CN110959606A - 一种免疫效应细胞冻存液及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种免疫效应细胞冻存液及其用途。具体地，本发明提一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括人血白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐、葡萄糖、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和水。本发明还提供所述细胞冻存液的用途，用于制备免疫效应细胞悬液中的应用。本发明细胞冻存液具有提高免疫效应细胞活率和增殖水平的优势，具有优异的的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种免疫效应细胞冻存液及其用途。
背景技术
近年来，免疫疗法作为一种新的癌症治疗方式引起研究者的广泛关注。在新近开发的癌症免疫治疗技术中，嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)技术备受青睐。从1989年第一代CAR-T开发至今，基于CAR-T的癌症免疫治疗取得了重大进展。数十项CAR-T临床试验正在全球范围内进行。
CAR-T疗法是利用白细胞分离术收集患者的T细胞，然后在体外进行T细胞活化、转导含有CAR的病毒载体、CAR-T细胞的扩增及回输患者体内。CAR是由抗体衍生的片段组成，可识别、结合并促进T细胞扩增的共刺激分子偶联肿瘤抗原。
Kymriah于2017年8月获得FDA批准，用于治疗复发或难治性(R/R)B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻成人(25岁以下)患者。基于单臂II期临床阶段(ELIANA)试验的结果，Kymriah在FDA以优先审查中接受生物制剂许可申请(BLA)后不到6个月，就获得了批准。注射后3个月内，83％的患者实现完全缓解(CR)或不完全血液计数恢复(CRi)的CR。如今，FDA已授予Kymriah治疗复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)成人患者上市申请优先审评资格，EMA也决定加速评估Kymriah的适应症：儿童、青年和成人的r/r B细胞ALL和不适合自体干细胞移植的r/r DLBCL。此外，该药物还将进行滤泡淋巴瘤(FL)，二线治疗DLBCL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤(MM)等适应症的评估。
第二款CAR-T细胞疗法Yescarta于2017年10月获得FDA批准，比预期审核日期提前1个月。该疗法用于治疗对前期至少两种其他治疗反应效果差或治疗后复发的大B细胞淋巴瘤(包括DLBCL和其他侵袭性NHL亚型)的成年人，并且正在欧洲接受此类适应症的审查。FDA批准Yescarta基于单臂阶段II(ZUMA-1)试验。在最新的分析中，总缓解率(ORR)为82％，其中CR率为58％。Yescarta在成人复发或难B细胞ALL中显示了积极的早期数据。套细胞淋巴瘤(MCL)、惰性淋巴瘤亚型、滤泡淋巴瘤(FL)等多个关键临床试验正在进行中。
作为CAR-T新药，细胞以制剂的形式进行回输，细胞冷冻保存液就尤其重要、常规细胞多采用血清配方进行冻存，使用血清主要由以下原因：一、血清能为体外培养的细胞提供增值所必须的生长因子和特定细胞所需的贴壁因子。二、血清中含有丰富的细胞生长所必须的营养成分，支持细胞生长。三、血清中的白蛋白在细胞冻存过程中起到保护细胞的作用。但是对于血液细胞，尤其是用于细胞过继治疗的CART细胞，血清冻存存在的缺陷不容忽视：首先，血清中含有的抗体，补体，容易造成血细胞非特异性分化增值。另外，有研究表明血清中所含多胺氧化酶(Polyamine oxidase)，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应，形成有细胞毒性的聚精胺。细胞复苏后回输患者会存在潜在的不良反应。最后，对于用于细胞治疗的血液细胞来说，冻存所用血清产地，批号不同，每批血清质量差异大，使速冻存细胞不能保证质量的稳定性，不利于临床治疗中的批量使用。
近年来，人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)被证实能够在细胞冻存中能达到和血清同样效果的冻存保护性，已有研究证实其在细胞冻存剂中的可行性。目前以广泛应用于多种干细胞的冻存保护剂中。使用HSA对人CART细胞进行冻存，应很好的保存细胞的CART阳性率，并且使被冻存细胞不受其他毒性因子的影响。但用现有的血清冻存液或者高浓度DMSO冻存的CART细胞复苏操作中往往需要离心洗涤,以去除血清或DMSO的存在对身体的副作用。用现有的无血清冻存液冻存的CAR-T细胞复苏操作中除了需要离心洗涤外，复苏培养的细胞往往活率较低，增殖较慢，成为CAR-T细胞成为治疗药物的限制性因素之一。
