CN105248413B

CN105248413B - 一种cik细胞冻存液

Info

Publication number: CN105248413B
Application number: CN201510766997.6A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王飞; 王一飞; 葛啸虎; 曾维杰
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: CN105248413A

Abstract

本发明涉及一种CIK细胞冻存液，包含DMSO、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白和FBS。所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：DMSO 5‑10％，葡萄籽提取物1‑2mg/ml，棉籽糖5‑10mg/ml，人血白蛋白10‑20％，FBS40‑70％，余量为PBS。本发明CIK细胞冻存液中添加了棉籽糖、葡萄籽提取物和人血白蛋白，有助于延长细胞的存活期，保护细胞结构组织不被自由基破坏。本发明的冻存液能够很好的保持细胞活力，减少细胞表面抗原的丢失，复苏后细胞还具有良好的增殖能力和杀伤活性。

Description

一种CIK细胞冻存液

技术领域

本发明涉及细胞冻存领域，尤其涉及一种CIK细胞冻存液。

背景技术

CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)，是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。CIK细胞杀伤肿瘤细胞是非MHC限制的，即不受癌症组织类型的限制，能在人体内广泛部位自动识别并杀伤肿瘤细胞。正常人外周血中CIK细胞数量仅占淋巴细胞数量的1-5％，其数量减少和功能减弱与肿瘤的发生、发展密切相关。

如今，CIK细胞治疗被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞的治疗功能具有以下特点：选择性地杀伤肿瘤细胞、体外增殖快、杀伤活性高、抗瘤谱广、副作用小。用CIK细胞治疗可以同时结合化疗、放疗，有提高疗效、减轻化疗和放疗的副作用。对某些不适合手术、放疗和对化疗耐受的中晚期肿瘤或年老体弱肿瘤患者，使用CIK细胞治疗可以起到改善生活质量、延长生命的作用。

然而有些时候，当在进行CIK细胞治疗或保健的过程中，患者因为各种原因而需要推迟一段时间进行回输，但是细胞已经在体外培养扩增一段时间了，这时候就需要把细胞暂时甚至长期冻存起来了。而复苏后细胞活力的高低、质量以及复苏后细胞的生长质量直接影响后续的治疗和保健质量。

细胞冻存液是直接影响冻存后细胞活力、质量等的重要因素。现有常规的CIK细胞冻存液有两种，一种是由DMSO(二甲基亚砜)、FBS(胎牛血清)和基础培养基按体积比1:2:7配制而成，另一种是由DMSO与FBS按体积比1:9配制而成。使用上述冻存液冻存的CIK细胞复苏后活率低，而且表面抗原丢失严重，影响治疗效果；此外，上述冻存液中FBS用量大，成本偏高。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种CIK细胞冻存液。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种CIK细胞冻存液，包含DMSO、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白和FBS。

优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量及浓度为：

优选地，将葡萄籽提取物、棉籽糖用PBS分别配制成葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液，使用葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液配制CIK细胞冻存液。

优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：

进一步优选地，所述葡萄籽提取物溶液的浓度为20mg/ml，所述棉籽糖溶液的浓度为50mg/ml。

优选地，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：

棉籽糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，在大部分的植物中都存在，它也被称为蜜三糖、棉子糖等。棉籽糖可以延长细胞的存活期。葡萄籽提取物是从葡萄籽中提取的一种人体内不能合成的新型高效天然抗氧化剂物质。它是目前自然界中发现的抗氧化、清除自由基能力最强的物质，其抗氧化活性为维素E的50倍、维生素C的20倍。在本发明CIK细胞冻存液中葡萄籽提取物主要起抗氧化作用，可以提高细胞免疫功能。

DMSO可以防止细胞破裂，降低细胞内水的熔点，防止形成晶体。人血白蛋白占血浆胶体渗透压的80％，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。在本发明中人血白蛋白可以维持细胞内外渗透压平衡。FBS是细胞培养基和冻存液的常用成分，可以为细胞提供营养成分。

