CN111838138A - 一种干细胞冻存液及其制备和使用方法 - Google Patents

一种干细胞冻存液及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞冻存液及其制备和使用方法，该冻存液包括DMSO 0‑20％、甘油1‑2％、海藻糖1‑2％、乙醇2‑5％、N‑十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8‑桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。使用本发明冻存液冻存后干细胞复苏率达到90％以上，增殖速度与未冻存细胞相比不仅无明显降低，甚至增殖速度加快。

Description

一种干细胞冻存液及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。
背景技术
干细胞是一类具有高度自我更新增殖和多向分化潜能的细胞，包括神经干细胞、间充质干细胞等，其在一定的条件下可分化成多种类型的细胞。干细胞具有多种用途和功能，可用于体外研究组织器官的生长发育、建立疾病模型、药物筛选，也可用于疾病治疗。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
干细胞具有良好的临床应用前景，其长期安全稳定保存是一重要问题。低温冻存是实现干细胞长期保存的常用方法，但冷冻保存的过程的冰晶以及溶液效应等均对细胞产生一定的损伤。干细胞冻存液可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好地保存细胞的生物性能。经典干细胞冻存液含有DMSO和胎牛血清，然而，DMSO虽可降低保存液的冰点并减少胞内冰的形成，但DMSO自身也具有一定的毒性，有研究也表明，高含量DMSO可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，反过来导致肿瘤的形成。胎牛血清可能含有动物源性病原体，也存在一定的安全问题。目前的干细胞冻存液的使用效果不甚理想，因此，研发一种有效防止细胞低温损伤和保持细胞活力的干细胞冻存液至关重要。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。
本发明方案包括以下方面：
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。
优选的，所述干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0～5％、甘油1～2％、海藻糖1-2％、乙醇2～3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.04％、葫芦巴碱0.03～0.05％、1,8-桉叶素0.02～0.03％、余量是DMEM培养基。
更优选的，所述的干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C 0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。
本发明所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞。所述成体干细胞优选为脂肪间充质干细胞。
本发明还提供了所述的干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，得混合物A；将N-十二烷酰基肌氨酸、葫芦巴碱、1,8-桉叶素与乙醇混合，20～25℃且100～150rpm搅拌条件下加入混合物A和/或DMSO，混合5～10min；依次加入甘油、海藻糖和DMEM培养基，混匀即得干细胞冻存液。
优选的，制备方法中，将猪苓酸C与磷酸钙混合，在30～35℃条件下均匀，保温备用。
本发明还提供所述的干细胞冻存液的使用方法：将细胞悬液与干细胞冻存液混匀，装入冻存管中，冻存管先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存。
优选的，细胞悬液与干细胞冻存液混匀后，细胞密度为4×106个/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种干细胞冻存液，包括DMSO、甘油、海藻糖、乙醇、N-十二烷酰基肌氨酸、磷酸钙、猪苓酸C、葫芦巴碱、1,8-桉叶素、DMEM培养基等组份。本发明冻存液能够有效抑制细胞内冰晶的产生，在冻存和复苏过程中维持蛋白质的稳定性，保持甚至促进冻存后细胞活性。使用本发明冻存液冻存后干细胞复苏率达到90％以上，增殖速度与未冻存细胞相比不仅无明显降低，甚至增殖速度加快。
通过组份配比的优化，不仅能够维持95.9％的复苏率，且可无需使用DMSO，避免了DMSO可能带来的安全问题，降低成本。
本发明还发现冻存方法也会对复苏率产生影响，采用本发明冻存方法，先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存，复苏率最好。
制备方法的优化，不仅使得复苏率达到98.7％，且能有效提高增殖速度。
附图说明
图1：实验例生长曲线测定结果统计图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明所述1,8-桉叶素，CAS号：470-82-6，分子式C10H18O
所述N-十二烷酰基肌氨酸，CAS号：97-78-9，分子式:C15H29NO3
所述猪苓酸C，CAS号：465-18-9，分子式：C31H46O4
所述葫芦巴碱，CAS号：535-83-1，分子式:C7H7NO2
