CN107912419A - 一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜8‑15%、聚乙二醇6‑10%、人血白蛋白5‑10%,余量为勃脉力A,还包括海藻糖15‑30mg/ml、羟乙基淀粉15‑20mg/ml、β‑葡聚糖10‑20mg/ml、葡萄糖50‑100mg/ml和维生素C 1‑5mg/ml。冻存方法包括:配制冻存液,提取人外周血单个核细胞,然后重悬细胞,再加入冻存液置于‑80℃冻存12‑14h,然后再转入液氮中保存。采用该冻存液保存人外周血单个核细胞时,其细胞存活率高,细胞活性较强,复苏后细胞扩增周期短。
Description
技术领域
本发明属于细胞冻存液技术领域,具体涉及一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),指外周血中具有单个核的细胞,包含淋巴细胞,单核细胞(monocyte)、树突状细胞和造血干细胞等。PBMC是制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的种子细胞,也是诱导生成特定淋巴细胞的种子细胞。在实际临床使用中,通常会在患者健康时提取人外周血单个核细胞进行冻存,在需要时再对其进行诱导扩增,因此冻存前后人外周血单个核细胞的质量和数量直接关系到诱导CIK细胞的周期和细胞质量,这就要求在人外周血单个核细胞冻存的过程中,将细胞的损伤降到最低,使细胞在复苏后有较高的活率,复苏后细胞形态规则,扩增周期短。
但现有的人外周血单个核细胞的冻存液效果不佳,采用该冻存液保存人外周血单个核细胞时,其细胞存活率低,细胞活性较弱,复苏后细胞扩增周期长。
发明内容
针对现有技术中的上述不足,本发明提供了一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法,可有效解决采用现有的冻存液保存人外周血单个核细胞时,其存在细胞存活率低,细胞活性较弱,复苏后细胞扩增周期长的问题。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜8-15%、聚乙二醇6-10%、人血白蛋白5-10%,余量为勃脉力A,还包括海藻糖15-30mg/ml、羟乙基淀粉15-20mg/ml、β-葡聚糖10-20mg/ml、葡萄糖50-100mg/ml和维生素C 1-5mg/ml。
进一步地,一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜12%、聚乙二醇8%、人血白蛋白7%,余量为勃脉力A,还包括海藻糖25mg/ml、羟乙基淀粉18mg/ml、β-葡聚糖15mg/ml、葡萄糖50mg/ml和维生素C 3mg/ml。
一种人外周血单个核细胞的保存方法,包括以下步骤:
(1)按上述配方配制人外周血单个核细胞的冻存液;
(2)采集新鲜的抗凝人外周血进行离心,提取外周血单个核细胞,然后采用磷酸盐清洗;
(3)用勃脉力A重悬清洗后的外周血单个核细胞,得细胞悬液,然后向细胞悬液中加入1-1.2倍体积的冻存液,分装于细胞冻存管中;
(4)将冻存管置于-80℃冻存12-14h,然后再转入液氮中保存。
进一步地,步骤(3)中冻存液的配制过程为:将二甲基亚砜、聚乙二醇、人血白蛋白和勃脉力A混匀,然后再加入其余物质,使其达到各自终浓度;其中勃脉力A为中国药监局批准的用于临床的复方电解质注射液,其组分为:每1L包含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g和氯化镁0.30g。
进一步地,步骤(3)中用勃脉力A重悬细胞以使得人外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准。
进一步地,步骤(3)中冻存管中,外周血单个核细胞的密度为0.5-1.2×107个/ml。
本发明提供的一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法,具有以下有益效果:
(1)二甲基亚砜易穿透细胞,在冷冻保存过程中可使冰点下降,减少细胞内形成冰晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤;聚乙二醇水溶性好,熔点低,可有效脱除细胞内及细胞间隙中的流动水分,其低熔点也保证了细胞外溶液在降温过程中不形成冰晶,从而降低了对细胞的损伤;海藻糖富含羟基,是良好的玻璃化试剂,可以与细胞膜形成玻璃态基质,减少冰晶形成几率,从而有效避免冰晶产生的伤害;羟乙基淀粉可以促进细胞内及细胞间隙中的流动水分的排出,减少细胞内冰晶的含量。