综上所述，本领域尚缺乏一种质量统一，适合临床使用、能够提高免疫效应细胞活率和增殖水平以及副作用小的细胞冻存液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种质量统一，适合临床使用、能够提高免疫效应细胞活率和增殖水平以及副作用小的细胞冻存液。
本发明的第一方面，提供一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在另一优选例中，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在另一优选例中，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在另一优选例中，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在另一优选例中，所述的氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的重量比为(4.5-5.5)：(4.5-5.5)：(3.2-4.2)：(0.32-0.42)：(0.26-0.34)。
在另一优选例中，所述的人白蛋白和二甲基亚砜的比为(45-65mg)：(0.05-0.075ml)，较佳地(37.5-45mg)：(0.05-0.055ml)。
在另一优选例中，所述的人白蛋白与二甲基亚砜的重量比为400-1000：1，较佳地680-900：1。
在另一优选例中，所述的人白蛋白与右旋糖酐的重量比为3-12：1，较佳地4-10：1，更佳地5.5-7.5:1。
在另一优选例中，所述的右旋糖酐与葡萄糖的重量比为0.8-1.6，优选为1.0-1.5。
在另一优选例中，所述的葡萄糖与氯化钠的重量比为0.5-6：1，较佳地0.6-5：1。
在另一优选例中，所述的水为纯化水或注射用水。
在另一优选例中，所述的人白蛋白选自下组：血浆提取人白蛋白、基因重组人白蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述的右旋糖酐选自下组：右旋糖酐-40、右旋糖酐-70，或其组合。
在另一优选例中，所述的细胞冻存液还包括维生素。
在另一优选例中，所述的维生素选自下组：维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、或其组合。
在另一优选例中，所述维生素的浓度为1-20mg/ml，较佳地1-15mg/ml、更佳地5-10mg/ml。
本发明的第二方面，提供一种制备如本发明第一方面所述的细胞冻存液的方法，所述的方法包括步骤：
将如本发明第一方面所述的组分进行混合，得到所述细胞冻存液。
本发明的第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的细胞冻存液的用途，用于制备免疫效应细胞悬液。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞为选自下组：CAR-T细胞、CIK细胞、NK细胞、TCR-T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，或其组合。
在另一优选例中，所述的免效应细胞为CAR-T细胞。
本发明的第四方面，提供一种细胞混合物，所述细胞混合物包括以下组分：
细胞，和
如本发明第一方面所述的细胞冻存液。
在另一优选例中，所述的细胞为免疫效应细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：Car-T细胞、CIK细胞、NK细胞、TCR-T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
本发明的第五方面，提供一种细胞的冻存方法，包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如本发明第一方面所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞混合物；
(ii)将步骤(i)得到的细胞混合物降温后，低温保存。
在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，降温后，于液氮中低温保存。
本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒用于细胞冻存，所述的试剂盒中包括如本发明第一方面所述的细胞冻存液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A-1D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ1冻存的CAR-T1细胞在经过包括有离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞增殖水平曲线。图1A、1B、1C和1D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时再进行培养的细胞增殖曲线。
