CN112075418B - 脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法 - Google Patents

脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份，L‑岩藻糖2～6份，硫辛酸1～5份，还原型谷胱甘肽0.1～2份。本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液不含有动物血清，安全性高，成本低，且制备方法简单，与常规的冻存方法相比，采用本发明脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞可明显减少冻存液对细胞的损伤，复苏后细胞回收率高。

Description

脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，是多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。
脂肪间充质干细胞(Adipose-derived MesesnchymalStemCells,ADMSCs)是指存在于脂肪组织中的MSCs，具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化成骨细胞、软骨细胞脂肪细胞等。由于脂肪组织几乎遍布动物全身，在整个声明过程中有极强的可塑性。ADMSCs具有很多优点：第一，部分避免了伦理及法律上的问题；第二，来源广泛，从医学角度来说，吸脂术与抽骨髓相比，从腹部获取脂肪较为容易，给别人带来的损伤也较小。第三，ADMSCs具有多向分化潜能，在不同条件下可被诱导分化为成骨细胞软骨细胞脂肪细胞等，中胚层细胞也可向神经细胞、肝细胞等其他胚层分化；第四，ADMSCs表面分子标记与其他组织来源的MSCS相似；第五，脂肪来源的MSCs与骨髓来源的MSCs，相比具有更长的培养时间以及更高的增殖能力。
目前现有技术中，脂肪间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以二甲基亚砜和血清为主要成分，另一种是以培养基、二甲基亚砜和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。中国专利申请CN 109644982 A公开了一种用于脂肪干细胞的冻存方法，所述细胞冻存液由90％胎牛血清FBS和10％二甲基亚砜DMSO所组成。虽然该冻存液使用较为普遍，但其主要成分血清具有成分复杂，质量不稳定，有被动物病原污染的可能性，具有价格昂贵，成本较高等缺点。中国专利申请CN106386783A公开了一种间充质干细胞的冻存保护液，所述冻存保护液包括1640培养液69％，二甲基亚砜10％，人血清白蛋白10％，硫辛酸10％，成纤维细胞生长因子1％。所述的二甲基亚砜虽然是冻存细胞时常用的保护剂，但是二甲基亚砜会对细胞产生毒性作用，会对冻存的干细胞造成不可逆的损伤，导致复苏后细胞回收率及细胞活率较低。
综上所述，现有技术中脂肪间充质干细胞的冻存液存在成本较高、效果均不理想等普遍问题，如何最大限度的避免干细胞冻存与复苏过程中的损伤，提高复苏后细胞回收率及细胞活率成为亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，不含有动物血清，安全性高，成本低，且制备方法简单，与常规的冻存方法相比，采用本发明脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞可明显减少冻存液对细胞的损伤作用，复苏后细胞回收率高。
本发明的技术方案是：
一种脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份。
进一步地，所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
进一步地，所述基础培养基为Lonza基础培养基或DMEM基础培养基。
进一步地，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10～16:9～13:2～6组成。
进一步地，所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量7～12倍的体积份数为60～80％乙醇水溶液浸泡3～5小时，然后在50～70℃下提取1-3次，每次提取时间为1-3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
进一步地，所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15～20倍的水浸泡1～3小时，然后加热到90℃，回流提取1～2小时，过滤得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10～15倍体积的蒸馏水继续回流1～2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10～1/30，再加入3～6倍体积的70～80％乙醇混合均匀，静置3～5小时，3000～5000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在60～80℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。
更进一步地，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用本发明所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
进一步地，所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
进一步地，所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×105～107个/mL。
进一步地，所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以1～4℃/min的速率的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h。
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞冻存液，除冻存细胞所需的基础物质外，本发明还添加了低温保护剂，为非渗透性保护液，由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按一定比例组成，能够优先与本发明中脂肪间充质干细胞冻存液中的水分子反应，从而降低其中自由水的含量使冰点降低，减少冰晶的形成，在脂肪间充质干细胞外部保护，减少冰晶对其细胞膜产生损伤，从而有效提高干细胞的抗冻性。进一步地，添加的茯苓提取物、裂褶菌多糖等天然物质，能够使冻存液中的电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
同时，本申请中添加的L-岩藻糖为渗透性保护液，是六碳糖的一种，作为糖蛋白中糖链的组成部分广泛存在于各类细胞表面的质膜上，能够在细胞冻存液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，减低细胞内外为结冰溶液中电解质，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，有效防止细胞的冻伤。
综上，本发明提供含有双重保护成份的冻存液，通过添加的低温保护剂和L-岩藻糖协同作用，能够从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了细胞的复苏率，同时本发明的细胞冻存液中不含有动物血清，安全性高，成本低。