与现有技术相比，本发明CIK细胞冻存液具有如下有益效果：

针对常规细胞冻存液存在的缺陷，本发明改进细胞冻存液的配方，添加了棉籽糖、葡萄籽提取物和人血白蛋白，棉籽糖可以延长细胞的存活期，葡萄籽提取物具有抗氧化作用，能够保护结构组织不被自由基破坏，进而起到保护细胞的作用，人血白蛋白可以维持细胞内外的渗透压平衡，改进后的细胞冻存液更适合CIK细胞的冻存。

本发明CIK细胞冻存液能够很好的保持细胞活力，减少细胞表面抗原的丢失；使用本发明冻存的CIK细胞在复苏后还具有良好的增殖能力和杀伤活性。

附图说明

图1为复苏后CIK细胞增殖曲线图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法第都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

本发明CIK细胞冻存液包含DMSO(购自上海前尘生物科技有限公司)、葡萄籽提取物(购自湖北众诚科技有限公司)、棉籽糖(购自郑州裕和食品添加剂有限公司)、人血白蛋白(购自郑州莱士血液制品有限公司)和FBS(购自上海素尔生物科技有限公司)。

为了便于下文中本发明CIK细胞冻存液的描述和配制，在各实施例和对比例中，棉籽糖和葡萄籽提取物均用PBS配制成溶液后再用于配制的本发明CIK细胞冻存液。葡萄籽提取物溶液的浓度为20mg/ml，其配制方法为：称取0.5g葡萄籽提取物溶于25ml PBS中，搅拌至完全溶解，放4℃冰箱保存备用。棉籽糖溶液的浓度为50mg/ml，其配制方法为：称取1g棉籽糖溶于20ml PBS中，搅拌至完全溶解，放4℃冰箱保存备用。

实施例1

把0.5ml DMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、1ml棉籽糖溶液以及2ml人血白蛋白缓慢加入5.5ml FBS中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5％、10％、10％、20％和55％，葡萄籽提取物的含量为2mg/ml，棉籽糖的含量为5mg/ml。

实施例2

把1ml DMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、2ml棉籽糖溶液以及1.5ml人血白蛋白缓慢加入4.5ml FBS中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为10％、10％、20％、15％和45％，葡萄籽提取物的含量为2mg/ml，棉籽糖的含量为10mg/ml。

实施例3

把1ml DMSO、0.5ml葡萄籽提取物溶液、1.5ml棉籽糖溶液以及1ml人血白蛋白缓慢加入6ml FBS中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为10％、5％、15％、10％和60％，葡萄籽提取物的含量为1mg/ml，棉籽糖的含量为7.5mg/ml。

实施例4

把0.5ml DMSO、0.5ml葡萄籽提取物溶液、1ml棉籽糖溶液以及1ml人血白蛋白缓慢加入7ml FBS中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5％、5％、10％、10％和70％，葡萄籽提取物的含量为1mg/ml，棉籽糖的含量为5mg/ml。

实施例5

把0.5ml DMSO、1ml葡萄籽提取物溶液、2ml棉籽糖溶液以及1.5ml人血白蛋白缓慢加入5ml FBS中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本实施例冻存液中DMSO、葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液、人血白蛋白、FBS的体积百分含量分别为5％、10％、20％、15％和50％，葡萄籽提取物的含量为2mg/ml，棉籽糖的含量为10mg/ml。

对比例1

把1ml DMSO和2mlFBS加入7ml RPMI1640培养基中，混合均匀后放入4℃冰箱保存备用。本对比例冻存液中DMSO、FBS和RPMI1640培养基体积百分含量分别为10％、20％和70％。

对比例2

把1mlDMSO加入9mlFBS中混合均匀，放入4℃冰箱保存备用。本对比例冻存液中DMSO和FBS的体积百分含量分别为10％和90％。

对比例3

本对比例中细胞冻存液，含有下述重量体积百分数的下述组分：棉子糖6％、DMSO10％、维生素C 0.2％、甲基纤维素4000CP 5％、羟乙基淀粉5％、谷氨酰胺1％、丙酮酸钠0.2％，新生牛血清74.6％。按常规方法配制，放入4℃冰箱保存备用。