二甲基亚砜、聚乙二醇、海藻糖和羟乙基淀粉在减少冰晶产生方面具有促进和稳定作用。
(2)在低温冷冻过程中,蛋白质会因氧化作用而导致结构被破坏,而维生素C具有抗氧化作用,可以防止蛋白质发生变化,有效保护了人血白蛋白的功效。
(3)勃脉力A为用于临床的复方电解质注射液,其可以维持细胞电解液平衡,与二甲基亚砜、聚乙二醇、海藻糖和羟乙基淀粉协同减少细胞内冰晶含量。
(4)冻存液中还含有葡萄糖,可为细胞提供一定的营养成分。
(5)本发明提供的冻存液中不含动物血清、人血清、细胞培养基等,可有效避免传播潜在病原体的风险,提高了细胞冻存的安全性,又确保了人外周血单个核细胞的冻存效果;同时,采用本发明提供的冻存液冻存的人外周血单个核细胞复苏后,安全无毒,并且具有较高的存活率和较强的细胞活性,CIK细胞诱导扩增的周期也较短,还可以直接回输人体,且并未引起不适症状。
具体实施方式
实施例1
一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜8%、聚乙二醇6%、人血白蛋白5%、勃脉力A 81%,还包括海藻糖15mg/ml、羟乙基淀粉15mg/ml、β-葡聚糖10mg/ml、葡萄糖50mg/ml和维生素C 1mg/ml。
一种人外周血单个核细胞的保存方法,包括以下步骤:
(1)按上述配方配制人外周血单个核细胞的冻存液:
将二甲基亚砜、聚乙二醇、人血白蛋白和勃脉力A混匀,然后再加入海藻糖、羟乙基淀粉、β-葡聚糖、葡萄糖和维生素C,使其各成分终浓度为15mg/ml、15mg/ml、10mg/ml、50mg/ml和1mg/ml;
(2)采集新鲜的抗凝人外周血进行离心,提取外周血单个核细胞,然后采用磷酸盐清洗;
(3)用勃脉力A重悬清洗后的外周血单个核细胞以使得人外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准,得到细胞悬液,然后向细胞悬液中加入等体积的冻存液,分装于细胞冻存管中,该冻存管中外周血单个核细胞的密度为0.5×107个/ml;
(4)将冻存管置于-80℃冻存12h,然后再转入液氮中保存。
实施例2
一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜15%、聚乙二醇10%、人血白蛋白10%、勃脉力A 65%,还包括海藻糖30mg/ml、羟乙基淀粉20mg/ml、β-葡聚糖20mg/ml、葡萄糖100mg/ml和维生素C 5mg/ml。
一种人外周血单个核细胞的保存方法,包括以下步骤:
(1)按上述配方配制人外周血单个核细胞的冻存液:
将二甲基亚砜、聚乙二醇、人血白蛋白和勃脉力A混匀,然后再加入海藻糖、羟乙基淀粉、β-葡聚糖、葡萄糖和维生素C,使其各成分终浓度为30mg/ml、20mg/ml、20mg/ml、100mg/ml和5mg/ml;
(2)采集新鲜的抗凝人外周血进行离心,提取外周血单个核细胞,然后采用磷酸盐清洗;
(3)用勃脉力A重悬清洗后的外周血单个核细胞以使得人外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准,得到细胞悬液,然后向细胞悬液中加入等体积的冻存液,分装于细胞冻存管中,该冻存管中外周血单个核细胞的密度为0.5×107个/ml;
(4)将冻存管置于-80℃冻存12h,然后再转入液氮中保存。
实施例3
一种人外周血单个核细胞的冻存液,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜12%、聚乙二醇8%、人血白蛋白7%、勃脉力A 73%,还包括海藻糖25mg/ml、羟乙基淀粉18mg/ml、β-葡聚糖15mg/ml、葡萄糖50mg/ml和维生素C 3mg/ml。
一种人外周血单个核细胞的保存方法,包括以下步骤:
(1)按上述配方配制人外周血单个核细胞的冻存液:
将二甲基亚砜、聚乙二醇、人血白蛋白和勃脉力A混匀,然后再加入海藻糖、羟乙基淀粉、β-葡聚糖、葡萄糖和维生素C,使其各成分终浓度为25mg/ml、18mg/ml、15mg/ml、50mg/ml和3mg/ml;
(2)采集新鲜的抗凝人外周血进行离心,提取外周血单个核细胞,然后采用磷酸盐清洗;
(3)用勃脉力A重悬清洗后的外周血单个核细胞以使得人外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准,得到细胞悬液,然后向细胞悬液中加入等体积的冻存液,分装于细胞冻存管中,该冻存管中外周血单个核细胞的密度为0.5×107个/ml;
(4)将冻存管置于-80℃冻存12h,然后再转入液氮中保存。
对比例1
对比例1与实施例3不同之处为:配方中的聚乙二醇用生理盐酸代替,勃脉力A用提取外周血单个核细胞时人外周血中的血浆代替,其余与对比例3相同;保存方法也与实施例3相同。
