CN114736856B - 一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，本发明的制备步骤包括：(1)犬胎盘组织的采集及用保存液低温运输；(2)用清洗液进行洗涤，用绞碎器进行组织绞碎；(3)加入消化液进行消化；(4)通过离心收集细胞；(5)用生长培养基培养细胞及传代；(6)检测合格后冻存备用。本发明方法操作简单，方便实用，效率高，能够极大的提高原代细胞的收获量，所用生长培养基能够促进细胞的快速增殖，维持细胞的干性。本发明所获得的间充质干细胞能够治疗犬科动物疾病，包括皮肤缺损、烧烫伤、脓皮病、骨关节炎、股骨头坏死、急性肾损伤、药物性肝损伤、结肠炎、再生障碍性贫血、角膜炎、结膜炎、干眼症、口炎等。

Description

一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种干细胞的制备方法，具体地说是涉及一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能。多种组织器官分离和培养 MSCs，包括脂肪组织、胎肝、胎肺、胎盘、脐带、牙髓、滑膜、牙周膜、子宫内膜等。
大量的研究已经表明在合适的培养的条件下，MSCs能分化为中胚层、内胚层和甚至是外胚层细胞，MSCs能分泌多种生长因子和免疫保护因子，其中有些免疫因子在细胞和器官移植过程中广泛应用，最重要的是，MSCs不会形成肿瘤，对组织再生和修复治疗应用是安全的。由于可以大量培养扩增和多胚层分化潜能，MSCs是干细胞治疗和基因载体理想的细胞来源。MSCs的另一个独特的特点是他们能够逃避免疫识别和抑制免疫反应，因此，MSCs在免疫性疾病的免疫调节细胞治疗过程中将会是一种非常有应用前景的细胞药物。目前，大量动物模型，特别是犬科动物模型的研究已经证明，间充质干细胞可以治疗天疱疮、退行性关节炎、髋关节发育不良、大面积皮肤损伤、皮肤溃疡、角膜溃疡、肝功能衰竭、肾功能衰竭、神经损伤等疾病。MSCs具有造血支持活性和免疫调节活性，并具有独特的细胞因子分泌功能。是一种潜在的可用于治疗多种疑难疾病的治疗手段。
目前干细胞治疗成为了传统治疗手段之外临床医生的新选择。在动物医学领域，间充质干细胞同样有着巨大的需求和广阔的应用空间，由于种属差异，现有用于人胎盘间充质干细胞分离提取的方法不完全适用于动物干细胞，另外犬的胎盘组织体积小，尤其是小型犬的胎盘组织太小，用现有方法分离到的原代细胞数量极少，因此亟需一种高效分离动物间充质干细胞，特别是适用于犬科动物间充质干细胞的分离方法。此外选用胎盘作为分离间充质干细胞的来源组织，有效的利用了动物分娩后的废弃物，同时不同于骨髓和脂肪干细胞，避免了获取干细胞的过程给供体动物所带来的创伤和痛苦，可以更好的保护动物权益，避免伦理争议。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种高效的犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，所获得的间充质干细胞能够治疗犬科动物疾病。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
（1）采集新鲜的犬胎盘组织，用胎盘组织保存液进行保存，低温运输至洁净车间；
（2）用预冷的含有庆大霉素的磷酸缓冲液作为冲洗液进行组织洗涤，冲洗去除残留血液和粪便，直至溶液清亮，使用消毒处理过的电动绞肉器进行组织绞碎，绞成0.5～2mm3的肉糜；
（3）将肉糜称重，加入消化液进行消化，消化液体积和组织体积为2:1～6:1，将含有消化液的肉糜置于恒温磁力搅拌器上消化20～60分钟，转速为80～150 转/分钟，温度为37℃，消化结束后加入1～5倍体积的含有庆大霉素的磷酸缓冲液进行吹打混匀；所述消化液按照体积百分比包括以下成分：30%的重组胰蛋白酶trypLEexpress，50%的细胞解离液StemProAccutase，15%～19.9%的粘多糖酶和0.1%～5%的焦磷酸钠；
