CN106577635B - 一种维持cik细胞高杀伤力的冻存保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种维持CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，所述冻存保护剂由RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜、环状六肽Cyclo(‑Gly‑Thr‑Phe‑Leu‑Tyr‑Ala‑)组成；RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合；所述环状六肽Cyclo(‑Gly‑Thr‑Phe‑Leu‑Tyr‑Ala‑)的浓度为2‑4μg/ml。本发明冻存保护剂能在保证CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA‑146a低表达所带来的强杀伤力。
Description
技术领域
本发明属于免疫领域，涉及CIK细胞的培养，具体涉及一种维持CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂。
背景技术
申请人于2016年12月22日提交了一件CIK细胞培养的专利申请，该申请公开了miRNA-146a及其抑制剂在CIK细胞培养方面的应用，miRNA-146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。该申请的说明书公开了miRNA-146a下调表达的CIK细胞比miRNA-146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力，且差异非常显著。申请人还发现，环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)为miRNA-146a的有效抑制剂。
出于实验需要，研究人员通常需要将细胞进行冻存，以便日后复苏使用。申请人发现，miRNA-146a低表达的CIK细胞在冻存前虽然对白血病细胞的杀伤力非常高，但是，冻存复苏后杀伤力明显下降。这表明，传统的细胞冻存保护剂可能不适用于miRNA-146a低表达CIK细胞的冻存，虽然能维持其复苏率，但是不能维持其对白血病细胞的杀伤力。
传统的细胞冻存保护剂多为基于DMSO的标准冻存液，由培养基、胎牛血清和DMSO组成。申请人在CIK细胞常用冻存保护剂基础上[RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合，可参见文献：冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞内因子表达的影响，郑州大学学报(医学版)2014年1月]进行了优化研究，试图在保证CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持CIK细胞的高杀伤力。
发明内容
本发明旨在克服背景技术中存在的不足，提供一种维持CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，在保证CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持CIK细胞的高杀伤力。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种维持CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，由RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜、环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)组成。
优选地，RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合。
优选地，所述环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)的浓度为2-4μg/ml。
使用上述冻存保护剂冻存CIK细胞的方法：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。
本发明优点：
本发明冻存保护剂能在保证CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA-146a低表达所带来的强杀伤力。
附图说明
图1为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；
图2为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；
图3为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1：冻存对miRNA-146a低表达CIK细胞杀伤力的影响
一、实验材料
miRNA-146a inhibitor和inhibitor negative control由上海吉玛制药技术有限公司提供。肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。其他试剂或仪器均为分子生物学及免疫学常用的试剂或仪器。
二、实验方法
1、效应细胞CIK的分离培养
(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。
(2)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。
2、效应细胞CIK的转染
转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。
(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种CIK细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时细胞汇合度达60％。
(2)用DEPC水稀释miRNA-146a inhibitor或inhibitor negative control(NC)，配制终浓度为20μM的存储液，分装使用。
(3)配制混合液：
miRNA-146a inhibitor或NC混合液：取10μl上述存储液，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液A；lipofectamine2000稀释液：取5μl lipofectamine2000，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液B。
(4)稀释液A和稀释液B室温孵育5分钟后，将二者轻轻混匀，室温孵育20分钟，配制总体积为500μl的稀释液C。
(5)将6孔板内原培养基吸去，PBS冲洗1次后吸去，每孔加入1.5ml opti-MEM。将稀释液C加入每孔，使得每孔液体总体积为2ml，miRNA-146a inhibitor或NC浓度为100nM。
(6)将6孔板放入细胞培养箱培养6小时，吸去含有miRNA-146a inhibitor或NC的培养基，PBS冲洗1次后，加入完全培养基2ml，放入细胞培养箱中继续培养48小时。
3、效应细胞CIK转染后miRNA-146a的表达量(qRT-PCR)
3.1细胞总RNA的提取
(1)吸去6孔板中的培养基，用PBS冲洗细胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus1ml，缓慢吹打细胞，使细胞充分裂解；
(2)将裂解液吸出转入1.5ml EP管中，冰上静置5min；