对比例2
对比例2与实施例3不同之处为:配方中没有海藻糖、羟乙基淀粉、β-葡聚糖、葡萄糖和维生素C,其余与实施例3相同;保存方法也与实施例3相同。
实验例
1、检测细胞复苏率和细胞活率
将实施例1-3和对比例1-2提供的冻存液在对应的冻存条件下冻存一个月,将冻存的细胞在37℃水温下复苏,待完全熔化后,取适量悬液使用台盼蓝染色计数法计算复苏率和细胞活率,结果见表1。
表1细胞复苏率和细胞活率结果
由表1可知,本发明提供的冻存液配方结合相应的冻存程序,可有效提高细胞复苏率和细胞活率,而对比例1和2的细胞复苏率和细胞活率明显低于实施例1-3,尤其是实施例3效果最佳。
2、细胞诱导培养CIK细胞的生长情况
将实施例1-3和对比例1-2中剩余的细胞悬液加入磷酸盐缓冲液离心,清洗,弃其上层清夜,加入细胞因子诱导培养CIK细胞,每天取少量细胞悬液观察细胞形态,并测定其细胞数量,结果见表2。
表2细胞诱导培养CIK细胞的生长情况
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
1天 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
5天 | 3.30±0.21 | 3.36±0.29 | 3.48±0.32 | 2.27±0.34 | 2.21±0.41 |
10天 | 35.39±3.98 | 37.91±4.75 | 43.56±4.61 | 25.83±4.77 | 24.88±4.69 |
15天 | 76.21±7.86 | 80.12±8.15 | 88.75±8.48 | 43.12±8.76 | 40.23±9.32 |
表2为诱导培养CIK细胞1天、5天、10天和15天时记录的细胞数量(×107个/ml),由表2可知,实施例1-3的冻存液及结合相应的冻存方法冻存后的细胞进行诱导培养CIK细胞过程中,在相同的培养时间,实施例1-3培养的细胞数量明显高于对比例1和22,说明采用本发明提供的冻存液及相应的冻存方法来冻存细胞,然后对其诱导培养CIK细胞的周期明显缩短。
3、诱导得到的CIK细胞的检测
用流式细胞仪检测实施例1-3和对比例1-2收获的成熟CIK细胞中CD3+和CD56+T细胞的百分比,所得比值分别为25.36%、26.12%、26.89、17.12%和16.78%。
4、CIK细胞回输结果观测
选取100名受试者回输实施例1-3所得的成熟CIK细胞,回输后观察24h,未出现不良反应。
Claims (6)
1.一种人外周血单个核细胞的冻存液,其特征在于,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜8-15%、聚乙二醇6-10%、人血白蛋白5-10%,余量为勃脉力A,还包括海藻糖15-30mg/ml、羟乙基淀粉15-20mg/ml、β-葡聚糖10-20mg/ml、葡萄糖50-100mg/ml和维生素C 1-5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的人外周血单个核细胞的冻存液,其特征在于,按体积分数计,包括以下组分:二甲基亚砜12%、聚乙二醇8%、人血白蛋白7%,余量为勃脉力A,还包括海藻糖25mg/ml、羟乙基淀粉18mg/ml、β-葡聚糖15mg/ml、葡萄糖50mg/ml和维生素C 3mg/ml。
3.一种人外周血单个核细胞的保存方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)按权利要求1或2所述配方配制人外周血单个核细胞的冻存液;
(2)采集新鲜的抗凝人外周血进行离心,提取外周血单个核细胞,然后采用磷酸盐清洗;
(3)用勃脉力A重悬清洗后的外周血单个核细胞,得细胞悬液,然后向细胞悬液中加入1-1.2倍体积的冻存液,分装于细胞冻存管中;
(4)将冻存管置于-80℃冻存12-14h,然后再转入液氮中保存。
4.根据权利要求3所述的人外周血单个核细胞的保存方法,其特征在于,步骤(3)中冻存液的配制过程为:将二甲基亚砜、聚乙二醇、人血白蛋白和勃脉力A混匀,然后再加入其余物质,使其达到各自终浓度。
5.根据权利要求3所述的人外周血单个核细胞的保存方法,其特征在于,步骤(3)中用勃脉力A重悬细胞以使得人外周血单个核细胞的浓度为最终冻存液中外周血单个核细胞浓度的两倍为准。
6.根据权利要求3所述的人外周血单个核细胞的保存方法,其特征在于,步骤(3)冻存管中,外周血单个核细胞的密度为0.5-1.2×107个/ml。
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