图2A-2D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ1冻存的CAR-T1细胞在经过不包括离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞增殖水平曲线。图2A、2B、2C和2D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时的细胞增殖曲线。
图3A-3D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ1冻存的CAR-T1细胞在经过包括有离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞阳性率曲线。图3A、3B、3C和3D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时再进行培养的细胞阳性率曲线。
图4A-4D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ1冻存的CAR-T1细胞在经过不包括离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞阳性率曲线。图4A、4B、4C和4D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时的细胞阳性率曲线。
图5A-5D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ2冻存的CAR-T2细胞在经过包括有离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞增殖水平曲线。图5A、5B、5C和5D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时再进行培养的细胞增殖曲线。
图6A-6D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ2冻存的CAR-T2细胞在经过不包括离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞增殖水平曲线。图6A、6B、6C和6D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时的细胞增殖曲线。
图7A-7D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ2冻存的CAR-T2细胞在经过包括有离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞阳性率曲线。图7A、7B、7C和7D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时再进行培养的细胞阳性率曲线。
图8A-8D为冻存液标准、冻存液CNKym和冻存液CB BZ2冻存的CAR-T2细胞在经过不包括离心洗涤步骤的解冻后室温放置0小时-3小时后再进行培养的细胞阳性率曲线。图8A、8B、8C和8D分别代表解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时的细胞阳性率曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现采用含有人白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐和电解质的细胞冻存液保持细胞如免疫效应细胞(Car-T细胞)，经过长时间保存，复苏后，细胞仍具有良好的存活率、增殖能力，对细胞阳性率没有影响，且复苏后可不进行离心洗涤直接回输。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用“CAR-T细胞”，即为嵌合抗原受体T细胞，是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。
如本文所用“细胞冻存”是生物学保存物种的重要手段。如果在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，严重时引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞，贮存在低温下能减少冰晶的形成。
细胞冻存中最重要的部分是细胞冻存液。传统的细胞冻存液含有动物血清，主要为胎牛血清和/或小牛血清。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种极其复杂的混合物，其一部分组成成份尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、无机物等。