(3)在EP管中加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀约15秒，冰上静置3min；然后于4℃条件下12000g/min离心15分钟；
(4)离心后吸取EP管中上层水相液体500μl转入新的1.5ml EP管中，加入异丙醇500μl，颠倒混匀，冰上静置10min；然后于4℃条件下12000g/min离心10分钟；
(5)将EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震荡混匀，重悬白色沉淀；然后于4℃条件下7500g/min离心10分钟；
(6)吸去EP管中液体，可见管中沉淀，室温中干燥5分钟后用DEPC水30μl左右溶解沉淀获得总RNA，置于4℃冰箱过夜；
(7)取2μl上述总RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀释的总RNA，测定浓度和纯度；置于-80℃冰箱保存备用。
3.2miRNA-146a逆转录
(1)将总RNA逆转录成cDNA
用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)按照说明书在DEPC处理的200μl EP管中配制如下反应体系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RTprimers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNAsample，1μg；加RNase Free H2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反应产物cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
(2)实时荧光定量PCR
将cDNA稀释3倍，然后混匀并吸取2μl作模板，用逆转录试剂盒按说明书配制如下反应体系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNARTProduct，2μl；Taq DNApolymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH2O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。
miRNA-146a以U6为内参，miRNA-146a和U6的引物由上海吉玛制药技术有限公司提供。
miRNA-146a的上游引物为5’-CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG-3’；
miRNA-146a下游引物为5’-GCTGAAGAACTGAATTTCAGAGGTC-3’；
U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’；
U6下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’
4、CIK的冻存和复苏
将CIK细胞1500r/min离心10min弃上清后，加入冻存保护剂，吸吹均匀，调整至密度为2×106个/mL，分装于冻存管中，标记冻存日期，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置3个月。
分为本发明冻存保护剂组和常规冻存保护剂组，保护剂成分如下：
本发明冻存保护剂组：RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合，并添加3μg/ml环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)；环状六肽在2-4μg/ml均可，过高会造成细胞损伤；
常规冻存保护剂组：RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合。
5、CIK细胞的复苏
将冻存的CIK细胞从-80℃低温冰箱中取出后放入37℃水浴锅内迅速融化，用完全培养基洗1遍，重悬于RPMI1640培养基中。
6、复苏后细胞存活率测定
将复苏细胞用台盼蓝染色后，利用血细胞计数板计数细胞，测定台盼蓝拒染率，并与冷冻前相比较，计算细胞存活率：细胞存活率＝(1-台盼蓝染色细胞数/总细胞数)×100％。
根据效应细胞不同分为如下组别：
B组：本发明冻存保护剂冻存复苏的miRNA-146a低表达CIK细胞；
C组：常规冻存保护剂组冻存复苏的miRNA-146a低表达CIK细胞。
7、冻存前后对白血病细胞杀伤力的测定
分别使用K562/A02，THP-1及HL-60细胞作为靶细胞，使用完全培养基调整细胞浓度为105个/mL，按照效靶5:1将效应细胞及靶细胞加入96孔板中，37℃、5％CO2孵育箱中培养48h。通过MTT检测试剂盒检测细胞活率。
杀伤活性(％)＝[1-(试验孔均值-效应对照孔均值)/靶细胞对照孔均值]×100％。
根据效应细胞不同分为如下组别：
A组：冻存前miRNA-146a低表达CIK细胞；
B组：本发明冻存保护剂组冻存复苏的miRNA-146a低表达CIK细胞；
C组：常规冻存保护剂组冻存复苏的miRNA-146a低表达CIK细胞。
三、实验结果
1、CIK细胞增殖情况和表型分析
从外周血分离获得单个核细胞，通过诱导刺激得到CIK细胞。经过传代培养，使用MTT检测试剂盒分析CIK细胞的增殖活性，从570nm的吸光值结果可以看出，初种细胞后的1-2d，CIK细胞生长缓慢，d3细胞进入快速生长期，6d以后细胞生长速度减缓。提取培养7d后的CIK，通过流式细胞仪检测其表面标志物，CIK细胞表面CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性比率分别为54.66％、53.12％，纯度较高。
2、CIK细胞转染后miRNA-146a表达情况
转染miRNA-146a inhibitor的CIK细胞中的miRNA-146a表达量显著下调，约为不转染inhibitor或negative control的对照组CIK细胞、转染negative control的阴性对照组CIK细胞的0.3倍。各组CIK细胞的活力及增殖行为基本一致，证明miRNA-146a低表达后并不影响CIK细胞的活力和增殖行为。
3、复苏后细胞存活率
各组存活率差异不大，均在80％左右(本发明冻存保护剂78.6％；常规冻存保护剂81.3％)。
4、复苏后对白血病细胞的杀伤力
各组效应细胞对白血病细胞杀伤力的结果如图1-3所示。
结果可以看出，本发明冻存保护剂组CIK细胞对白血病细胞的杀伤力与冻存前基本一致，显著优于常规冻存保护剂组的CIK细胞。
综合上述实验可以看出，本发明提供的冻存保护剂虽然不能进一步提高复苏率，但是能最大限度维持CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA-146a低表达所带来的强杀伤力。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。
Claims (1)
1.一种维持CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，其特征在于：由RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜、环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)组成；其中，RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合，所述环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)的浓度为2-4μg/ml。
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