对比例4

本对比例中冻存液含有下述重量体积百分数的下述组分：棉子糖20％、DMSO10％、维生素C 10％、FBS60％。按常规方法配制，放入4℃冰箱保存备用。

效果实施例1、冻存CIK细胞的复苏活性检测

本发明冻存液可以用于冻存任何方法诱导的CIK细胞。本实施例中CIK细胞具体通过以下方法制备：

1)将20ml外周血转移至离心管中，用生理盐水按体积比1:1进行稀释，形成血液稀释液。

2)在新的离心管中加入淋巴细胞分离液，按淋巴细胞分离液与血液稀释液的体积比为1:2的比例将血液稀释液缓慢添加至淋巴细胞分离液层上方，形成明显的分界线。

3)在800g、离心升降速为0的条件下离心30min，离心结束后，离心管内分为四层，自下而上分别是红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、PBMC层和血浆层。用巴氏吸管小心抽取PBMC层至新的离心管。

4)往含PBMC层的离心管中添加RPMI1640培养基以清洗细胞，在300g条件下离心5min，弃上清。PBMC用X-VIVO-15培养基接种于培养瓶中，并添加1％培养基体积的IFN-γ溶液，其中IFN-γ溶液的浓度为10000～50000U/ml，本发明所使用的IFN-γ溶液的浓度为20000U/ml。次日添加1％培养基体积的IL-2溶液。其中IL-2溶液的浓度为20000～100000U/ml，本发明所使用的IL-2溶液的浓度为50000U/ml。接种后将培养瓶放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中进行培养，每2～3天抽取细胞进行计数并补充适量的培养基和IL-2，培养两周后收集CIK细胞。

检测CIK细胞的活力后，使用上述各实施例、对比例中的冻存液冻存CIK细胞，具体方法为：

把1×10⁸个CIK细胞分装至9支15ml离心管中，400g离心5min，离心结束后弃上清，加入10ml生理盐水清洗细胞，400g离心5min，弃上清。把预先预冷的各实施例、对比例中冻存液各加入一支离心管中，轻轻吹打重悬细胞，各分装至3支冻存管中，每管1ml，每管冻存密度为1～10×10⁶cells/ml，本发明冻存密度优选为5×10⁶cells/ml。做好相应标记，放入冻存盒中，转移至-80℃冰箱中保存一周，最后转入液氮罐中保存。

在液氮罐中冻存3个月后，同时复苏上述各冻存管，用X-VIVO-15培养基清洗，弃上清。分别用5ml X-VIVO-15培养基进行重悬，取20μL细胞悬液，用0.4％台盼蓝按体积比台盼蓝：细胞悬液＝1:9进行稀释，用countstar计数仪进行细胞计数，计算细胞活力。细胞活力结果如下表1所示。

表1、冻存前后CIK细胞活力对比表

组别	冻存前	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						细胞活力	95.6％	89.2％	92.7％	90.8％	90.3％
组别	实施例5	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
						细胞活力	91.2％	72.5％	84.7％	87.3％	86.5％

由表1可知，本发明CIK细胞冻存液冻存的CIK，在复苏后细胞活力平均在90％以上，高于使用对比例中细胞冻存液冻存的CIK细胞复苏后的细胞活力，后者的细胞活力仅为72.5-87.3％。因此，本发明CIK冻存液能够使CIK细胞保持一个较高的活力水平。

效果实施例2、冻存CIK细胞的表面抗原表达量检测

冻存前先检测CIK细胞的表面抗原表达量。按照效果实施例1所述的方法制备、冻存CIK细胞。根据复苏后的细胞计数结果，取复苏后的CIK细胞200g离心5min，去除死细胞，使每组保留1×10⁶个活细胞，平均分至两个EP管中，其中一管作为对照，1000rpm离心5min，弃上清。然后加入800μl染色缓冲液重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。每管加入200μl染色缓冲液进行重悬，样本组分别加入2μl CD3和CD56抗体。避光孵育20min。加入500μl染色缓冲液重悬，1500rpm离心5min洗掉剩余抗体。弃上清，加入400μl上样缓冲液，过200目筛，上机检测。CD3⁺CD56⁺表达结果如下表2。