（4）将消化后的溶液通过100目筛网，收集过滤后的溶液进行离心，离心速度是400g，时长5～10分钟，弃去上清后得到原代细胞；
（5）将原代细胞放入培养容器中，加入生长培养基进行细胞培养传代；按照消化前的肉糜重量进行细胞接种，接种比例为0.01g/cm2～0.04g/cm2，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，3～5天后更换生长培养基，当细胞的融合程度达到80%～90%时进行细胞消化传代，消化液为重组胰酶，消化液质量体积比终浓度0.25%，传代比例为1：5～1：10；所述生长培养基成分：体积百分比10%～15%狗血清，10～50 μg/ml亚硒酸钠，10～50 ng/ml HSP60蛋白，其余为DF-12培养基；
（6）传代3次后，消化并获得细胞进行检测，检测项目为细胞形态观察，表型鉴定，分化鉴定，无菌检测，内毒素检测，支原体检测，合格后进行细胞冻存备用。
步骤（1）中，所述胎盘组织在保存液种保存时间不长于120小时。
步骤（2）中，所述磷酸缓冲液为商品化的DPBS溶液，庆大霉素的终浓度是200IU；冲洗3～5次，每次使用100～400ml冲洗液。
步骤（2）中，所述电动绞肉器转速为2000～5000转/分钟；转动时长为1～3分钟，间隔30秒转动1次，一次转动10～30秒，工作温度为2～8℃。
上述犬胎盘间充质干细胞的制备方法得到的犬胎盘间充质干细胞在制备犬科动物的皮肤缺损、烧烫伤、脓皮病、退行性关节炎、股骨头坏死、急性肾损伤、药物性肝损伤、结肠炎、再生障碍性贫血、角膜炎、结膜炎、干眼症、口炎药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明操作简单，方便实用，采用本发明的方法得到的犬胎盘间充质干细胞具有典型的成纤维样长梭形形态，个体小，增殖快，活力高，数量多，具有优异的成脂、成骨、成软骨分化能力。在动物医学领域有着巨大的需求和广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的方法获得的P1代细胞形态图。
图2是实施例1的方法获得的P3代细胞形态图。
图3是实施例1和2的方法获得的P1代细胞数量图。
图4是实施例1和2的方法获得的P3代细胞数量图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。
本发明的犬胎盘间充质干细胞的制备方法，步骤如下：
（1）采集新鲜的犬胎盘组织，将组织放入含有胎盘组织保存液（胎盘组织保存液为L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360 mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α 20µg/L, Primocin 10mg/L，丙酮酸钠 55 mg/L, 柠檬酸铁 18 mg/L, 硫酸锌 1.2 mg/L，其余用水补足）的无菌采集瓶中，采集瓶为1L容量，保存液体积为800ml，当同时有多胎时，一个胎盘单独放入一个采集瓶中，将密封好的采集瓶放入医用保温冷藏箱，低温运输至洁净车间，进行后续组织分离和细胞提取，组织在保存液种保存时间不长于120小时；
（2）用预冷的冲洗液（含有庆大霉素的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液为商品化的DPBS溶液，庆大霉素的终浓度是200IU）进行组织洗涤，冲洗去除残留血液和粪便，冲洗3～5次，每次使用100～400ml冲洗液，直至溶液清亮；优选的冲洗液体积为200ml；使用消毒处理过的电动绞肉器进行组织绞碎，只消毒电动绞肉器的刀片和容器部分，消毒处理方法为湿热灭菌法或者环氧乙烷灭菌法，使用时将电动绞肉器放入冷藏柜中，工作温度为2～8℃，绞肉器转速为2000～5000转/分钟；转动时长为1～3分钟，间隔30秒转动1次，一次转动时长10～30秒；优选的转速为3000转/分钟，优选的转动时长为2分钟；优选的一次转动时长20秒；将组织绞成肉糜，肉糜尺寸为0.5～2mm3。
