CN107372469A - 一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法。该内皮祖细胞的冻存液由DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A和人血白蛋白注射液组成。本发明内皮祖细胞冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明内皮祖细胞冻存液能很好保持内皮祖细胞的活性。实验表明采用本发明冻存液冻存内皮祖细胞，明显提高了内皮祖细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态，并保持良好的干细胞特性。

Description

一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术
血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞，又称血管母细胞或血管内皮干细胞，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞和HUVEC相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的ECs。1997年，Asahara等首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究。目前，内皮祖细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来，并且内皮祖细胞的功能应用研究也取得一定成果，为临床应用奠定了基础。骨髓中含有丰富细胞，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等，骨髓中的血管内皮祖细胞(Endothelial progenitorcells，EPCs)可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞，促进局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于治疗缺血性疾病，并取得了良好的治疗效果，具有再生和分化能力的EPCs已逐渐成为治疗血管系统疾病的理想细胞材料。因此EPCs已成为近年来生命科学研究的热点。
细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathylsulfoxide，DMSO)和胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，DMSO是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前DMSO常规使用浓度为1％-5％。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。
公开号为CN103583511A发明专利使用了复方氨基酸注射液以及勃脉力A，此方法用于其它间充质干细胞的冻存有比较好的效果，但用于骨髓内皮祖中时，过高的营养成分易使EPCs细胞分化为内皮细胞，不能保持稳定的增殖。目前的内皮祖细胞冻存保护液，要么成分复杂，配制麻烦，要么冻存效果不理想，因此，需要提供一种配制简单、冻存效果好的血管内皮祖细胞的冻存液及冻存方式。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法。该冻存液能很好保持内皮祖细胞的活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种内皮祖细胞的冻存液，由DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A和人血白蛋白注射液组成。
作为优选，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为(8～12)：(15～25)：(15～25)：(40～60)。
优选地，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为(8～12)：(15～25)：(15～25)：(48～52)。
更优选地，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为10:20:20:50。
在本发明提供的一些实施例中，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为8:25:15:52。
在本发明提供的另一些实施例中，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为12:15:25:48。
在本发明提供的一些实施例中，人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
本发明还提供了一种内皮祖细胞的冻存方法，包括：将内皮祖细胞冻存于本发明提供的冻存液中。
作为优选，内皮祖细胞的冻存密度为(1～5)×106cells/mL。
优选地，内皮祖细胞的冻存密度为3×106cells/mL。
作为优选，冻存的程序为：将含有内皮祖细胞的冻存液置于程序降温盒中，-80℃条件下冻存2～3天，然后转移至液氮中保存。
作为优选，在冻存之前，程序降温盒为4℃预冷的程序降温盒，冻存液为4℃预冷的冻存液。
本发明提供了一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法。该内皮祖细胞的冻存液由DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A和人血白蛋白注射液组成。本发明具有的技术效果为：
1、本发明内皮祖细胞冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。
2、本发明内皮祖细胞冻存液能很好保持内皮祖细胞的活性。实验表明采用本发明冻存液冻存内皮祖细胞，明显提高了内皮祖细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态，并保持良好的干细胞特性。
具体实施方式
本发明公开了一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
EPCs：血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells)；
DMSO：二甲基亚砜(dimathylsulfoxide)；
FBS：胎牛血清(fetalbovine serum)。
以下实施例的冻存液中，所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量浓度为20％。即25mL人血白蛋白注射液中含5g白蛋白。
本发明所用程序降温盒是一个隔层中装有异丙醇的塑料盒，冻存的细胞直接放入盒内，然后细胞即可直接放入-80℃超低温冰箱保存。程序降温盒中的异丙醇在-80℃超低温冰箱里是每10分钟下降1℃，可以很好的保护冻存细胞不会因为温度剧变而受到损害。