另外，本发明中还添加了硫辛酸，其为一种存在于线粒体的酶，硫辛酸属于B族维生素中的一类化合物，兼具水溶性和脂溶性，可以深入到细胞中各个部位而起到抗氧化作用，通过参与氧化脱羧反应而使糖、脂、氨基酸代谢相互协调，并且硫辛酸的巯基很容易进行氧化还原反应，故可保护巯基酶免受重金属离子的毒害，清除老化与致病的自由基，保护细胞。
与现有技术相比，本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液具有以下优势：
(1)本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，除冻存细胞所需的基础物质外，还添加了低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽各组分相互协同作用，能够从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，维持细胞活性，大大提高了细胞的复苏率。
(2)本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，不含有动物血清，液态体系稳定，安全性高，成本低，且制备方法简单。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
Lonza基础培养基购自美国Lonza公司；DMEM基础培养基购自上海启达生物科技有限公司；裂褶菌菌丝粉购自上海研生实业有限公司
另外本发明所用的其他试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
实施例1一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：Lonza基础培养基80份、低温保护剂5份、L-岩藻糖2份、硫辛酸1份和还原型谷胱甘肽0.1份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10:13:6组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量7倍的体积份数为60％乙醇水溶液浸泡3小时，然后在50℃下提取1次，提取时间为1小时，过滤，减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15倍的水浸泡1小时，然后加热到90℃，回流提取1小时，滤过得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10倍体积的蒸馏水继续回流1小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/30，再加入3倍体积的70％乙醇混合均匀，静置3小时，3000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在60℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于Lonza基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×105个/mL。
所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-30℃下预冻2h；然后以1℃/min的速率的温度降至-80℃，继续预冻3h。
实施例2一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量10倍的体积份数为70％乙醇水溶液浸泡4小时，然后在60℃下提取2次，每次提取时间为2小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量18倍的水浸泡2小时，然后加热到90℃，回流提取1.5小时，滤过得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量12倍体积的蒸馏水继续回流1.5小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/20，再加入5倍体积的75％乙醇混合均匀，静置4小时，4000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在70℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于DMEM基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×106个/mL。
所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-25℃下预冻2.5h；然后以2℃/min的速率的温度降至-75℃，继续预冻4h。
实施例3一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基120份、低温保护剂10份、L-岩藻糖6份、硫辛酸5份和还原型谷胱甘肽2份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比16:9:2组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量12倍的体积份数为80％乙醇水溶液浸泡5小时，然后在70℃下提取3次，每次提取时间为3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量20倍的水浸泡3小时，然后加热到90℃，回流提取2小时，滤过得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量15倍体积的蒸馏水继续回流2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10，再加入6倍体积的80％乙醇混合均匀，静置5小时，5000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在80℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于DMEM基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×107个/mL。
所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-20℃下预冻3h；然后以4℃/min的速率的温度降至-70℃，继续预冻5h。
对比例1一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素和裂褶菌多糖按重量比13:4组成。
所述的裂褶菌多糖的制备步骤与实施例2类似。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法与实施例2类似。
与实施例2的区别在于，所述的低温保护中未添加茯苓提取物。
对比例2一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素和茯苓提取物按重量比13:10组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤与实施例2类似。
所述的裂褶菌多糖的制备步骤与实施例2类似。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法与实施例2类似。
与实施例2的区别在于，所述的低温保护中未添加裂褶菌多糖。
对比例3一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比1:1:1组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤与实施例2类似。
所述的裂褶菌多糖的制备步骤与实施例2类似。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法与实施例2类似。