如本发明所用，“细胞复苏”一词是指休眠的细胞重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将冷冻管迅速由液氮转入到温水浴中，较佳地37℃-40℃，不定时搅拌加速解冻；细胞完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后清洗细胞并重悬，转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；检查细胞存活率及活力。
如本文所用，术语“冻存液标准”和“标准冻存液”可相互替换使用；术语“冻存液CNKym”和“CNKym冻存液”可相互替换使用；术语“冻存液CB BZ1”和“CB BZ1冻存液”可相互替换使用；术语“冻存液CB BZ2”和“CB BZ2冻存液”可相互替换使用；术语“冻存液CB BZ3”和“CB BZ3冻存液”可相互替换使用；术语“冻存液CB BZ4”和“CB BZ4冻存液”可相互替换使用。
细胞冻存液
本发明人意外发现，添加了人白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐和电解质制成细胞冻存液，可以长时间冻存细胞，并且可以维持细胞在复苏后仍具有良好的存活率、增殖能力，对细胞阳性率没有影响，且复苏后直接回输，无需进行离心洗涤。
典型地，本发明的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在本发明所述的细胞冻存液中，水可以为纯化水或注射用水。细胞冻存液中的人白蛋白包括(但不限于)：血浆提取人白蛋白、基因重组人白蛋白、或其组合。
本发明中，右旋糖酐又称为葡聚糖，英文名为Dextran，右旋糖酐的具体型号可以为右旋糖酐-40(又称为右旋糖酐-40、Dextran-40)、右旋糖酐-70(又称为右旋糖酐-70、Dextran-70)。优选地，所述的右旋糖酐为右旋糖酐-40。
本发明所述的细胞冻存液还可以包括维生素。添加维生素的细胞冻存液能够进一步提高细胞复苏后的存活率、增殖能力。优选地，所述的维生素包括(但不限于)：维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、或其组合。更优选地，所述的维生素为维生素C。优选地，所述维生素在细胞冻存液中的浓度为1-20mg/ml，较佳地1-15mg/ml、更佳地5-10mg/ml。
在本发明所述的细胞冻存液中，二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，细胞在冻存时，冷冻保护剂替换出细胞内的水，防止在冻存过程中水形成冰晶损害细胞器。
在一个优选方式中，所述的细胞冻存液包括以下体积百分含量和浓度的组分：
优选地，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
更优选地，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
在另一优选例中，所述的氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的重量比为(4.5-5.5)：(4.5-5.5)：(3.2-4.2)：(0.32-0.42)：(0.26-0.34)。
在另一优选例中，所述的人白蛋白和二甲基亚砜的比为(45-65mg)：(0.05-0.075ml)，较佳地(37.5-45mg)：(0.05-0.055ml)。
在另一优选例中，所述的人白蛋白与二甲基亚砜的重量比为400-1000：1，较佳地680-900：1。
在另一优选例中，所述的人白蛋白与右旋糖酐的重量比为3-12：1，较佳地4-10：1，，更佳地5.5-7.5:1。
在另一优选例中，所述的右旋糖酐与葡萄糖的重量比为0.8-1.6，优选为1.0-1.5。
在另一优选例中，所述的葡萄糖与氯化钠的重量比为0.5-6：1，较佳地0.6-5：1。
在另一优选例中，所述的水为纯化水或注射用水。
本发明的细胞冻存液，可以用于：
(a)保存细胞；
(b)建立细胞库；或
(c)保持细胞的活力。
制备方法
本发明的细胞冻存液的制备方法包括步骤；将细胞冻存液的各组分进行混合，得到所述细胞冻存液。
细胞混合物
本发明的细胞混合物，包括以下组分：
细胞，和
本发明所述的细胞冻存液；
在细胞混合物中，所述的细胞并没有特别的限定，只要能够达到细胞冻存和复苏的要求即可。优选地，所述的细胞为免疫效应细胞。更优选地，所述的细胞包括(但不限于)选自下组的一种或多种：CAR-T细胞、CIK细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。优选为
所述细胞混合物中，对细胞冻存液进一步限定如上所述。
冻存方法
本发明的细胞的冻存方法，包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如本发明所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞混合物；
(ii)将步骤(i)得到的细胞混合物降温后，低温保存。
优选地，所述的步骤(ii)中，降温后，于液氮中低温保存。
用途
本发明还提供一种细胞冻存液的用途，用于制备免疫效应细胞悬液中的应用。