（3）将肉糜称重，该重量与接种比例直接相关，在肉糜中加入消化液进行消化，消化液为重组胰蛋白酶、细胞解离液、粘多糖酶和焦磷酸钠的混合液，其中重组胰蛋白酶为商品化产品trypLEexpress、细胞解离液为商品化产品StemProAccutase。所述消化液按照体积百分比包括以下成分：30%的重组胰蛋白酶trypLE express，50%的细胞解离液StemProAccutase，15～19.9%的粘多糖酶，0.1%～5%的焦磷酸钠。消化液体积和组织体积比为2:1～6:1，优选的体积比为4:1。将含有消化液的肉糜置于恒温磁力搅拌器上消化20～60分钟，转速为80～150 转/分钟，温度为37℃，优选的消化时间是40分钟，优选的转速为100转/分钟；消化结束后加入1～5倍体积的冲洗液进行吹打混匀；
（4）将消化后的溶液通过100目无菌不锈钢筛网，收集过滤后的溶液进行离心，离心速度是400g，时长5～10分钟，弃去上清后得到原代细胞；
（5）将原代细胞放入培养容器中，加入生长培养基进行细胞培养；培养容器为T75细胞培养瓶(底面积75cm2)、T225细胞培养瓶(底面积225cm2)、T500细胞培养瓶(底面积500cm2)、T3180细胞培养瓶(底面积3180cm2),按照消化前的肉糜重量进行细胞接种，接种比例为0.01g/cm2～0.04g/cm2，优选的接种比例为0.02g/cm2。所述生长培养基按照体积百分比或者质量体积百分比包括以下成分：10%～15%狗血清（v/v），10～50 μg/ml亚硒酸钠（w/v），10～50 ng/ml HSP60蛋白（w/v），其余以DF-12培养基补足，优选的生长培养基为含有15%狗血清，20μg/ml亚硒酸钠，30ng/ml HSP60蛋白的DF-12培养基，将装有细胞的培养瓶放入37℃、 5%CO2细胞培养孵箱中进行培养，3～5天后更换生长培养基，并在显微镜下观察细胞的贴壁和生长情况，当细胞的融合程度达到80%～90%时进行细胞消化传代，消化液为重组胰酶，终浓度0.25%（w/v），传代比例为1：5～1：10；
（6）传代3次后，用终浓度0.25%的重组胰酶（w/v）消化并获得细胞进行检测，检测项目为形态观察，表型鉴定，细胞活率检测，分化鉴定，无菌，内毒素，支原体检测，合格标准：细胞形态为成纤维样长梭形贴壁细胞，表型为CD90>95%，CD73>95%，CD105>80%，CD45<2%，CD34<2%，CD11b<2%，活率>95%。分化鉴定为成脂、成骨、成软骨诱导分化为阳性；无菌阴性，内毒素<2EU，支原体阴性；合格后放入液氮中冻存备用，冻存保护剂为80% DF-12培养基，10%犬白蛋白，10%DMSO溶液（均为体积百分比）。
通过本发明的方法，通过分离、提取、扩增并保存，最终获得了犬胎盘间充质干细胞。
步骤2所述组织绞碎方式为电动绞肉器，绞肉器转速为2000～5000转/分钟；转动时长为1～3分钟，间隔30秒转动1次，一次转动10～30秒；优选的转速为3000转/分钟，优选的转动时长为2分钟；优选的一次转动20秒；将组织绞成肉糜，肉糜尺寸为0.5～2mm3。电动绞肉器效率要明显高于人工手动剪碎，尤其是处理多个组织时，优势尤其明显，既可以避免操作人员的手部肌肉劳损，又能避免不同操作人员之间的操作差异，将操作流程标准化，保证了每次分离的成功率。