所述1,8-桉叶素，CAS号：470-82-6，分子式:C10H18O
所述DMSO为二甲基亚砜。
DMEM培养基(Hyclone公司，SH30021.02)
实施例1
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 5％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇2％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05％、磷酸钙1.0％、猪苓酸C 0.03％、葫芦巴碱0.03％、1,8-桉叶素0.04％、余量是DMEM培养基。
实施例2
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 5％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇2％、N-十二烷酰基肌氨酸0.07％、磷酸钙0.7％、猪苓酸C 0.03％、葫芦巴碱0.03％、1,8-桉叶素0.03％、余量是DMEM培养基。
实施例3
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C 0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。
实施例4
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 20％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05％、磷酸钙1.0％、猪苓酸C 0.06％、葫芦巴碱0.02％、1,8-桉叶素0.01％、余量是DMEM培养基。
实施例1-4所述的干细胞冻存液的制备方法为：
将各成分于20～25℃且100～150rpm搅拌条件下混合均匀，得干细胞冻存液，保温备用。
实施例5
本例与实施例1的主要区别是：
干细胞冻存液的制备方法为：
将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，在30～35℃条件下均匀，得混合物A，保温备用；将N-十二烷酰基肌氨酸、1,8-桉叶素与乙醇混合，20～25℃且100～150rpm搅拌条件下加入混合物A和DMSO，混合5～10min；依次加入甘油、海藻糖和DMEM培养基，混匀即得干细胞冻存液，保温备用。
对比例1
本例与实施例1的主要区别是：
一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 5％、甘油1％、海藻糖2％、乙醇2％、N-十二烷酰基肌氨酸0.1％、磷酸钙1.0％、猪苓酸C 0.2％、葫芦巴碱0.01％、1,8-桉叶素0.06％、余量是DMEM培养基。
对比例2
本例与实施例1的主要区别是：未加入N-十二烷酰基肌氨酸、磷酸钙、猪苓酸C、葫芦巴碱、1,8-桉叶素。
对比例3
本例与实施例1的主要区别是：
N-十二烷酰基肌氨酸替换为N-苯甲酰基谷氨酸(CAS：6094-36-6)，猪苓酸替换为茯苓酸(CAS号：29070-92-6)，葫芦巴碱替换为石斛碱(CAS号：2115-91-5)，1,8-桉叶素替换为β-桉叶醇(Cas号：473-15-4)。
对比例4
本例所述干细胞冻存液为，按质量百分比，含50％DMEM、40％FBS和10％DMSO。
试验例
1.1实验材料
DMEM培养基(Hyclone公司，SH30021.02)；胎牛血清(杭州四季青)；DMSO液(上海生工)，MTT液(Solarbio公司)；台盼蓝染料(Solarbio公司)；青霉素、链霉素、Ⅰ型胶原酶(Invitrogen)
1.2实验方法
1.2.1ADSCs的分离、培养：
参照现有技术采用胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞。无菌条件下取3月龄新西兰大白兔的腹股沟皮下新鲜脂肪组织，超净台上用PBS冲洗，剔除小血管、包膜及多余组织，将脂肪组织剪碎呈糜状，加入3倍体积的1g/L的Ⅰ型胶原酶，37℃恒温摇床以80rpm摇速消化90min，经200目筛网过滤后，加入等量含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1200rpm离心10min，留贴壁细胞；用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml、0.05g/L L-抗坏血酸)重悬，并将获取的单细胞悬液接种在25cm2培养瓶中，在37℃、体积分数5％CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。2天后第一次换液，以后视情况每2～3天换一次液，每天观察细胞生长形态特征，细胞长满至90％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，按1:3比例传代培养。传至第3代，HE染色显示细胞形态均匀，呈长梭形。第3代细胞经流式细胞仪鉴定，CD29、CD44阳性表达率均95％以上，不表达CD34、CD45。取第3代细胞为实验对象。
1.2.2冻存：取第3代的ADSCs，用0.25％胰酶进行消化，离心收集细胞，加入冻存液，混匀，细胞密度为4×106/ml，装入冻存管中，每管1ml。冻存管先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存。
1.2.3复苏：冻存6个月后取出冻存管，37℃条件下复苏。1000r/min离心10min，除去冻存液，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml、0.05g/L L-抗坏血酸)重悬细胞。