优选地，所述的免疫效应细胞为CAR-T细胞、CIK细胞、NK细胞、TCR-T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在一个优选方式中，制备免疫效应细胞悬液的方法包括步骤：
将所述的免疫效应细胞用上述所述的细胞冻存液进行重悬，得到细胞悬液。
本发明的主要优点包括：
1、本发明所述的细胞冻存液可以长时间冻存细胞，复苏后的细胞仍具有较高的活率和较高的增殖水平，对复苏后的细胞阳性率没有影响，且细胞复苏后可直回输。
2、现有细胞冻存液冻存的细胞常规复苏方式为离心洗涤，在离心过程中细胞会有损失，损失为10-30％不等，且冻存过的细胞比较脆弱，离心后会影响细胞的活率。本发明所述的细胞冻存液冻存的细胞在复苏过程中可以无需进行离心洗涤，明显地减少对细胞的损伤。
3、本发明的细胞冻存液与现有的细胞冻存液相比，人血白蛋白和DMSO组分的含量更低，人血白蛋白作为生物大分子蛋白质，具有生物免疫原性、刺激性和过敏性等缺陷，DMSO作为一种有机溶剂，对人体的安全性低，在本发明的细胞冻存液中，人血白蛋白和DMSO含量降低能够明显提高细胞回输对人体的安全性和生物相容性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
含离心洗涤步骤的冻存细胞复苏操作：
1.将生物安全柜进行常规消毒，紫外照射30min以上，超净台开启通风10min。
2.将新鲜培养基置于37℃恒温水浴锅中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭，移入无菌操作台内。
3.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化，以70％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
4.打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
5、离心，1500rpm，5min；
6.弃去上清液，加入培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，放CO2培养箱中培养。
不含离心洗涤步骤的冻存细胞复苏操作：
1.将生物安全柜进行常规消毒，紫外照射30min以上，超净台开启通风10min。
2.将新鲜培养基置于37℃恒温水浴锅中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭，移入无菌操作台内。
3.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化，以70％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
4.打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，直接加入到已加入培养液的培养瓶中混匀；37℃CO2培养箱中培养。
CAR-T细胞阳性率的检测方法：
1、将细胞悬液离心，室温1500rpm 5min，弃上清。
2、加入PBS洗涤，室温1500rpm 5min，弃上清。
3、将细胞沉淀加入PBS重悬，100μl/管，1管为空白对照，1管加入CD3。
1、抗体2μl，CD19-biotin一抗1μl，4℃冰箱避光孵育30min。
4、加入PBS洗涤，室温1500rpm 5min，弃上清，洗2遍。
5、加入PE-anti-human streptavidin二抗，震荡混匀，4℃冰箱避光孵育30min。
6、加入PBS洗涤，室温1500rpm 5min，弃上清。
7、加入300μlPBS溶液重悬细胞，等待流式细胞仪检测。
实施例1 CAR-T细胞的制备
取1号与2号供体受试者的血样(1号与2号供体受试者均为健康成年人)，经FICOL分离获得PBMC细胞，贴壁处理后进行电转，培养至所需细胞量。具体步骤根据Antitumoractivity of EGFR-specific CART cells against non-small-cell lung cancer cellsin vitro and in mice，Li et al.Cell Death and Disease(2018)9:177一文所公开的制备方法进行。通过来自1号病人与2号供体受试者血样制得的CAR-T细胞分别被命名为CAR-T1和CAR-T2。
实施例2 免疫效应细胞冻存液的配制与细胞冻存
免疫效应细胞冻存液的配制
按照如表1所示细胞冻存液配方的比例将各成分混匀，重悬实施例1制得的CAR-T1和CAR-T2细胞，重悬后的细胞密度为5x107/ml。对照冻存液标准为本领域常规使用的含血清冻存液，对照冻存液CNKym为已知的诺华上市产品Kymriah所使用的冻存液，冻存液CBBZ1、CB BZ2、CB BZ3和CB BZ4分别为本发明所使用的冻存液。其中冻存液标准和冻存液CNKym重悬CAR-T1和CAR-T2细胞，CB BZ1和CB BZ3分别重悬CAR-T1细胞，CB BZ2和CB BZ4冻存液分别重悬CAR-T2细胞。
表1 细胞冻存液配方
其中，在表1中：