所述消化液为重组胰蛋白酶、细胞解离液、粘多糖酶和焦磷酸钠的混合液，消化液的组成没有动物源或者细菌源成分，所述消化液按照体积百分比包括以下成分：30%的重组胰蛋白酶trypLE express，50%的细胞解离液StemProAccutase，15%～19.9%的粘多糖酶和0.1%～5%的焦磷酸钠，其中重组胰蛋白酶为商品化产品trypLEexpress、细胞解离液为商品化产品StemProAccutase，消化液体积和组织体积比为2:1～6:1，优选的体积比为4:1。消化液具有很好的分散和消化效果，经过消化后基本上看不到肉糜组织，充分彻底的消化步骤极大的提高了原代细胞的提取数量。
所述细胞接种的比例与肉糜重量直接相关，接种比例为0.01g/cm2～0.04g/cm2，优选的接种比例为0.02g/cm2。我们发现细胞接种的疏密程度极大的影响了细胞的贴壁生长和对营养物质的需要，过大的接种密度会降低原代细胞数量，过稀的接种密度会影响原代细胞的增殖。适合的接种密度才能保证细胞的正常贴壁和增殖。
所述生长培养基按照体积百分比或者质量体积百分比包括以下成分：10%～15%狗血清（v/v），10～50 μg/ml亚硒酸钠（w/v），10～50 ng/ml HSP60蛋白（w/v）的DF-12培养基，优选的生长培养基为15%狗血清，20 μg/ml亚硒酸钠，30 ng/ml HSP60蛋白的DF-12培养基。培养基中增补亚硒酸钠和HSP60蛋白有助于提高细胞的增殖速度，维持细胞的干性。
本发明的方法，所有与细胞接触的溶液都不含有异源或者细菌源成分，杜绝了病毒或细菌的引入，保证了后续细胞在临床应用中的安全性。
本发明的方法制得的犬胎盘间充质干细胞通过制备成不同形式的制剂可以应用于多种犬科疾病，适应症包括皮肤缺损、烧烫伤、脓皮病、骨关节炎、股骨头坏死、急性肾损伤、药物性肝损伤、结肠炎、再生障碍性贫血、角膜炎、结膜炎、干眼症、口炎等。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。
材料来源：
本发明实施例采用的重组胰蛋白酶trypLEexpress，细胞解离液StemProAccutase，DPBS溶液，DF-12培养基购自Gibco公司。
本发明实施例采用的HSP60蛋白购自Abcam公司。
本发明实施例采用的焦磷酸钠，亚硒酸钠购自Sigma公司。
本发明实施例采用的粘多糖酶购自南京生利德生物科技有限公司
此外，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：制备犬胎盘间充质干细胞
（1）采集新鲜的犬胎盘组织，将组织放入含有胎盘组织保存液（胎盘组织保存液成分为L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α 20µg/L, Primocin 10mg/L，丙酮酸钠 55 mg/L, 柠檬酸铁 18 mg/L, 硫酸锌 1.2 mg/L，其余用水补足）的无菌采集瓶中，采集瓶为1L容量，保存液体积为800ml，当同时有多胎时，一个胎盘单独放入一个采集瓶中，将密封好的采集瓶放入医用保温冷藏箱，低温运输至洁净车间，进行后续组织分离和细胞提取，组织在保存液种保存时间不长于120小时；
（2）用预冷的冲洗液（含有庆大霉素的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液为商品化的DPBS溶液，庆大霉素的终浓度是200IU）进行组织洗涤，冲洗去除残留血液和粪便，冲洗3～5次，每次使用200ml冲洗液，直至溶液清亮；使用消毒处理过的电动绞肉器进行组织绞碎，只消毒电动绞肉器的刀片和容器部分，消毒处理方法为湿热灭菌法或者环氧乙烷灭菌法（本例使用湿热灭菌法），使用时将电动绞肉器放入冷藏柜中，工作温度为2～8℃，绞肉器转速为3000转/分钟；转动时长为2分钟，间隔30秒转动1次，一次转动20秒；将组织绞成肉糜，肉糜尺寸为0.5～2mm3。