1.2.4复苏存活率统计：
ADSCs悬液与0.4％的台盼蓝染液按体积4:1的比例混匀，室温静置3min。死细胞被染成蓝色，而活细胞不被染色。记录细胞总数和死亡数，计算复苏率。结果见表1。1-5组代表使用实施例1-5的冻存液，6-9组代表使用对比例1-4组的冻存液，对照组为未冻存细胞，空白组为培养液(不加细胞)，第10组为冻存法组(即冻存液为实施例3的冻存液，冻存方法替换为：冻存管先在0～2℃放置80～90min，然后-45～50℃放置8～8.5h，之后采用-196℃液氮进行冻存)。
复苏率＝(细胞总数-细胞死亡数)/细胞总数×100％
1.2.5生长曲线测定：
取复苏后的细胞加入含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml、0.05g/L L-抗坏血酸)中培养，将处于对数生长期的细胞消化成细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml后分别接种在96孔培养板中，每孔细胞悬液量为100ul，总设7个培养板，每块培养板分组，每组3个复孔。1-5组代表使用实施例1-5的冻存液，6-9组代表使用对比例1-4组的冻存液，对照组为未冻存细胞，空白组为培养液(不加细胞)，另设置第10组为冻存法组(即冻存液为实施例1的冻存液，冻存方法替换为：冻存管先在0～2℃放置80～90min，然后-45～50℃放置8～8.5h，之后采用-196℃液氮进行冻存)。各组在37℃、体积分数5％CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。每隔24h取出一块培养板测OD值。具体方法为：向每个含有细胞的孔内加入20ul的浓度为5mg/ml的MTT，置于培养箱之中孵育4h后，吸出孔内液体，终止培养。加入DMSO 150ul/孔，将其置摇床室温振荡10min，用酶联免疫检测仪测定OD490nm。结果见表2和图1。
表1
复苏率/％
1组(实施例1) 95.8±1.7
2组(实施例2) 96.8±2.3
3组(实施例3) 95.9±0.8
4组(实施例4) 92.4±1.2
5组(实施例5) 98.7±1.5
6组(对比例1) 77.3±1.1
7组(对比例2) 70.9±1.8
8组(对比例3) 65.7±1.0
9组(对比例4) 71.5±1.6
10组 88.4±2.3
对照组 99.8±0.1
空白组 -
表2
Figure BDA0002658101290000061
Figure BDA0002658101290000071
根据表1实验结果可知：1-5组冻存液包括DMSO、甘油、海藻糖、乙醇、N-十二烷酰基肌氨酸、磷酸钙、猪苓酸C、葫芦巴碱、1,8-桉叶素、DMEM培养基，通过合理控制配比，干细胞冻存后复苏率达到90％以上。
采用3组的配比，不仅能够维持95.9％的复苏率，且无需使用DMSO，避免了DMSO可能带来的安全问题，降低成本。对比1组与10组的结果可以发现，冻存方法也会对复苏率产生影响，采用1组的冻存方法，复苏率最好。对比1组和5组的结果可以发现，采用5组的制备方法，复苏率达到98.7％。
从图1结果可知，1-10组及对照组均呈S型生长曲线，5组第96h达到增殖顶峰，其他组于第120h达到增殖顶峰，说明采用实施例5的制备方法所得冻存液不仅复苏率最高，且能有效提高增殖速度。1-4组生长曲线与对照组无明显差异，10组略低于1组，6-9组与对照组相比较低。
此外，经常规实验验证，与未冻存的相比，各组细胞形态、表面抗原表达、分化能力等方面均无显著差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，
DMSO 0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0～5％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.04％、葫芦巴碱0.03～0.05％、1,8-桉叶素0.02～0.03％、余量是DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C 0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞。
5.根据权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
6.权利要求1所述的干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，得混合物A；将N-十二烷酰基肌氨酸、1,8-桉叶素、葫芦巴碱与乙醇混合，20～25℃且100～150rpm搅拌条件下加入混合物A和/或DMSO，混合5～10min；依次加入甘油、海藻糖和DMEM培养基，混匀即得干细胞冻存液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将猪苓酸C与磷酸钙混合，在30～35℃条件下均匀，保温备用。
8.权利要求1所述的干细胞冻存液的使用方法，其特征在于，将细胞悬液与干细胞冻存液混匀，装入冻存管中，冻存管先在0～2℃放置30～35min，然后-30～-35℃放置60～70min，-60～-65℃放置9～10h，之后采用-196℃液氮进行冻存。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，细胞悬液与干细胞冻存液混匀后，细胞密度为4×106/ml。
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