勃脉力A是一种复方电解质注射液，其化学成分为：每1000毫升注射用水中含氯化钠5.26克，葡萄糖酸钠5.02克，醋酸钠3.68克，氯化钾0.37克，氯化镁0.30克。
6％右旋糖酐40葡萄糖注射液的组分为每100mL注射用水中含右旋糖酐-40(Dextran-40)6g和葡萄糖5g。
25％人血白蛋白的介质为水。
细胞冻存
重悬CAR-T细胞的各组冻存液按照以下步骤降温后，立即转移至液氮罐中保存：
步骤1：降温至4℃等待
步骤2：样品温度以1.0℃/m速度降温至-4℃
步骤3：箱体温度以20.0℃/m速度降温至-45℃
步骤4：箱体温度以10.0℃/m速度升温至-10℃
步骤5：箱体温度以0.5℃/m速度降温至-20℃
步骤6：样品温度以1.0℃/m速度降温至-80℃
步骤7：结束
实施例3 CAR-T1复苏后细胞活率与增殖检测
取实施例2用CB BZ1冻存液冻存的CAR-T1细胞在冻存1月后在37℃水浴复苏，复苏后分别室温放置0h，1h，2h，3h入培养瓶培养，并分组测试复苏过程中包含与不包含离心洗涤步骤对细胞活率与增殖的影响，利用VICELL计数仪计数及测定细胞活率，并对细胞进行培养，绘制细胞增殖曲线，结果如图1A-D(包括离心步骤)所示和图2A-D(不包括离心步骤)所示，其中，图1A-D显示10天内增殖数据如表2所示，图2A-D显示10天内增殖数据如表3所示。类似地，取实施例2冻存液CB BZ3冻存的CAR-T1细胞重复上述试验，结果如表4和表5所示。
表2 CAR-T1细胞复苏时经离心洗涤时细胞增殖情况(CB BZ1)
从图1A-D和表2总可以看出，当复苏步骤中包括了离心洗涤步骤时，解冻后室温放置0-3小时，冻存液CB BZ1冻存的CAR-T1细胞的CAR-T1细胞增殖水平高于冻存液标准和冻存液CNKym冻存，其中，与冻存液CNKym相比，解冻后室温放置0-3小时，不仅CB BZ1冻存液冻存的CAR-T1细胞的细胞增殖水平不断升高，而且细胞增殖速度也在不断升高，在3h时，CBBZ1冻存液冻存的CAR-T1细胞的细胞增殖水平为CNKym冻存液的1.68倍，可以看出，CB BZ1冻存液对细胞的冻存保护作用明显优于冻存液CNKym。
表3 CAR-T1细胞复苏时不经离心洗涤时细胞增殖情况(CB BZ1)
图2A-D和表3中可以看出，当复苏步骤中不包括离心洗涤步骤时，CB BZ1冻存液冻存的CAR-T1细胞的CAR-T1细胞增殖水平高于冻存液标准和冻存液CNKym冻存。
表4 CAR-T1细胞复苏时经离心洗涤时细胞增殖情况(CB BZ3)
表5 CAR-T1细胞复苏时不经离心洗涤时细胞增殖情况(CB BZ3)
类似地，CB BZ3冻存液冻存的CAR-T1细胞的增殖水平从表4和表5中可以看出。当复苏步骤中包括离心洗涤步骤时，如表4所示，解冻后室温放置0-3小时后到解冻后培养至第10天时CAR-T1细胞的增殖水平均明显超过了另外两种对照冻存液冻存的CAR-T1细胞。
当复苏步骤中不包括离心洗涤步骤时结果如表5所示，与表4相同，用CB BZ3冻存的CAR-T1细胞解冻后放置0-3小时的细胞到解冻后培养至第10天时细胞的增殖水平均明显超过了另外两种对照冻存液冻存的CAR-T2细胞。
实施例4 CAR-T1复苏后细胞阳性率检测
取实施例3用CB BZ1和CB BZ3冻存并复苏后的各组CAR-T1细胞，按Antitumoractivity of EGFR-specific CART cells against non-small-cell lung cancer cellsin vitro and in mice，Li et al.Cell Death and Disease(2018)9:177一文中公开的方法利用流式细胞仪检测各组冻存液冻存的CAR-T1细胞复苏后的阳性率并绘制曲线，结果如图3A-D和图4A-D所示。
图3A-D显示，当复苏步骤中包括了离心洗涤步骤时，CB BZ1冻存液冻存的CAR-T1细胞解冻后室温放置0小时、1小时、2小时，各组冻存液冻存的CAR-T1细胞在增殖到第10天时阳性率均达到100％，放置3小时时，各组冻存液冻存的CAR-T1细胞在增殖到第3天时阳性率就均已达到100％。图4A-D显示，当复苏步骤中不包括离心洗涤步骤时，解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时后，细胞阳性率的结果与图3A-3D相似，最终均达到了100％，这说明本发明冻存液CB BZ1不影响CAR-T细胞复苏后的阳性率。CB BZ3冻存液冻存的细胞结果于此接近，在3小时后也都达到了100％的阳性率。
实施例5 CAR-T2复苏后细胞活率与增殖检测
取实施例2用CB BZ2冻存的各组CAR-T2细胞在冻存1月后在37℃水浴复苏，复苏后分别室温放置0h，1h，2h，3h入培养瓶培养，并分组测试复苏过程中包含与不包含离心洗涤步骤对细胞活率与增殖的影响，利用VICELL计数仪计数及测定细胞活率，并对细胞进行培养，绘制细胞增殖曲线，结果如图5A-D和图6A-D所示，图5A-D显示10天内增殖数据如表6所示，图6A-D显示10天内增殖数据如表7所示。类似地，取实施例2用CB BZ4冻存液冻存的CAR-T2细胞重复上述试验，结果如表8和表9所示。
表6 CAR-T2细胞复苏时经离心洗涤后细胞增殖情况(CB BZ2)