（3）将肉糜称重，该重量与接种比例直接相关，在肉糜中加入消化液进行消化，消化液成分为30%的重组胰蛋白酶trypLE express，50%的细胞解离液StemProAccutase，19.9%的粘多糖酶，0.1%的焦磷酸钠，消化液体积和组织体积比为4:1。将含有消化液的肉糜置于恒温磁力搅拌器上消化40分钟，转速为100 转/分钟，温度为37℃；消化结束后加入4倍体积（的冲洗液进行吹打混匀；
（4）将消化后的溶液通过100目无菌不锈钢筛网，收集过滤后的溶液进行离心，离心速度是400g，时长10分钟，弃去上清后得到原代细胞；
（5）将细胞放入培养容器中，加入生长培养基进行细胞培养；使用T75细胞培养瓶，按照消化前的肉糜重量进行细胞接种，接种比例为0.02g/cm2。生长培养基为含有15%狗血清（v/v），20μg/ml亚硒酸钠（w/v），30ng/ml HSP60蛋白（w/v）的DF-12培养基，将装有细胞的培养瓶放入37℃、 5%CO2细胞培养孵箱中进行培养，3～5天后更换生长培养基（本例的时长是5天），并在显微镜下观察细胞的贴壁和生长情况，当细胞的融合程度达到80～90%时进行细胞消化传代（本例的融合度是90%），消化液为重组胰酶，终浓度0.25%（w/v），传代比例为1：8；
（6）传代3次后，用终浓度0.25%（w/v）的重组胰酶消化并获得细胞进行检测，检测项目为形态观察，表型鉴定，细胞活率检测，分化鉴定，无菌，内毒素，支原体检测，合格标准：细胞形态为成纤维样长梭形贴壁细胞，表型为CD90>95%，CD73>95%，CD105>80%，CD45<2%，CD34<2%，CD11b<2%，活率>95%。分化鉴定为成脂、成骨、成软骨诱导分化为阳性；无菌阴性，内毒素<2EU，支原体阴性；合格后放入液氮中冻存备用，冻存保护剂为80% DF-12培养基，10%犬白蛋白，10%DMSO溶液（上述百分比为体积百分比）。
经过3次平行实验，每1g胎盘组织的P1代细胞的得率范围是（0.4～1）×108个细胞。冻存前细胞是P3代，总细胞的得率范围是（3.6～6.3 ）×1010个细胞。3次的检测结果为：细胞形态均合格，细胞活率为97.6%～98.7%，细胞表型鉴定合格，具体表达量为CD90（99.2%～99.6%），CD73（98.3%～99.1%），CD105（85.3%～89.4%），CD45（0.15%～0.3%），CD34（0.11%～0.34%），CD11b（0.41%～0.66%），无菌阴性，内毒素<2EU，支原体阴性；分化鉴定合格，具体结果为成脂、成骨、成软骨诱导分化阳性，结果表明细胞具有很强的多向分化能力（图1是实施例1的方法获得的P1代细胞形态；图2是实施例1的方法获得的P3代细胞形态）。
实施例2：制备犬胎盘间充质干细胞
（1）采集新鲜的犬胎盘组织，将组织放入含有胎盘组织保存液（胎盘组织保存液成分为L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α 20µg/L, Primocin 10mg/L，丙酮酸钠 55 mg/L, 柠檬酸铁 18 mg/L, 硫酸锌 1.2 mg/L，其余用水补足）的无菌采集瓶中，采集瓶为1L容量，保存液体积为800ml，当同时有多胎时，一个胎盘单独放入一个采集瓶中，将密封好的采集瓶放入医用保温冷藏箱，低温运输至洁净车间，进行后续组织分离和细胞提取，组织在保存液种保存时间不长于120小时；
（2）用预冷的冲洗液（含有庆大霉素的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液为商品化的DPBS溶液，庆大霉素的终浓度是200IU）进行组织洗涤，冲洗去除残留血液和粪便，冲洗3～5次，每次使用200ml冲洗液，直至溶液清亮；使用消毒处理过的电动绞肉器进行组织绞碎，只消毒电动绞肉器的刀片和容器部分，消毒处理方法为湿热灭菌法或者环氧乙烷灭菌法（本例使用湿热灭菌法），使用时将电动绞肉器放入冷藏柜中，工作温度为2～8℃，绞肉器转速为3000转/分钟；转动时长为2分钟，间隔30秒转动1次，一次转动20秒；将组织绞成肉糜，肉糜尺寸为0.5～2mm3。