与实施例2的区别在于，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比1:1:1组成。
对比例4一种脂肪间充质干细胞冻存液
所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：DMEM基础培养基100份、低温保护剂8份、D-半乳糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。
所述的茯苓提取物的制备步骤与实施例2类似。
所述的裂褶菌多糖的制备步骤与实施例2类似。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法为采用所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法如下：
S1、将低温保护剂，D-半乳糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于DMEM基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×106个/mL。
所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-25℃下预冻2.5h；然后以2℃/min的速率的温度降至-75℃，继续预冻4h。
与实施例2的区别在于，所述的脂肪间充质干细胞冻存液的组分中用D-半乳糖替换L-岩藻糖。
试验例一、复苏后细胞的细胞活率实验
1.试验材料：实施例1～3、对比例1～4制备的脂肪间充质干细胞冻存液。
2.试验方法：
(1)无菌吸取吸脂手术的脂肪抽提液，用生理盐水冲洗2次，去除吸脂手术中所用药物及血细胞；用0.5％I型胶原酶37℃消化0.5小时，400g/min离心5min，吸取上层脂肪和未消化完全的组织后，混匀用200目筛网过滤；将所获得的细胞悬液500g/min，离心8min，细胞沉淀用生理盐水洗涤后，调细胞浓度为7×104个/mL，用含体积分数10％血清的DMEM/F12培养基悬浮，接种于10cm培养皿中，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养；48小时后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基；3天换液1次，培养6～10天细胞达80％以上汇合度时，进行传代培养；
(2)用0.25％胰酶对细胞进行消化，弃去培养皿中的培养基，生理盐水冲洗两次，用0.25％胰酶消化细胞，500g/min离心5min收集细胞；
(3)配制成脂肪间充质干细胞冻存液冻存细胞，细胞密度为1×106个/mL，1.5mL/管，密封后标记冻存细胞名称，冻存液种类和冻存日期；
(4)脂肪间充质干细胞的复苏
将冻存后的脂肪间充质干细胞从液氮中取出，置于37℃的水浴中轻微摇动1.5分钟，待液体都融化后，放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，相对每mL的冻存液，生长培养基的加入量为15mL，2000rpm离心5min收集细胞，去上清液，再加入生长培养基悬浮，调整细胞浓度至1×106个/mL，使培养皿中的细胞均匀分布。
(5)复苏率检测
分别将冻存3个月、9个月和18个月的样品复苏，取100μL细胞液与100μL台盼蓝混合，取少许细胞混合液加入血球计数器，在显微镜下计算活细胞数和死细胞数。活细胞不受染色，死细胞会被染成蓝色。并按照下列公式计算细胞活率：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
3.试验结果
试验结果如表1所示。
表1脂肪间充质干复苏后细胞活率结果
Figure BDA0002711281730000111
由表1可知，本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，特别适合于人脂肪干细胞的冻存培养，能够较好的保护细胞的活性。与冻存前的细胞活率相比，使用实施例1～3组制备的脂肪间充质干细胞冻存液冻存的细胞，3个月后复苏率均在95％以上，其中实施例2组效果最好，为本发明的最佳实施例。本发明实施例组制备的细胞冻存液冻存的细胞复苏后的细胞活率要好于对比例1～4组。而采用对比例1～3组(改变了低温保护剂的组分和其配比)，以及对比例4组(用D-半乳糖替代L-岩藻糖)冻存后的脂肪间充质干细胞，复苏后的细胞活率较实施例组中明显降低。说明本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，各组分的协同作用明显，组分缺一不可，使得冻存液能产生最佳的冻存效果。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括如下组分及其重量份数：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份；
所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10～16:9～13:2～6组成；
所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量7～12倍的体积份数为60～80％乙醇水溶液浸泡3～5小时，然后在50～70℃下提取1～3次，每次提取时间为1～3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15～20倍的水浸泡1～3小时，然后加热到90℃，回流提取1～2小时，过滤得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10～15倍体积的蒸馏水继续回流1～2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10～1/30，再加入3～6倍体积的70～80％乙醇混合均匀，静置3～5小时，3000～5000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在60～80℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。
2.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下组分及其重量份数组成：基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。
3.如权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为Lonza基础培养基或DMEM基础培养基。
4.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。
5.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。
6.如权利要求5所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；
S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；
S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；
S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。
7.如权利要求6所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×105～107个/mL。
8.如权利要求6所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以1～4℃/min的速率的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h。
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