优选的，程序降温盒需预先恢复室温。而冻存的细胞放入程序降温盒内后优选在10min中内转入-80℃超低温冰箱。本发明技术人员可以理解，冻存过程中，程序降温盒需提前放入4℃预冷，本发明所述优选冻存液现配完成，同时放入4℃预冷。细胞收集完成后用冻存液重悬，分装到冻存管冻存。本领域技术人员可知，本发明所述骨髓内皮祖细胞可以由骨髓组织分离得到。
本发明提供的内皮祖细胞的冻存液及冻存方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
细胞冻存前，配制冻存保护液，将20％葡萄糖注射液、20％勃脉力A及50％人血白蛋白注射液混合，再加入10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
实施例2
细胞冻存前，配制冻存保护液，将20％葡萄糖注射液、20％勃脉力A及50％人血白蛋白注射液混合，再加入10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为5×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
实施例3
细胞冻存前，配制冻存保护液，将25％葡萄糖注射液、15％勃脉力A及52％人血白蛋白注射液混合，再加入8％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
实施例4
细胞冻存前，配制冻存保护液，将15％葡萄糖注射液、25％勃脉力A及48％人血白蛋白注射液混合，再加入12％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
对比例1
细胞冻存前，配制冻存保护液：90％FBS+10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
对比例2
细胞冻存前，配制冻存保护液：20％右旋糖酐40+20％勃脉力A+50％FBS+10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
对比例3
细胞冻存前，配制冻存保护液：20％复方氨基酸注射液+20％勃脉力A+50％人血白蛋白注射液+10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
对比例4
细胞冻存前，配制冻存保护液(参考CN102792947A)：15％复方氨基酸注射液+50％勃脉力A+25％人血白蛋白注射液+10％DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。配方中百分比均为体积百分比。
取汇合度80％的P3代的内皮祖细胞，用PBS洗1遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化1min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，400g离心5min，去上清，加入冻存保护液至细胞密度为3×106cell/mL，轻轻吹打均匀。置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中2天，转移至液氮中。
试验例1复苏试验
将实施例1-4和对比例1-4冻存的细胞半年后取出复苏，复苏的方法为：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度2×105/mL，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。
各组冻存液的配方如下：
表1实施例1-4的冻存液配方
表2对比例1-4的冻存液配方
复苏后计算细胞回收率、细胞活率及7天后的细胞数：
①细胞回收率＝复苏后细胞数/冻存时候细胞数*100％
②细胞活率，细胞复苏后取样，用0.4％台盼蓝1：1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数，及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数*100％
③细胞增殖情况，把复苏后的细胞，按10000个细胞每孔接种于12孔板中，连续培养，每天取样计数，作三个重复，观察细胞的增殖情况。
试验结果如下：
表3复苏试验结果
组别 细胞回收率 细胞活率 7天后细胞数
实施例1组 95.74％ 97.96％ 1.32×106
实施例2组 94.32％ 95.64％ 1.41×106
实施例3组 96.52％ 96.99％ 1.47×106
实施例4组 96.66％ 95.22％ 1.3×106
对比例1组 87.25％ 93.78％ 9.2×105
对比例2组 89.71％ 95.03％ 1.1×106
对比例3组 88.24％ 92.42％ 8.4×105
对比例4组 76.45％ 83.65％ 6.1×105
由上述试验结果可知，虽然几组的细胞活率没有明显差异，但细胞回收率，实施例组高于对比例组；且在培养7天后得到的细胞数量上，实施例组明显高于对比例组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种内皮祖细胞的冻存液，其特征在于，由DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A和人血白蛋白注射液组成。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为(8～12)：(15～25)：(15～25)：(40～60)。
3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为(8～12)：(15～25)：(15～25)：(48～52)。
4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，DMSO、葡萄糖注射液、勃脉力A与人血白蛋白注射液的体积比为10:20:20:50。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量体积百分浓度为20％。
6.一种内皮祖细胞的冻存方法，其特征在于，将内皮祖细胞冻存于权利要求1至5中任一项所述的冻存液中。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述内皮祖细胞的冻存密度为(1～5)×106cells/mL。
8.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述内皮祖细胞的冻存密度为3×106cells/mL。
9.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的程序为：将含有内皮祖细胞的冻存液置于程序降温盒中，-80℃条件下冻存2～3天，然后转移至液氮中保存。
10.根据权利要求9所述的冻存方法，其特征在于，在冻存之前，所述程序降温盒为4℃预冷的程序降温盒，所述冻存液为4℃预冷的冻存液。
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