（3）将肉糜称重，该重量与接种比例直接相关，在肉糜中加入消化液进行消化，消化液成分为37.5%的重组胰蛋白酶trypLE express，62.5%的细胞解离液StemProAccutase，上述均为体积百分比；消化液体积和组织体积比为4:1。将含有消化液的肉糜置于恒温磁力搅拌器上消化40分钟，转速为100 转/分钟，温度为37℃；消化结束后加入3倍体积的冲洗液进行吹打混匀；
（4）将消化后的溶液通过100目无菌不锈钢筛网，收集过滤后的溶液进行离心，离心速度是400g，时长10分钟，弃去上清后得到原代细胞；
（5）将细胞放入培养容器中，加入生长培养基进行细胞培养；培养容器为T75细胞培养瓶(底面积75cm2)，按照消化前的肉糜重量进行细胞接种，接种比例为0.02g/cm2。生长培养基是含有15%狗血清（v/v）的DF-12培养基，将装有细胞的培养瓶放入37℃、 5%CO2细胞培养孵箱中进行培养，5天后更换生长培养基，并在显微镜下观察细胞的贴壁和生长情况，当细胞的融合程度达到90%时进行细胞消化传代，消化液为重组胰酶，终浓度0.25%（w/v），传代比例为1：6；
（6）传代3次后，用终浓度0.25%（w/v）的重组胰酶消化并获得细胞，然后进行检测，检测项目为形态观察，表型鉴定，细胞活率检测，分化鉴定，无菌，内毒素，支原体检测，合格标准：细胞形态为成纤维样长梭形贴壁细胞，表型为CD90>95%，CD73>95%，CD105>80%，CD45<2%，CD34<2%，CD11b<2%，活率>95%。分化鉴定为成脂、成骨、成软骨诱导分化为阳性；无菌阴性，内毒素<2EU，支原体阴性；合格后放入液氮中冻存备用，冻存保护剂为80% DF-12培养基，10%犬白蛋白，10%DMSO溶液（上述百分比均为体积百分比）。
经过3次平行实验，每1g胎盘组织的P1代细胞的得率范围是（1.1～3）×106个细胞。冻存前细胞是P3代，总的细胞的得率范围是（2.3～4.8）×108个细胞。3次的检测结果为：细胞形态均合格，细胞活率95.3%～97.2%，细胞表型鉴定合格，具体表达量为CD90（99.1%～99.7%），CD73（97.4%～98.7%），CD105（86.9%～89.9%），CD45（0.36%～0.55%），CD34（0.21%～0.51%），CD11b（0.54%～0.86%），无菌阴性，内毒素<2EU，支原体阴性；分化鉴定合格，结果为成脂、成骨、成软骨诱导分化阳性，结果表明细胞具有很强的多向分化能力。
结果表明消化液中额外增加粘多糖酶和焦磷酸钠后，每g胎盘组织的P1代细胞的得率有了极大的提高，平均提高了37.5倍，图3为实施例1和2的方法获得的P1代细胞数量。生长培养基中额外增加亚硒酸钠和HSP60蛋白后，P3代细胞的得率得到了很大的提高，三次传代后的平均扩增倍数由53倍提高到了150倍，通过这两级的优化后，最终冻存的细胞数量提高了2个数量级，图4为实施例1和2的方法获得的P3代细胞数量。
实施例3：分离提取原代犬胎盘间充质干细胞
根据CN201710025892.4的提取方法进行原代犬胎盘间充质干细胞的分离，每1g胎盘组织的P1代细胞的得率范围是（7～9）×105个细胞。根据CN107746829A的提取方法进行原代犬胎盘间充质干细胞的分离，每1g胎盘组织的P1代细胞的得率范围是（3～5）×105个细胞。本发明方法得到的P1代的细胞数量远高于现有方法，且细胞从分离到P1代长满需要时间较长，需要12～18天。而使用本发明方法，细胞从分离到P1代长满需要时长为7～10天。分析原因是因为本发明方法的消化效率高，起始的细胞数量多，进而缩短了细胞的长满时间。
实施例4：犬胎盘间充质干细胞制剂的应用