表7 CAR-T2细胞复苏复苏时不经离心洗涤后细胞增殖情况(CB BZ2)
表8 CAR-T2细胞复苏时经离心洗涤后细胞增殖情况(CB BZ4)
表9 CAR-T2细胞复苏复苏时不经离心洗涤后细胞增殖情况(CB BZ4)
图5A-D、图6A-D、表6、表7中可以看出，当复苏步骤中无论包括离心洗涤步骤还是不包括离心步骤时，解冻后室温放置0-3小时，CB BZ2冻存液冻存的CAR-T2细胞的CAR-T2细胞增殖水平高于冻存液标准和冻存液CNKym冻存，其中，与冻存液CNKym相比，解冻后室温放置0-3小时，不仅CB BZ2冻存液冻存的CAR-T2细胞的细胞增殖水平不断升高，而且细胞增殖速度也在不断升高。在3h时，对包括离心洗涤步骤的复苏过程中，CB BZ2冻存液冻存的CAR-T2细胞的细胞增殖水平为CNKym冻存液的2.49倍，对不包括离心洗涤步骤的复苏过程中，CBBZ2冻存液冻存的CAR-T2细胞的细胞增殖水平为CNKym冻存液的2.51倍，可以看出，CB BZ2冻存液对细胞的冻存保护作用明显优于冻存液CNKym。
类似地，从表8和表9中可以看出，当复苏步骤中无论包括离心洗涤步骤还是不包括离心步骤时，解冻后室温放置0-3小时，CB BZ4冻存液冻存的CAR-T2细胞的CAR-T2细胞增殖水平高于冻存液标准和冻存液CNKym冻存，从数据中可以看出可以看出，CB BZ4冻存液对细胞的冻存保护作用明显优于冻存液CNKym。
实施例6 CAR-T2复苏后细胞阳性率检测
取实施例3复苏后的各组CAR-T2细胞，按Antitumor activity of EGFR-specificCART cells against non-small-cell lung cancer cells in vitro and in mice，Liet al.Cell Death and Disease(2018)9:177一文中公开的方法利用流式细胞仪检测各组冻存液冻存的CAR-T2细胞复苏后的阳性率并绘制曲线，结果如图7A-D和图8A-D所示。
图7A-D显示，当复苏步骤中包括了离心洗涤步骤时，解冻后室温放置0小时、1小时、2小时，3小时时，各组冻存液冻存的CAR-T2细胞在增殖到第10天时阳性率就均已达到100％。图8A-D显示，当复苏步骤中不包括离心洗涤步骤时，解冻后室温放置0小时、1小时、2小时和3小时后细胞阳性率在第10天最终也都达到了100％。这说明本发明冻存液CB BZ2不影响CAR-T2细胞复苏后的阳性率。CB BZ4冻存液冻存的细胞结果于此接近，在3小时后也都达到了100％的阳性率。
总结
本发明提供的免疫效应细胞冻存液具有以下技术上的优势：1)冻存液标准中含有FBS(胎牛血清)，血清中细胞因子等物质引起的副作导致冻存复苏增殖后的CAR细胞难以回输到人体内，而本发明的细胞冻存液CB BZ1-4不含有血清，CB BZ1-4冻存后的细胞经复苏后能够回输到人体体内，从而避免血清中细胞因子引起副作用的风险，且CB BZ1-4与冻存液CNKym相比，人血白蛋白和DMSO含量降低能够明显提高细胞回输对人体的安全性和生物相容性；2)能够较长时间地冻存免疫效应细胞如CAR-T细胞，复苏后免疫效应细胞增殖水平较高；3)复苏后可可不经过离心洗涤直接进行回输，简化了操作流程，有益于免疫效应细胞在实际治疗中的应用；4)用本发明冻存液冻存的CAR-T细胞复苏后的细胞的阳性率没有影响，仍然能够达到100％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括以下浓度的组分：
3.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的右旋糖酐选自下组：右旋糖酐-40、右旋糖酐-70，或其组合。
4.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液还包括维生素。
5.如权利要求4所述的细胞冻存液，其特征在于，所述维生素的浓度为1-20mg/ml，较佳地1-15mg/ml、更佳地5-10mg/ml。
6.一种制备如权利要求1所述的细胞冻存液的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
将如权利要求1所述的组分进行混合，得到所述细胞冻存液。
7.一种如权利要求1-5任一项所述细胞冻存液的用途，其特征在于，用于制备免疫效应细胞悬液。
8.一种细胞混合物，其特征在于，所述细胞混合物包括以下组分：
细胞，和
如权利要求1-5任一项所述的细胞冻存液。
9.一种细胞的冻存方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如权利要求1-5任一项所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞混合物；
(ii)将步骤(i)得到的细胞混合物降温后，低温保存。
10.一种试剂盒，所述的试剂盒用于细胞冻存，其特征在于，所述的试剂盒中包括如权利要求1-5任一所述的细胞冻存液。
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