藻糖在冻存液中的浓度为1.4mg/mL，人层粘连蛋白在冻存液中的浓度为7.5μg/mL，人α1-酸性糖蛋白在冻存液中的浓度为12μg/mL，硫酸乙酰肝素在冻存液中的浓度为45μg/mL，硫酸软骨素在冻存液中的浓度为120μg/mL，香菇多糖在冻存液中的浓度为24μg/mL。
实施例3
一种脐带间充质干细胞冻存液，包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。其中，二甲基亚砜与DMEM/F12培养基的体积比为0.08：1，海藻糖在冻存液中的浓度为1.5mg/mL，人层粘连蛋白在冻存液中的浓度为8μg/mL，人α1-酸性糖蛋白在冻存液中的浓度为15μg/mL，硫酸乙酰肝素在冻存液中的浓度为50μg/mL，硫酸软骨素在冻存液中的浓度为120μg/mL，香菇多糖在冻存液中的浓度为30μg/mL。
实施例4
一种脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，包括下述步骤：
S1、将海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖在DMEM/F12基础培养基中溶解，得到混合液；
S2、将二甲基亚砜与所述混合液混合均匀，即得。
实施例5
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，具体步骤如下：
S1、向培养皿中加入0.02mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于胰酶溶液体积8倍的商用无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与实施例1中的脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存，脐带间充质干细胞冻存液的用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5×107个脐带间充质干细胞。
实施例6
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，具体步骤如下：
S1、向培养皿中加入0.02mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于胰酶溶液体积8倍的商用无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与实施例2中的脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存，脐带间充质干细胞冻存液的用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5×107个脐带间充质干细胞。
实施例7
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，具体步骤如下：
S1、向培养皿中加入0.03mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于胰酶溶液体积8倍的商用无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与实施例3中的脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存，脐带间充质干细胞冻存液的用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5×107个脐带间充质干细胞。
对比例1
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，具体步骤如下：
S1、向培养皿中加入0.03mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于胰酶溶液体积8倍的商用无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与常规脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存，脐带间充质干细胞冻存液的用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5×107个脐带间充质干细胞。
其中，常规脐带间充质干细胞冻存液包括以下组分：DMEM/F12培养基，胎牛血清，二甲基亚砜。其中，DMEM/F12培养基，胎牛血清，二甲基亚砜的体积比为7:2:1。
试验例1
将脐带组织剪碎至1-2mm3的小块，按0.5g/瓶将组织小块转移至75cm2细胞培养瓶中，再在每个培养瓶中加入10mL商用无血清培养基，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，7d后首次更换新鲜培养基，此后3d更换一次新鲜培养基。待细胞达到80％融合度时，用0.25％的胰酶消化，按1:3的比例传代。以P5代细胞作为待处理细胞。
将待处理细胞按实施例5-7以及对比例1的冻存方法进行冻存处理，在液氮中保存6个月后取出复苏，通过台盼蓝染色法计算细胞存活率。其中，存活率的计算公式为：细胞存活率＝{未着色细胞/(未着色细胞+着色细胞)}×100％。实验结果见表1。
表1细胞存活率
实施例5 实施例6 实施例7 对比例1
细胞存活率(％) 95.5 98.7 96.3 82.4
由此可见，本发明的冻存液与常规含血清冻存液相比，具有更高的复苏后细胞存活率，冻存效果更好。
试验例2
将脐带组织剪碎至1-2mm3的小块，按0.5g/瓶将组织小块转移至75cm2细胞培养瓶中，再在每个培养瓶中加入10mL商用无血清培养基，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，7d后首次更换新鲜培养基，此后3d更换一次新鲜培养基。待细胞达到80％融合度时，用0.25％的胰酶消化，按1:3的比例传代。以P5代细胞作为待处理细胞。
将待处理细胞按实施例5-7冻存方法进行冻存处理，在液氮中保存6个月后取出复苏，然后以2×105/孔的密度接种于24孔板中，待细胞达到90％融合后更换成脂分化诱导培养基继续培养，每三天更换培养基，21天后用油红O染色，结果可见红色油滴。由此可见，本发明的冻存液冻存后的脐带间充质干细胞仍然保存良好的分化潜能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：DMEM/F12基础培养基，二甲基亚砜，海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜与所述DMEM/F12培养基的体积比为(0.05～0.08)：1，所述海藻糖在所述冻存液中的浓度为1～1.5mg/mL，所述人层粘连蛋白在所述冻存液中的浓度为6～8μg/mL，所述人α1-酸性糖蛋白在所述冻存液中的浓度为10～15μg/mL，所述硫酸乙酰肝素在所述冻存液中的浓度为40～50μg/mL，所述硫酸软骨素在所述冻存液中的浓度为100～120μg/mL，所述香菇多糖在所述冻存液中的浓度为20～30μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜与所述DMEM/F12培养基的体积比为0.06：1，所述海藻糖在所述冻存液中的浓度为1.4mg/mL，所述人层粘连蛋白在所述冻存液中的浓度为7.5μg/mL，所述人α1-酸性糖蛋白在所述冻存液中的浓度为12μg/mL，所述硫酸乙酰肝素在所述冻存液中的浓度为45μg/mL，所述硫酸软骨素在所述冻存液中的浓度为120μg/mL，所述香菇多糖在所述冻存液中的浓度为24μg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，制备方法如下：
S1、将海藻糖，人层粘连蛋白，人α1-酸性糖蛋白，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和香菇多糖在DMEM/F12基础培养基中溶解，得到混合液；
S2、将二甲基亚砜与所述混合液混合均匀，即得。
5.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，使用权利要求1-4中任一项所述的脐带间充质干细胞冻存液。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞与所述脐带间充质干细胞冻存液混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1、向培养皿中加入0.02-0.03mL/cm2的浓度为0.25％的胰酶溶液对贴壁脐带间充质干细胞进行消化，然后加入相当于所述胰酶溶液体积8-10倍的无血清培养基终止消化，离心收集细胞；
S2、将收集得到的细胞与所述脐带间充质干细胞冻存液混合后轻轻吹打混匀，置于-80℃冻存过夜，然后转入液氮中长期冻存。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，用量为每mL脐带间充质干细胞冻存液中加入0.5～1.5×107个脐带间充质干细胞。
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