从液氮中取出犬胎盘间充质干细胞，复苏后接种到适宜的细胞培养瓶（本例中使用T75培养瓶），加入生长培养基，生长培养基为含有15%狗血清（v/v），10μg/ml亚硒酸钠（w/v），20ng/ml HSP60蛋白（w/v）的DF-12培养基，待细胞融合度达到90%时，用终浓度0.25%（w/v）的重组胰酶消化细胞，用DPBS清洗细胞，并调整细胞浓度为（0.5～2）×106/ml（本例细胞浓度为1×106/ml），将细胞悬液装入一次性无菌输血袋中密封，即为犬胎盘间充质干细胞静脉注射液制剂。将犬胎盘间充质干细胞静脉注射液制剂冷链运送至动物医院实施干细胞治疗。本例为犬胎盘间充质干细胞静脉注射液制剂治疗犬脓皮症，患犬患病数月，趾间、胸腹、背部多处破溃，有脓性分泌物，镜检有大量炎性细胞核胞内球菌，常规治疗缓解不明显；行干犬胎盘间充质干细胞静脉注射2次，间隔1个月，治疗后观察皮肤整体症状减轻，破溃面积显著缩小，后康复出院，随访显示病情稳定未复发。脓皮症与免疫系统障碍或者异常有关，通过干细胞治疗，纠正了原有的免疫功能紊乱，使脓皮症得到了缓解。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (4)

1.一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集新鲜的犬胎盘组织，用胎盘组织保存液进行保存，低温运输至洁净车间；
(2)用预冷的含有庆大霉素的磷酸缓冲液作为冲洗液进行组织洗涤，冲洗去除残留血液和粪便，直至溶液清亮，使用消毒处理过的电动绞肉器进行组织绞碎，绞成0.5～2mm3的肉糜；
(3)将肉糜称重，加入消化液进行消化，消化液体积和组织体积为2:1～6:1，将含有消化液的肉糜置于恒温磁力搅拌器上消化20～60分钟，转速为80～150转/分钟，温度为37℃，消化结束后加入1～5倍体积的含有庆大霉素的磷酸缓冲液进行吹打混匀；所述消化液按照体积百分比包括以下成分：30％的重组胰蛋白酶，50％的细胞解离液，15％～19.9％的粘多糖酶和0.1％～5％的焦磷酸钠；
(4)将消化后的溶液通过100目筛网，收集过滤后的溶液进行离心，离心速度是400g，时长5～10分钟，弃去上清后得到原代细胞；
(5)将原代细胞放入培养容器中，加入生长培养基进行细胞培养传代；按照消化前的肉糜重量进行细胞接种，接种比例为0.01g/cm2～0.04g/cm2，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，3～5天后更换生长培养基，当细胞的融合程度达到80％～90％时进行细胞消化传代，消化液为重组胰酶，消化液质量体积比终浓度0.25％，传代比例为1：5～1：10；所述生长培养基成分：体积百分比10％～15％狗血清，10～50μg/ml亚硒酸钠，10～50ng/ml HSP60蛋白，其余为DF-12培养基；
(6)传代3次后，消化并获得细胞进行检测，检测项目为细胞形态观察、表型鉴定、分化鉴定，无菌检测，内毒素检测，支原体检测，合格后进行细胞冻存备用。
2.根据权利要求1所述犬胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胎盘组织在保存液种保存时间不长于120小时。
3.根据权利要求1所述犬胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述磷酸缓冲液为商品化的DPBS溶液，庆大霉素的终浓度是200IU；冲洗3～5次，每次使用100～400ml冲洗液。
4.根据权利要求1所述犬胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述电动绞肉器转速为2000～5000转/分钟；转动时长为1～3分钟，间隔30秒转动1次，一次转动10～30秒，工作温度为2～8℃。
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