表2、冻存前后CIK细胞的CD3⁺CD56⁺表达对比表

组别	冻存前	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						表达量	32.3％	27.8％	29.6％	28.4％	27.2％
组别	实施例5	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
						表达量	28.7％	22.9％	24.1％	26.4％	25.6％

由表2可知，使用本发明CIK冻存液冻存的CIK细胞，复苏后表面抗原丢失少，CD3⁺CD56⁺表达量高，平均在28％以上；使用对比例冻存液冻存的CIK细胞，复苏后表面抗原丢失多，CD3⁺CD56⁺表达量低，仅为22.9-26.4％。因此，本发明冻存液能够减少细胞表面抗原丢失。

效果实施例3、冻存CIK细胞的复苏增殖情况检测

按照效果实施例1所述的方法制备、冻存CIK细胞。根据复苏后细胞计数结果，用X-VIVO-15培养基按1×10⁶cells/ml的密度将复苏后的CIK细胞接种于培养瓶中，并添加1％培养基体积的IL-2溶液。其中IL-2溶液的浓度为20000～100000U/ml，本发明所使用的IL-2溶液的浓度为50000U/ml。接种后将培养瓶放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中进行培养，每2～3天抽取细胞进行计数并补充适量的培养基和IL-2，培养一周。增殖曲线如图1所示，增值倍数结果如表3所示。

表3、增值倍数对比表

组别	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						增值倍数	6.29	7.69	6.48	6.32	6.58
组别	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
						增值倍数	2.25	2.5	3.4	2.7

由表3和图1所示，使用本发明CIK细胞冻存液冻存的CIK细胞，复苏后增殖速度快，增殖倍数更高；使用对比例细胞冻存液冻存的CIK细胞，复苏后增殖速度慢，增殖倍数低。因此，本发明CIK细胞冻存液能够很好的保持细胞的增殖能力。

效果实施例4、冻存前后CIK细胞的杀伤活性检测

冻存前先检测CIK细胞对K562细胞的杀伤效果。按照效果实施例1所述的方法制备、冻存CIK细胞。再检测复苏后的CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。本实施例中杀伤活性的检测采用LDH(乳酸脱氢酶)法。结果如表4所示。

表4冻存前后CIK细胞的杀伤活性对比表

效靶比＝40:1	冻存前	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						杀伤活性	76.5％	70.2％	73.3％	71.4％	68.8％
组别	实施例5	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
						杀伤活性	70.8％	58.4％	60.2％	62.5％	61.6％

由表4可知，使用本发明CIK细胞冻存液冻存的CIK细胞，复苏后杀伤活性高，在效靶比40:1时，杀伤活性平均在70％以上；使用对比例细胞冻存液冻存的CIK细胞，复苏后杀伤活性低，在效靶比40:1时，仅为58.4-62.5％。因此，本发明CIK细胞冻存液能够很好的保持细胞的杀伤活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种CIK细胞冻存液，其特征在于，包含DMSO、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白和FBS；各组分的体积百分含量及浓度为：

2.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，各组分的体积百分含量及浓度为：

3.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，各组分的体积百分含量及浓度为：

4.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，各组分的体积百分含量及浓度为：

5.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，各组分的体积百分含量及浓度为：

6.根据权利要求1-5任一项所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，将葡萄籽提取物、棉籽糖用PBS分别配制成葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液，使用葡萄籽提取物溶液、棉籽糖溶液配制CIK细胞冻存液。

7.根据权利要求6所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：

8.根据权利要求6所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，所述棉籽糖溶液的浓度为50mg/ml，所述葡萄籽提取物溶液的浓度为20mg/ml。

9.根据权利要求8所述的CIK细胞冻存液，其特征在于，所述CIK细胞冻存液中各组分的体积百分含量为：